專利名稱：針對丙型肝炎病毒e1e2 復(fù)合體的抗體、hcv 顆粒的組合物和藥物組合物的制作方法
針對丙型肝炎病毒E1E2復(fù)合體的抗體、HCV顆粒的組合物和藥物組合物本申請為申請?zhí)枮?00480008734. 9，申請日為2004年3月31日的同名申請的分
案申請。本發(fā)明涉及抗HCV的新構(gòu)象(conformational)抗體以及更特別地涉及單克隆抗體。本發(fā)明還涉及易于(liable)被所述抗體識別的顆粒的組合物，以及涉及包含它們的藥物組合物。本發(fā)明還涉及HCV有包膜的亞病毒顆?；蚣兓腍CV有包膜的完整病毒顆粒， 以及制備它們的方法。丙型肝炎病毒(HCV)感染是慢性肝炎和肝硬化的主要原因，并且可導(dǎo)致肝細胞癌。世界范圍內(nèi)約200百萬人慢性感染HCV，這種疾病已經(jīng)作為ー種嚴(yán)重的全球健康問題顯現(xiàn)出來。HCV是ー種有包膜的RNA病毒,屬于黃病毒科的肝炎病毒屬。其基因組是9. 6kb正極性單鏈RNA，具有作為內(nèi)部核糖體進入位點起作用的5’非翻譯區(qū)(UTR)，編碼大約3，000 個氨基酸的多蛋白(polyprotein)的單一可讀框以及3' UTR(Bartenschlager等,2000)。 這種多蛋白在翻譯同時和之后通過宿主細胞肽酶切割產(chǎn)生包括核心蛋白及包膜糖蛋白El 和E2的結(jié)構(gòu)蛋白，以及通過病毒蛋白酶產(chǎn)生非結(jié)構(gòu)蛋白(NS) 2-5B (Bartenschlager等， 2000)。與相關(guān)的正鏈RNA病毒類似，通過負鏈RNA中間體的方式發(fā)生復(fù)制并且由NS蛋白催化，其形成質(zhì)膜附著的復(fù)制酶復(fù)合體?；颊哐獫{樣品中存在的HCV顆粒的水平低以及缺乏支持有效HCV復(fù)制或顆粒裝配的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)妨礙了表征與病毒體相關(guān)的糖蛋白。當(dāng)前關(guān)于HCV包膜糖蛋白的知識是基于利用病毒或非病毒表達載體的細胞培養(yǎng)物瞬時表達試驗。這些研究已經(jīng)顯示了 El和E2 糖蛋白相互作用形成復(fù)合體(DubuissonJOOO中的綜述)。存在非離子去污劑時，檢測到兩種形式的E1E2復(fù)合體通過非共價相互作用穩(wěn)定的E1E2異ニ聚體和異質(zhì)的ニ硫鍵連接的聚集物，后者被認為代表錯誤折疊的復(fù)合體。以前，通過用合成肽或重組抗原免疫已經(jīng)獲得了包膜糖蛋白特異性抗體。然而，構(gòu)象敏感性E2反應(yīng)性單克隆抗體(mAb) (H2)-其識別被認為是HCV糖蛋白異ニ聚體的天然萌芽前(prebudding)形式的非共價連接的E1E2異ニ聚體-不與血清來源的HCV RNA陽性顆粒反應(yīng)(Deleersnyder等，1997)。此外，WO 92/07001 公開了通過用從感染的黒猩猩中提取的HCV顆粒制劑免疫小鼠而制備的抗體，然而這些抗體未曾在天然HCV顆粒(即，源自感染患者)上進行測試。此外，WO 00/05266公開了從感染患者B細胞制備的抗體，然而這些抗體是根據(jù)它們結(jié)合重組E2蛋白的能力選擇的。因此， 所有這些抗體的應(yīng)用都有限，或者用于診斷目的，或者用于治療或預(yù)防目的，因此它們是用非天然HCV或其部分生產(chǎn)或選擇的，而且未顯示出可與天然HCV顆粒相互作用。缺乏含有足夠量和濃度的天然有包膜的HCV顆粒的HCV制劑，是迄今為止無法獲得易于識別天然HCV顆粒的抗體的原因之一。實際上，血漿樣品中低水平的HCV顆粒使表征和顯現(xiàn)觀察這種病毒變得困難。先前已經(jīng)顯示了在感染的急性期從自然感染患者的血漿中回收的病毒在蔗糖中具有大約1.06g/ml的浮力密度(Hijikata等，1993)。相比之下， 體外復(fù)制后從細胞培養(yǎng)物中回收的HCV在蔗糖中具有I. 12g/ml的浮力密度(Yoshikura 等，1996)。最后，從慢性感染個體中回收的HCV在蔗糖中具有大約I. 17g/ml的浮力密度
3(Hijikata等，1993)。血清來源病毒的低密度歸因于其結(jié)合血清低密度脂蛋白(Thomssen 等，1992)。已經(jīng)顯示高密度病毒與抗原-抗體復(fù)合物中結(jié)合到病毒的抗體有關(guān)(Kanto等， 1995)。盡管有這些數(shù)據(jù)，但是仍然沒有表明這些不同HCV群的蛋白組成，以及是否低密度級分(く 1.0g/ml)含有包膜、RNA和核殼作為完整病毒體。因此，本發(fā)明的ー個目的是提供與天然HCV顆粒反應(yīng)的抗體。本發(fā)明的另一方面是提供天然HCV顆粒的組合物，其量和濃足以允許有效免疫抗體產(chǎn)生動物。本發(fā)明的另一方面是提供缺乏感染性，易于用作藥物組合物的活性物質(zhì)的特定 HCV組合物。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及能特異性結(jié)合天然HCV病毒包膜的構(gòu)象抗體。措辭“構(gòu)象抗體”指識別具有由其分子環(huán)境所限定的三維結(jié)構(gòu)的表位的抗體。措辭“特異性結(jié)合”意思是抗體結(jié)合到基本上僅在形成天然HCV病毒包膜的元件之一上發(fā)現(xiàn)的表位，也就是說，基本上不存在抗體與除形成天然HCV包膜的元件外的元件的結(jié)合。例如,可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法檢驗抗體的結(jié)合特異性,如Western印跡實驗，其中生物樣品在凝膠上通過電泳遷移，然后轉(zhuǎn)移到膜上并且與所述抗體共孵育，其然后通過ニ抗檢測。如果實質(zhì)上所檢測的所有電泳條帶都含有靶化合物或其部分，則稱所述抗體“特異性結(jié)合”所述生物樣品中包含的靶化合物。“HCV”意思是“丙型肝炎病毒”，其具體描述于Choo等(1989，1991)中。HCV特別地包括RNA、由核心蛋白構(gòu)成的衣殼以及包含脂質(zhì)和蛋白特別是糖蛋白的包膜?！癏CV病毒包膜”由脂質(zhì)和蛋白特別是糖蛋白如HCV蛋白El和E2構(gòu)成(Clarke， 1997)?！疤烊坏摹币馑际荋CV，或其部分，是如同在生物樣品中發(fā)現(xiàn)的，可能地是如同從生物樣品中分離的以及-如果需要的話-純化的。這種樣品可以是感染HCV的患者的血液、 血漿或者血清。特別地，“天然的”指HCV，或其部分，其不是通過重組方法，或者通過使用細胞系或動物生產(chǎn)的，并且不同于在例如Schalich等(1996) ,Blanchard等，(2002)或WO 92/07001中所描述的HCV元件。本發(fā)明更特別地涉及能特異性結(jié)合天然HCV E2蛋白的構(gòu)象抗體。HCV E2 特別地描述于 Dubuisson(2000)和 Op De Beeck 等(2001)中。其作為多蛋白(3012個氨基酸)產(chǎn)生，經(jīng)過切割產(chǎn)生E2 (384到714位氨基酸)。措辭“特異性結(jié)合”意思是抗體結(jié)合基本上僅在HCV E2蛋白上發(fā)現(xiàn)的表位，或其部分。特別地，在其中抗體-E2復(fù)合物與其它蛋白共同存在的競爭試驗中，不能將該抗體從 HCV E2蛋白上脫離下來。措辭“天然HCV E2蛋白”意思是該蛋白是如同在感染HCV患者的生物樣品中發(fā)現(xiàn)的，特別地天然HCV E2蛋白不是重組蛋白。本發(fā)明涉及如上所定義的構(gòu)象抗體，其能夠中和患者中的HCV感染?！爸泻虷CV感染”意思是該抗體能夠改善感染HCV患者的健康，例如，可通過血液、 血漿或血清中檢測到的HCV的減少得到證實，或者該抗體能預(yù)防個體被HCV感染?？稍谀Ｐ蛣游镏斜O(jiān)測所述抗體中和HCV感染的能力，如黒猩猩或小鼠，特別是人源化小鼠，其慢性感染HCV，或者其在所述抗體存在時首先感染(primo-infectecOHCV。所監(jiān)測的抗體應(yīng)當(dāng)能夠分別誘導(dǎo)減少HCV相關(guān)的病毒血癥或者預(yù)防HCV感染。本發(fā)明涉及如上所定義的構(gòu)象抗體，能夠沉淀在其共價或非共價形式下的HCV E1E2復(fù)合體。HCV E1E2復(fù)合體可以是非共價的，也就是說，El和E2通過弱鍵的方式結(jié)合，如氫鍵，離子鍵，范德瓦耳斯鍵或疏水鍵；或所述復(fù)合體可以是共價的，也就是說El和E2通過共價鍵的方式結(jié)合，例如ニ硫鍵。在Deleersnyder等(1997)中特別地描述或提出了 E1E2復(fù)合體的共價和非共價形式。“沉淀”意思是抗體可致使HCV E1E2復(fù)合體不溶。例如可根據(jù)Dubuisson和 Rice (1996)所述發(fā)生沉淀。本發(fā)明涉及如上所定義的構(gòu)象抗體，能夠特異性結(jié)合天然HCV El蛋白。特別地在Dubuisson (2000)和 Op De Beeck 等(2001)中描述了 HCV E1。其作為多蛋白產(chǎn)生(3012個氨基酸)，經(jīng)過切割產(chǎn)生El (192到383位氨基酸)。措辭“特異性結(jié)合”意思是抗體結(jié)合基本上僅在HCV El蛋白上發(fā)現(xiàn)的表位，或其部分。特別地在其中抗體-El復(fù)合物與其它蛋白一起存在的競爭試驗中，不能將該抗體從 HCV El蛋白上脫離下來。措辭“天然HCV El蛋白”意思是蛋白如在感染HCV患者的生物樣品中發(fā)現(xiàn)的，特別是該天然HCV El蛋白不是重組蛋白。本發(fā)明更具體地涉及構(gòu)象抗體,能夠特異性結(jié)合天然HCV El蛋白，結(jié)合天然HCV E2蛋白，并且能沉淀在其共價或非共價形式下的HCV E1E2復(fù)合體。本發(fā)明涉及如上所定義的構(gòu)象抗體，能夠特異性結(jié)合由至少下列序列之一構(gòu)成的表位HCV蛋白El的297到306位氨基酸；HCV蛋白E2的480到494位氨基酸；HCV蛋白E2的613到621位氨基酸。根據(jù)本發(fā)明的抗體能夠結(jié)合呈現(xiàn)(presenting)包含HCV蛋白El的297到306位氨基酸的肽的分子，對應(yīng)以下序列RHWTTQGCNC(SEQ ID NO 1);和 / 或呈現(xiàn)包含HCV蛋白E2的480到494位氨基酸的肽的分子，對應(yīng)以下序列 PDQRPYCffHYPPKPC(SEQ ID NO 2);和 / 或呈現(xiàn)包含HCV蛋白E2的613到621位氨基酸的肽的分子，對應(yīng)以下序列 YRLffHYPCT(SEQ ID NO 3)可通過合成含有任何前述序列的肽以及通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法例如 ELISA或EIA測定抗體結(jié)合所述合成肽的能力,檢驗所述抗體與至少ー種前述序列的結(jié)合。首字母縮略詞“ELISA”意思是酶聯(lián)免疫吸附測定。首字母縮略詞“EIA”意思是酶免疫測定。本發(fā)明涉及如上所定義的構(gòu)象抗體，能夠特異性結(jié)合由下列序列中的每ー個構(gòu)成的表位HCV蛋白El的297到306位氨基酸；
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HCV蛋白E2的480到494位氨基酸；HCV蛋白E2的613到621位氨基酸。根據(jù)本發(fā)明的抗體能夠結(jié)合呈現(xiàn)表位的分子，所述的表位包含包含HCV蛋白El的297到306位氨基酸的肽，對應(yīng)下列序列RHWTTQGCNC(SEQ ID NO 1);和包含HCV蛋白E2的480到494位氨基酸的肽，對應(yīng)下列序列 PDQRPYCffHYPPKPC(SEQ ID NO 2);和包含HCV蛋白E2的613到621位氨基酸的肽，對應(yīng)下列序列YRLWHYPCT(SEQ ID NO 3)?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，例如ELISA或EIA，通過測定抗體結(jié)合一種分子，特別是包含序列RHWTTQGCNC(SEQ ID NO :1)的蛋白，結(jié)合一種分子，特別是包含序列roQRPYCWHYPPKPC(SEQ ID NO 2)的蛋白，以及結(jié)合一種分子，特別是包含序列 YRLffHYPCT(SEQ ID NO :3)的蛋白的能力，檢驗所述抗體與包含每種前述序列的表位的結(jié)
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ロ o本發(fā)明涉及如上所定義的構(gòu)象抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。措辭“單克隆抗體”意思是所述抗體實質(zhì)上僅結(jié)合一個表位，或結(jié)合所述表位的部分?？蓮膩碓从谟郎贵w分泌細胞例如雜交瘤的單克隆細胞系獲得單克隆抗體。單克隆細胞系來源于獨特細胞的培養(yǎng)?？筛鶕?jù)例如Kohler和Milstein (1975)或者根據(jù)Buttin等(1978),通過抗體分泌細胞如B細胞與永生細胞的融合生產(chǎn)雜交瘤。根據(jù)本發(fā)明的另ー個方面，如上所定義的單克隆抗體由根據(jù)布達佩斯條約的規(guī)定于 2003 年 3 月 19 在 CNCM(Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris, France)保藏的登錄號為 CNCM 1-2983 的雜交瘤分泌。所述單克隆抗體特別地結(jié)合天然HCV病毒包膜，結(jié)合天然HCV E2蛋白，結(jié)合天然 HCV El蛋白，并且能夠沉淀在其共價或非共價形式下的HCV E1E2復(fù)合體，井能夠結(jié)合由至少ー種或者由所有上述定義序列構(gòu)成的表位。所述的單克隆抗體此后特別地稱作D32. 10。根據(jù)本發(fā)明的另ー個方面，如上所定義的單克隆抗體由根據(jù)布達佩斯條約的規(guī)定于 2003 年 3 月 19 在 CNCM(Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris, France)保藏的登錄號為 CNCM 1-2982 的雜交瘤分泌。所述單克隆抗體特別地結(jié)合天然HCV病毒包膜并且結(jié)合HCV E2蛋白。所述單克隆抗體此后特別地稱作D4. 12. 9。本發(fā)明也涉及根據(jù)本發(fā)明抗體的片段或衍生物。本發(fā)明抗體的片段特別地包括 Fab、F(ab' ) 2或scFv (單鏈Fv)片段，其對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的。本發(fā)明抗體的衍生物包括-如果適當(dāng)?shù)脑?人源化抗體。人源化抗體例如可以是嵌合抗體，其中-如果適當(dāng)?shù)脑?用人抗體的相應(yīng)部分例如Fe片段置換根據(jù)本發(fā)明抗體的部分?？蛇x擇地，可將根據(jù)本發(fā)明的抗體的互補決定區(qū)(CDR)移植到人抗體，例如根據(jù)在美國專利5，824，307 中所述。根據(jù)另ー個實施方案，本發(fā)明涉及根據(jù)布達佩斯條約的規(guī)定于2003年3月19在 CNCM(Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris, France)保藏的登錄號為CNCM 1-2983的雜交瘤。根據(jù)另ー個實施方案，本發(fā)明涉及根據(jù)布達佩斯條約的規(guī)定于2003年3月19 在 CNCM(Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris, France)保藏的登錄號為CNCM 1-2982的雜交瘤。根據(jù)另ー個實施方案，本發(fā)明涉及包含至少ー種上述所定義的抗體作為活性物質(zhì)和藥學(xué)上可接受載體的藥物組合物。藥學(xué)上可接受的載體特別是如在Remington' s Pharmaceutical Sciences第16 版/Mack Publishing Co.中所定義?？稍谏鲜龆x的組合物中包括其它化合物，特別是抗病毒化合物，如其它抗HCV 抗體及其片段或衍生物、干擾素、RNA聚合酶抑制劑、蛋白酶抑制劑或解旋酶抑制劑?？梢詥蝿┝炕蚨鄤┝渴┯蒙厦嫠岬降乃幬锝M合物。假設(shè)是單劑量，該組合物可包括從姆公斤體重約0. Img抗體到姆公斤體重約Ig抗體，特別地從約lmg/kg到約IOOmg/ kg。假設(shè)是多劑量，可以每天每公斤體重約0. Img抗體到每天每公斤體重約Ig抗體的劑量， 特別是從約lmg/kg/天到約100mg/kg/天,施用該組合物。根據(jù)另ー個實施方案，本發(fā)明涉及至少ー種如上所定義的抗體用于制備診斷、預(yù)防或治療HCV感染的藥物的用途?？墒褂酶鶕?jù)本發(fā)明的抗體用于檢測傾向于含有HCV的生物樣品中的HCV病毒顆粒?？蓮母腥綡CV或者處于受HCV感染危險的患者中獲得這些樣品,特別地包括血液、血楽; 或血清樣品。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的用抗體檢測病毒的任何方法，如ELISA或EIA，可以以本發(fā)明的抗體應(yīng)用?？墒褂酶鶕?jù)本發(fā)明的抗體用于制備向感染或未感染HCV的患者施用以中和HCV感染的藥物?？赏ㄟ^預(yù)防HCV接觸靶細胞進行HCV感染中和，例如通過使抗體結(jié)合包膜分子， 如El或E2，其結(jié)合靶細胞膜受體，從而阻止HCV-靶細胞結(jié)合?？上蚋腥綡CV的患者施用該抗體以防止HCV病毒顆粒感染細胞，特別是肝細胞，或者促進免疫系統(tǒng)細胞捕獲包被所述抗體的HCV。可特別地在移植手術(shù)之前、期間或者之后，向接受移植器官特別是肝臟的患者施用該抗體，以中和可能在移植的器官中含有的HCV病毒顆粒。本發(fā)明也涉及能結(jié)合至少ー種上述所定義抗體的有包膜的病毒顆粒。措辭“有包膜的病毒顆粒”特別地代表HCV病毒體，或者HCV病毒體的一部分，其含有包膜，所述包膜包含脂質(zhì)和/或蛋白，特別是糖蛋白，在小葉中結(jié)合(associated in leaflets)。本發(fā)明也涉及結(jié)合有包膜病毒顆粒的抗體，所述病毒顆粒能結(jié)合至少ー種上述所定義抗體。根據(jù)另ー個實施方案，本發(fā)明涉及來源于人血液、血漿或血清最初樣品的HCV病毒顆粒的組合物，其中HCV RNA拷貝的濃度比其來源的人血液、血漿或血清最初樣品中的 HCV RNA拷貝的濃度高約100到1000倍，特別是高于約IO7個拷貝/ml。高濃度的根據(jù)本發(fā)明的組合物允許用所述的組合物有效免疫動物。HCV RNA 特別是 HCV 基因組 RNA。
可通過RT-PCR，特別是定量RT-PCR測量樣品的HCV RNA含量，例如用AmpIicor HCV Monitor , Roche Diagnostics (Young 等，1993)。可選擇地，也可使用NASBA (基于核酸序列的擴增)技術(shù)(Damen等，1999)測量樣品的HCV RNA含量?？梢砸运鰳悠分蠬CV RNA分子的拷貝數(shù)目表示樣品的HCV RNA含量，一個拷貝等于ー個國際單位(UI)。 樣品的HCV RNA含量指示所述樣品中所含有的HCV病毒體的量。含有高于約IO7個拷貝/ml的HCV RNA的組合物允許用所述組合物有效地免疫動物。本發(fā)明更具體地涉及如上所定義的組合物，其中HCV RNA拷貝的數(shù)目是從每毫克蛋白約IO8到約IO9UIo通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法評價組合物的蛋白含量，特別是通過Lowry測定 (Lowry 等，1951)如 Biorad 蛋白測定(Biorad Laboratories)。這種測量代表組合物的特異活性，其指示組合物的純度；每毫克蛋白中HCV RNA 拷貝數(shù)目越高，含有HCV的組合物的純度就越高。本發(fā)明進一步涉及如上所定義的組合物，其中所述組合物的體積是從約0. Iml到約 IOml0約0. Iml到約IOml的組合物體積相當(dāng)于含有至少IO6HCV RNA拷貝的上述所定義
的組合物。這種組合物對于動物的免疫有用。例如，如在實施例中所描述的，對小鼠的有效免疫需要施用含有高于約IO6HCV RNA拷貝的HCV病毒顆粒組合物。根據(jù)另ー個實施方案，本發(fā)明涉及分離的實質(zhì)上缺乏HCV RNA和缺乏HCV核心蛋白的HCV有包膜的亞病毒顆粒。術(shù)語“分離的”意思是顆粒已經(jīng)從其天然環(huán)境中提取出來，特別地其已經(jīng)與其它 HCV病毒顆?；蚱浜蠬CV RNA和/或HCV核心蛋白的部分分離。措辭“實質(zhì)上缺乏HCV RNA和缺乏HCV核心蛋白”意思是含有上述所定義的亞病毒顆粒的溶液含有如用 Amplicor HCV Monitor , Roche Diagnostics (Young 等，1993)測量的低于 104UI/ml 的 HCV RNA,以及如用 Ortho-Clinical Diagnostics 試驗(Aoyagi 等， 1999)測量的低于lpg/ml的核心蛋白。例如可用由在CNCM保藏的登錄號為1-2983的雜交瘤所分泌的抗體，此后稱作 D32. 10，或者由在CNCM保藏的登錄號為1-2982的雜交瘤所分泌的抗體，此后稱作D4. 12. 9， 通過EIA或ELISA試驗評估包膜的存在。措辭“HCV有包膜的亞病毒顆?！币馑际窃擃w粒實質(zhì)上上僅含有HCV病毒體的包膜部分，也就是說脂質(zhì)和蛋白，特別是糖蛋白，在小葉中結(jié)合。迄今分離的HCV病毒顆粒含有 HCV RNA和/或HCV核心蛋白。本發(fā)明更具體地涉及如上所定義的分離的HCV有包膜的亞病毒顆粒，其中所述亞病毒顆粒易于結(jié)合任何上述所定義的抗體?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的幾種方法，例如免疫沉淀、ELISA、EIA或Western印跡，評價上述所定義的亞病毒顆粒與本發(fā)明抗體的結(jié)合。
根據(jù)另ー個實施方案，本發(fā)明涉及包含純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的組合物，所述純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒含有HCVRNA、HCV核心蛋白以及HCV包膜，并易于結(jié)合上述所定義的任何ー種抗體。本發(fā)明更特別地涉及包含純化的天然HCV有包膜的完整病毒顆粒的組合物。措辭“HCV有包膜的完整病毒顆?！币馑际荋CV病毒體含有HCV基因組RNA、HCV 核心蛋白以及HCV包膜。在現(xiàn)有技術(shù)中一直沒有關(guān)于含有這三種成分的HCV病毒顆粒的報道?？赏ㄟ^使用如上所定義的方法評估是否存在HCV RNA、HCV核心蛋白和HCV包膜。術(shù)語“純化的”意思是上述所定義的HCV有包膜的完整病毒顆粒已經(jīng)與其它化合物，如HCV有包膜的亞病毒顆粒分離。特別地，例如可通過電子顯微鏡術(shù)評價組合物含有比 HCV有包膜的完整病毒顆粒少90%的HCV有包膜的亞病毒顆粒?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的幾種方法，例如免疫沉淀、ELISA、EIA或Western印跡評價上述所定義的HCV有包膜的完整病毒顆粒與根據(jù)本發(fā)明的抗體的結(jié)合。根據(jù)另ー個實施方案，本發(fā)明涉及制備HCV病毒顆粒的組合物的方法，包括下列步驟對從HCV感染患者的澄清的血衆(zhòng)取出法(clarified plasmapheresis)得到的樣品進行至少兩次超速離心，以獲得富集HCV的沉淀；在水溶液中重懸富集HCV的沉淀以獲得HCV病毒顆粒的組合物?？梢砸岳缂s190，OOOg到約220，OOOg,優(yōu)選地210，OOOg的速度，進行超速離心約 3小時到約5小時，優(yōu)選地4小時。優(yōu)選的離心條件導(dǎo)致病毒顆粒沉淀，如HCV病毒顆粒，而不沉淀在澄清的血漿中含有的其它化合物。術(shù)語“血漿取出法”意思是將患者的血液進行過濾以獲得血漿，而將血液的剰余部分重新注射回患者。術(shù)語“澄清的”意思是將從血漿取出法獲得的血漿以低速特別地以3000g離心30分鐘。超速離心前血漿取出法的最初的體積有利地是大約I升。根據(jù)另ー個實施方案，本發(fā)明涉及HCV病毒顆粒的組合物，如根據(jù)上面所提到的制備HCV病毒顆粒的組合物的方法所獲得的。根據(jù)另ー個實施方案，本發(fā)明涉及制備HCV有包膜的亞病毒顆粒的組合物的方法，包括下列步驟-對從HCV感染患者的澄清的血漿取出法得到的樣品進行至少兩次超速離心，以獲得富集HCV的沉淀；在水溶液中重懸富集HCV的沉淀；在蔗糖密度梯度中超速離心重懸的富集HCV的沉淀，以將重懸的富集HCV的沉淀的組成成份(element)根據(jù)它們的密度分成級分(fraction)；回收實質(zhì)上不含HCV RNA、實質(zhì)上不含HCV核心蛋白以及含有能結(jié)合以上定義為 D32. 10或D4. 12. 9的單克隆抗體的顆粒的級分，以獲得HCV有包膜的亞病毒顆粒的組合物。在蔗糖密度梯度中重懸的富集HCV的沉淀的超速離心可以從約190，OOOg到約
9220，000g，優(yōu)選地210，000g，進行約40小時到約50小時，優(yōu)選地48小時，蔗糖梯度可有利地是從約10%到約60% w/w、從約20到約50% w/w、從約25%到約45% w/w,或者從約30% 到約 45% w/w。檢驗所獲得的所有級分是否存在HCV RNA、HCV核心蛋白和/或能結(jié)合D32. 10或 D4. 12.9的顆粒。當(dāng)通過Amplicor HCV Monitor , Roche Diagnostics (Young 等，1993)測量的 HCV RNA的含量少于約104UI/ml時，稱該級分實質(zhì)上不含有HCV RNA。當(dāng)通過Ortho-Clinical Diagnostics 試驗(Aoyagi 等，1999)測量的 HCV 核心蛋白的含量少于約lpg/ml時，稱該級分實質(zhì)上不含有HCV核心蛋白。使用的單克隆抗體特別地是由在CNCM保藏的登錄號為1-2983的雜交瘤所分泌的單克隆抗體D32. 10。如果顆粒能在以下EIA試驗中被檢驗為陽性，則稱該顆粒能夠結(jié)合上面所提到的單克隆抗體用從KT1到10_4稀釋的不同級分包被96孔聚苯こ烯平板(Falcon ;Becton Dickinson France S. A,Le Pont de Claix)。在 4°C過夜孵育平板,然后用含有 5% (w/v) 牛血清蛋白(BSA)的 Tris-NaCl(TN)緩沖液(20mM Tris-HCl, pH 7. 5 和 IOOmM NaCl)飽和。將在TN/BSA緩沖液和50%正常人血清(NHS)的混合液中以5 u g/ml的濃度稀釋的mAb D32. 10加到每個孔中，并在37°C孵育2小吋。用偶聯(lián)辣根過氧化物酶(HRPO)的抗小鼠免疫球蛋白的F(ab' )2片段(1/5，000稀釋；Immunotech)以及用鄰苯ニ胺(OPD)和過氧化氫(H2O2)作為底物，檢測結(jié)合的抗體。用ELISA讀板器(MRX，Dynex)在450nm或在490nm 測定光密度(OD)。當(dāng)超過截止值(相當(dāng)于陰性対照的均值乘以2. I)吋，則認為結(jié)果是陽性的?；厥盏募壏痔貏e地具有大約I. 13到I. 15g/ml的蔗糖密度?？蛇x擇地，首先檢驗該級分中是否存在能結(jié)合D 32. 10和/或D4. 12. 9的顆粒，如果實質(zhì)上不存在這種顆粒，則不進行其它的檢驗，如果存在這種顆粒，則然后進行HCV RNA 檢驗和/或HCV核心蛋白檢驗。根據(jù)另ー個實施方案，本發(fā)明涉及HCV有包膜的亞病毒顆粒的組合物，如根據(jù)上述制備HCV有包膜的亞病毒顆粒的組合物的方法所獲得的。根據(jù)另ー個實施方案，本發(fā)明涉及制備純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的組合物的方法，包括下列步驟對從HCV感染患者的澄清的血漿取出法得到的樣品進行至少兩次超速離心，以獲得富集HCV的沉淀；在水溶液中重懸富集HCV的沉淀；在蔗糖密度梯度中超速離心重懸的富集HCV的沉淀，以將重懸的富集HCV的沉淀的組成成份根據(jù)它們的密度分成級分；回收含有每毫升從約5. IO5到約IO6UI的HCV RNA、每毫升從約50到約IOOpg的 HCV核心蛋白，以及含有能結(jié)合以上定義為D32. 10或D4. 12. 9的單克隆抗體的顆粒的級分， 以獲得純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的組合物。在蔗糖密度梯度中重懸的富集HCV的沉淀的超速離心可以從約190，OOOg到約220，000g，優(yōu)選地210，000g，進行約40小時到約50小時，優(yōu)選地48小時，蔗糖梯度可有利地是從約10%到約60% w/w、從約20到約50% w/w、從約25%到約45% w/w或者從約30% 到約 45% w/w。如上所示測量HCV RNA含量、HCV核心蛋白含量以及顆粒的結(jié)合能力。所使用的單克隆抗體特別地是由在CNCM保藏的登錄號為1-2983的雜交瘤所分泌的單克隆抗體D32. 10。通過這種方法獲得的組合物特別地含有純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒并且特別地實質(zhì)上缺乏HCV有包膜的亞病毒顆粒。特別地，例如其可通過電子顯微鏡術(shù)評價組合物含有比HCV有包膜的完整病毒顆粒少90%的HCV有包膜的亞病毒顆粒。所回收的級分特別地具有大約I. 17到I. 21g/ml的蔗糖密度，更特別地具有大約 I. 17 到 I. 20g/ml、大約 I. 19 到 I. 21g/ml、大約 I. 17 到 I. 19g/ml 或者大約 L 19 到 I. 20g/ ml的蔗糖密度。可選擇地，首先檢驗級分中是否存在HCV RNA,如果存在高于IO5拷貝/ml的HCV RNA,則然后進行HCV核心蛋白的檢驗,如果存在高于50pg/ml的核心蛋白，則然后檢驗是否存在能結(jié)合D32. 10和/或結(jié)合D4. 12. 9的顆粒；如果存在少于IO5拷貝/ml的HCV RNA,則不進行其它檢驗。根據(jù)另ー個實施方案，本發(fā)明涉及純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的組合物， 如根據(jù)上述相應(yīng)的方法所獲得的。本發(fā)明也涉及制備由在CNCM保藏的登錄號為1-2983的雜交瘤所分泌的單克隆抗體的方法，包括下列步驟-用本發(fā)明的HCV病毒顆粒的組合物，或者如根據(jù)本發(fā)明所制備的組合物免疫動物，特別是哺乳動物，并回收所產(chǎn)生的抗體；-在所產(chǎn)生的抗體中，根據(jù)它們結(jié)合在上面所提到的HCV病毒顆粒的組合物中含有的HCV病毒顆粒的能力選擇單克隆抗體?？扇缦芦@得HCV病毒顆粒的組合物-對從HCV感染患者的澄清的血漿取出法得到的樣品進行至少兩次超速離心，以獲得富集HCV的沉淀；-在水溶液中重懸富集HCV的沉淀以獲得HCV病毒顆粒的組合物?？捎萌缟鲜鏊x的間接EIA檢驗對所產(chǎn)生的抗體進行選擇，用本發(fā)明的HCV病毒顆粒的組合物包被平板。根據(jù)另ー個實施方案，本發(fā)明涉及制備由在CNCM保藏的登錄號為1-2982的雜交瘤所分泌的單克隆抗體的方法，包括下列步驟用本發(fā)明的純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的組合物，或者如根據(jù)本發(fā)明制備的組合物免疫動物，特別是哺乳動物，以及回收所產(chǎn)生的抗體；在所產(chǎn)生的抗體中，根據(jù)它們結(jié)合在上面所提到的純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的組合物中含有的純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的能力，選擇單克隆抗體?？扇缦芦@得純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的組合物-對從HCV感染患者的澄清的血漿取出法得到的樣品進行至少兩次超速離心，以獲得富集HCV的沉淀；
-在水溶液中重懸富集HCV的沉淀；-在蔗糖密度梯度中超速離心重懸的富集HCV的沉淀，以將重懸的富集HCV的沉淀的組成成份根據(jù)它們的密度分成級分；-回收含有每毫升從約5.IO5到約IO6UI的HCV RNA、每毫升從約50到約IOOpg的 HCV核心蛋白，以及含有能結(jié)合以上定義為D32. 10或D4. 12. 9的單克隆抗體的顆粒的級分， 以獲得純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的組合物。可如上所述進行選擇步驟。根據(jù)另ー個實施方案，本發(fā)明涉及制備針對HCV特別是HCV有包膜的亞病毒顆粒的單克隆抗體的方法，包括下列步驟-用本發(fā)明的HCV有包膜的亞病毒顆粒的組合物，或者根據(jù)本發(fā)明所制備的組合物免疫動物，特別是哺乳動物，并回收所產(chǎn)生的抗體；-在所產(chǎn)生的抗體中，根據(jù)它們結(jié)合在上面所提到的HCV有包膜的亞病毒顆粒的組合物中含有的HCV有包膜的亞病毒顆粒的能力選擇單克隆抗體?？扇缦芦@得HCV有包膜的亞病毒顆粒的組合物-對從HCV感染患者的澄清的血漿取出法得到的樣品進行至少兩次超速離心，以獲得富集HCV的沉淀；-在水溶液中重懸富集HCV的沉淀；-在蔗糖密度梯度中超速離心重懸的富集HCV的沉淀，以將重懸的富集HCV的沉淀的組成成份根據(jù)它們的密度分成級分；-回收實質(zhì)上不含HCVRNA、實質(zhì)上不含HCV核心蛋白，以及含有能結(jié)合以上定義為D32. 10或D4. 12. 9的單克隆抗體的顆粒的級分，以獲得HCV有包膜的亞病毒顆粒的組合物。可如上所述進行選擇步驟。本發(fā)明更特別地涉及針對本發(fā)明的HCV有包膜的亞病毒顆粒的抗體。本發(fā)明也涉及包含至少ー種針對HCV有包膜的亞病毒顆粒的抗體作為活性物質(zhì)以及藥學(xué)上可接受載體的藥物組合物。根據(jù)另ー個實施方案，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含作為活性物質(zhì)的如上所定義的HCV有包膜的亞病毒顆粒，或者包含如上所定義的HCV有包膜的亞病毒顆粒的組合物， 以及藥學(xué)上可接受的載體?？上蛩幬锝M合物中添加另外的佐劑，例如在Remington ' s Pharmaceutical Sciences第16版/Mack Publishing Co.中所定義,佐劑可以是例如不完全弗氏佐劑、招鹽
或氫氧化鋁。例如可以以包含從Img到Ig的HCV有包膜的亞病毒顆粒的單劑量施用組合物。根據(jù)另ー個實施方案，本發(fā)明涉及如上所定義的HCV有包膜的亞病毒顆粒的用途，或者包含如上所定義的HCV有包膜的亞病毒顆粒的組合物的用途，用于誘導(dǎo)抗所述HCV 有包膜的亞病毒顆?；蚩谷缟纤x的HCV有包膜的完整病毒顆粒的免疫反應(yīng)。措辭“誘導(dǎo)免疫反應(yīng)”意思是可激活分泌抗HCV病毒顆粒的抗體的B細胞或者可激活破壞感染HCV的細胞的T細胞。根據(jù)另ー個實施方案，本發(fā)明涉及如上所定義的HCV有包膜的亞病毒顆粒的用途，或者包含上述所定義的HCV有包膜的亞病毒顆粒的組合物的用途，用于制備診斷、預(yù)防或治療HCV感染的藥物?？墒褂肏CV有包膜的亞病毒顆粒，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，在免疫測定如EIA、ELISA中，評估是否存在針對HCV的抗體?？墒褂肏CV有包膜的亞病毒顆粒用于制備抗丙型肝炎的疫苗，特別是治療性疫苗。措辭“治療性疫苗”意思是該疫苗能改善感染HCV患者的情況，例如通過誘導(dǎo)產(chǎn)生抗HCV的抗體。附圖的簡要說明

圖1A、圖 1B、圖 1C、圖 ID 和圖 IE圖1A、1B、1C、1D和IE表示抗體沉淀的35S標(biāo)記細胞的溶胞產(chǎn)物的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。泳道1、2、3、4、5、6和7分別對應(yīng)于抗體C9. 19. 16、 C2. 22. UD 32. 10、D 3. 20. 12、C7. 24. 19、C7. 14. 41 和 CL 9. 3。MW 對應(yīng)于分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物。在凝膠的右邊給出與分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物對應(yīng)的條帶的大小。如果可能，在凝膠的左邊將條帶鑒定為El、E2或Agg(對于聚集的)。圖IA表示抗體沉淀的35S標(biāo)記的對照細胞的溶胞產(chǎn)物的SDS-PAGE，在還原條件下。圖IB表示抗體沉淀的35S標(biāo)記的表達HCV El蛋白的細胞的溶胞產(chǎn)物的SDS-PAGE， 在還原條件下。圖IC表示抗體沉淀的35S標(biāo)記的表達HCV E2蛋白的細胞的溶胞產(chǎn)物的SDS-PAGE， 在還原條件下。圖ID表示抗體沉淀的35S標(biāo)記的表達HCV E1E2蛋白的細胞的溶胞產(chǎn)物的 SDS-PAGE，在還原條件下。圖IE表示抗體沉淀的35S標(biāo)記的表達HCV E1E2蛋白的細胞的溶胞產(chǎn)物的 SDS-PAGE，在非還原條件下。圖2圖2表示HCV病毒顆粒的Western印跡，使用D32. 10單克隆抗體，在非還原和還原條件下。從左到右，M代表分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物，在非還原條件下，在凝膠的左邊指示其條帶的大小(以kDa表示)，泳道I代表使用D32. 10單克隆抗體在非還原條件下HCV病毒顆粒的Western印跡，第二個泳道M代表在還原條件下的分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物，泳道2代表使用 D32. 10單克隆抗體在還原條件下2，5 ii g HCV病毒顆粒的Western印跡，泳道3代表使用 D32. 10單克隆抗體在還原條件下5 ii g HCV病毒顆粒的Western印跡。在凝膠的右邊,指示泳道3的幾個條帶的大小(以kDa表示)，ー些對應(yīng)于HCV蛋白E2 (60和68)或者對應(yīng)于 HCV 蛋白 El (34 和 31)。圖3A 和圖 3B圖3A和圖3B表示經(jīng)受糖苷酶A(圖3A)和內(nèi)切糖苷酶H (圖3B)去糖基化的HCV 病毒顆粒的Western印跡。在圖3A中，泳道M代表分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物，在凝膠的左邊指示其條帶中3個的大小(以kDa表示)；泳道1、2、3和4分別代表糖苷酶濃度為20、10、5和OmU/ml。在凝膠的右邊，指示HCV蛋白E2和El的位置，以及蛋白El的主要去糖基化形式(El*)的位置和對
13應(yīng)于El或E2的去糖基化形式的幾個條帶的大小(以kDa表示)，以及E2的主要去糖基化形式(41*)。在圖3B中，泳道M代表分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物，在凝膠的左邊指示其條帶中4個的大小(以kDa表示)；泳道I和2分別代表無內(nèi)切糖苷酶H進行的對照去糖基化實驗和存在內(nèi)切糖苷酶H時進行的去糖基化實驗。在凝膠的右邊代表對應(yīng)于E2和El的完全糖基化形式以及對應(yīng)于E2(50、48、46和42kDa)和El (28和24kDA)的去糖基化形式的主要條帶。通過星號標(biāo)記E2 (50*)和El (28*)的占優(yōu)勢的去糖基化形式。圖4圖4表示通過對HCV病毒顆粒制劑的蔗糖密度梯度離心所得到級分的表征。已經(jīng)測量了 3個參數(shù)，HCV RNA含量、HCV核心蛋白含量以及對D32. 10單克隆抗體的反應(yīng)性。水平軸代表接受表征的級分的編號。左邊的垂直軸代表HCV RNA濃度(X 105UI/ml)和通過間接EIA測量(在450nm的0D)的對D32. 10反應(yīng)性的測量值。右邊的垂直軸代表HCV核心蛋白濃度(以pg/ml表示)。與黒點對應(yīng)的曲線代表級分對D32. 10的反應(yīng)性，與白色三角形對應(yīng)的曲線代表級分核心蛋白含量，虛線代表級分HCV RNA含量。圖5A、圖 5B 和圖 5C圖5A、圖5B和圖5C分別代表HCV病毒顆粒制劑、HCV有包膜的完整病毒顆粒制劑以及HCV有包膜的亞病毒顆粒制劑的透射電子顯微鏡照片。在圖5A中，水平條代表200nm長的刻度。較大的圓形成分代表HCV有包膜的完整病毒顆粒，較小的圓形成分代表HCV有包膜的亞病毒顆粒。在圖5B中，水平條代表50nm長的刻度。圓形成分代表HCV有包膜的完整病毒顆粒。在圖5C中，水平條代表50nm長的刻度。圓形成分代表HCV有包膜的亞病毒顆粒。圖6圖6表示使用D4. 12. 9單克隆抗體的HCV病毒顆粒的Western印跡。泳道M代表分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物，在凝膠的左側(cè)和右側(cè)指示其4個條帶(75、50、37、25)的大小(以kDa表示)。泳道I和2代表分別用糖苷酶A和用內(nèi)切糖苷酶H消化HCV病毒顆粒的結(jié)果，泳道3 和4代表用蛋白酶胰蛋白酶和V8蛋白水解消化HCV病毒顆粒的結(jié)果，泳道5代表用NP-40 溶解的結(jié)果，在泳道6中沒有進行先前的處理。在凝膠的右邊，指示未消化的E2蛋白的兩種主要形式(68和48)(以kDa表示)，在凝膠的左邊表示E2的主要去糖基化形式(E2*)。圖7圖7表示對HCV病毒顆粒制劑的蔗糖密度梯度離心所獲得級分的基于D4. 12. 9的表征。除了級分對D4. 12.9的反應(yīng)性，還測量了級分核心蛋白含量。水平軸代表接受表征的級分的編號。右邊的垂直軸代表通過間接EIA(在450nm的0D)測量的對D4. 12. 9反應(yīng)性的測量值。左邊的垂直軸代表HCV核心蛋白濃度(以pg/ml表示)。與黒色正方形對應(yīng)的曲線代表級分對D4. 12.9的反應(yīng)性，與黒色菱形對應(yīng)的曲線代表級分核心蛋白含量。圖8A、圖 8B 和圖 8C圖8A、圖8B和圖8C表示3種生物素化肽，分別包含第290-317位氨基酸(圖8A)、 第417-500位氨基酸(圖8B)以及第605-629位氨基酸(圖8C)，對健康個體(11份血清， 在水平軸上編號為Tl到Tll)和HCV感染患者(44份血清，在水平軸上編號為Al到A44)的55份血清的免疫反應(yīng)性。垂直軸代表通過ELISA(在490nm的OD值乘以1000)測定的血清對三種肽的反應(yīng)性。白色條形代表健康個體的血清的反應(yīng)性，灰色條形代表感染患者的血清的反應(yīng)性。水平線代表截止值，在其之上的血清反應(yīng)被認為是陽性。在圖8A中，截止值是0. 691，在圖8B中是0. 572，在圖8C中是0. 321。圖9A 和圖 9B通過Ortho Clinical Diagnostics的總HCV核心抗原測定對HCV-Fan沉淀和來自上述I型的從30到45%蔗糖梯度的級分中的HCV核心蛋白進行定量(圖9A)并通過 Western印跡進行分析(圖9B)。(圖9A)以I : 2稀釋檢驗所有級分。檢驗I : 25、I 50 和I : 100稀釋的HCV-Fan沉淀，發(fā)現(xiàn)含有332pg/ml。所有稀釋都用TNE緩沖液進行。截止值是I. 4pg/ml。(圖9B)對HCV-Fan沉淀和來自30-45%蔗糖梯度的第4、8、12和13級分進行SDS-12. 5% PAGE。使用抗核心、7G12A8、2G9A7和19D9D6單克隆抗體的混合物(每種5 ii g/ml)檢測HCV核心蛋白。使用Amersham的ECL Plus系統(tǒng)使印跡顯影。左邊的數(shù)字指示以千道爾頓(kDa)表示的標(biāo)準(zhǔn)參照物(M)的分子量，右邊指示HCV核心蛋白。圖10通過定量RT-PCR Amplicor HCV Monitor test version 2. 0(Roche Diagnostics)在所有來自最初10到60%蔗糖梯度的級分中分析HCV RNA。根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明進行檢驗。通過使用QS國際單位(IU)計算每個PCR的結(jié)果，其對每批都是特異的，并且以IU HCVRNA/ml表示。圖IlA 和圖 IlB通過電子顯微鏡術(shù)(EM)對血清來源的HCV有包膜的顆粒進行分析。通過使用MAb D32. 10 (5 u g) (a、b、c和d組)或不相關(guān)的Mab (e組)對HCV-Fan沉淀(2 u g)進行免疫沉淀，通過超速離心沉淀后的免疫復(fù)合物吸附到格柵上并用1%こ酸雙氧鈾(pH 4.5)染色。 使用JEOL 100CX電子顯微鏡觀察該制劑。(圖11A)顆粒直徑(用nm表示)有些變化，對 156個病毒顆粒(VPs)繪制直方圖。顆粒大小分布顯示在35nm處集中的峰。(圖11B)電子顯微鏡照片。a、b、c和e組中的條帶指示50nm。圖12A 和圖 12B用D32. 10免疫沉淀、在格柵上吸附以及染色后，通過電子顯微鏡術(shù)分析來自蔗糖梯度峰I (圖12A)和2 (圖12B)的HCV-Fan顆粒。(圖12A)對41個病毒顆粒繪制直方圖。 在峰I中占主要的種類(85. 4% )是直徑約20nm的球形顆粒，所謂的《小顆?！?。(圖12B) 對89個病毒顆粒繪制直方圖。峰2中最普遍的形式(77. 5% )平均直徑約41nm。峰2似乎在大小上有點更不均勻，并且主要由直徑35和50nm的顆粒組成，所謂的《大顆?！?。條形指不50nm。圖13有包膜的HCV顆粒的間接免疫金標(biāo)記。將用D32-10-免疫復(fù)合物(HCV沉淀， 20 ug ；MAb D32. 10,5ug)包被的顯微鏡格柵與作為ニ抗的I : 50稀釋的偶聯(lián)山羊抗小鼠 IgG的膠體金顆粒(IOnm)孵育。根據(jù)IgG的空間位阻(在EM中約15nm),僅有少數(shù)金顆?？设b定抗體結(jié)合。在病毒顆粒外沒有觀察到金顆粒。在所有圖形中的條形都指示20nm。圖14A、圖 14B、圖 14C 和圖 14D圖14A和14B表示來自基因型Ib的分離物HCV-L的富集HCV的沉淀在蔗糖密度梯度(10%到60% )中等密度離心的結(jié)果。圖14A表示離心后所獲得級分(水平軸)的密度(左側(cè)的垂直軸，g/ml)和 E1E2-D32. 10反應(yīng)性(右側(cè)的垂直軸，A490nm)。圖14B 表示第 6、8、10、12 和 14 級分的 Western 印跡，使用抗 E1E2 MAb D32. 10。 左側(cè)的數(shù)字指示以千道爾頓(kDa)表示的標(biāo)準(zhǔn)參照物(M)的分子量，右側(cè)指示HCV El和E2蛋白。圖14C和14D表示來自基因型la/2a的分離物HCV-Fan的富集HCV的沉淀在蔗糖密度梯度(10%到60% )中等密度離心的結(jié)果。圖14C表示離心后所獲得級分(水平軸) 的密度(左側(cè)的垂直軸，g/ml)和E1E2-D 32. 10反應(yīng)(右側(cè)垂直軸，A棚nm)。圖14D 表示第 6、8、10、12 和 14 級分的 Western 印跡，使用抗 E1E2 MAb D32. 10。對于EIA,將姆個級分稀釋1/10000 (圖4A和4C),對于Western印跡姆個泳道使用 5 U I所選級分(圖4B和4D)。通過折光測定法測定級分的密度并以g/ml表示。在490nm 測定吸光度(A)。當(dāng)超過截止值(對應(yīng)于陰性對照(至少3個值)的均值乘以2. I)吋，則認為EIA的結(jié)果是陽性的。使用Amersham的ECL Plus系統(tǒng)顯示印跡。圖15A、圖 15B 和圖 15CHCV-Fan 沉淀在 I 型 30 到 45%蔗糖梯度(2ml 30%,3ml 35%,3ml 40%,2ml 45% )中的等密度離心(圖15A)。將來自蔗糖梯度(30-45% )峰I (級分8)和2(級分 12和13)的顆粒個別單獨地進行第二次平衡離心(分別是圖15B和15C)。將峰I在2型 30 到 45%蔗糖梯度(3ml 30%,3ml 35%,2ml 40%,2ml 45% )中進行離心(圖 15B)。將峰2在3型30到45%蔗糖梯度(2ml 30%,2ml 35%,3ml 40%,3ml 45% )中進行離心 (圖15C)。通過折光測定法測定級分的密度，以g/ml表示。如前面所述通過間接EIA分析 E1E2-D32. 10 反應(yīng)性。實施例I獲得針對天然HCV病毒包膜的單克降抗體HCV病毒顆粒制備為了獲得良好供應(yīng)的病毒材料，通過血漿取出法進行HCV病毒顆粒的純化。所選擇的患者在由于丙型病毒性肝硬化而進行部分肝移植后，發(fā)展成慢性活動性丙型肝炎，12 個月后與高丙球蛋白血癥相關(guān)的多發(fā)性骨髓瘤是血漿置換的原因?；颊弑憩F(xiàn)出血清轉(zhuǎn)氨酶 (ALT/AST)水平異常升高，并且抗HCV抗體陽性。患者對所有HBV和HIV標(biāo)記均陰性。最初材料的 HCV RNA 含量是 6xl05 拷貝/ml (Amplicor HCV Monitor , Roche Diagnostics, Mey I an, France)，基因型是 Ib (I NNO-LI PA 試驗，Innogenetics, Gent, Belgium)。使用澄清的血漿取出法通過在4°C，210，OOOg連續(xù)兩次超速離心4小時制備富集 HCV 的沉淀。在 Iml Tris-NaCl-EDTA(TNE)緩沖液(20mmol/L Tris-HCl,pH 7. 5, IOOmmol/ L NaCl,lmmol/L EDTA) (240倍濃度)中重懸最終的沉淀，并貯藏在-80°C。這種材料的HCV RNA含量是3xl07拷貝/ml (Monitor, Roche),蛋白濃度是5mg/ml (即，姆毫克蛋白約IO7個 HCV RNA 拷貝)。雜交瘤制備為了產(chǎn)生單克隆抗體(mAb)，用處于完全弗氏佐劑中的IOOii g (IO6個HCV RNA拷貝)HCV-沉淀的材料接種BALB/c小鼠，I周后用處于不完全弗氏佐劑中的100 u g病毒接
16種。三只經(jīng)免疫的小鼠產(chǎn)生較高的抗HCV的血清抗體效價，通過間接酶免疫測定(EIA)檢測。三周后，用50 y g處于磷酸緩沖鹽水(PBS)中的病毒對小鼠進行強化。5天后重復(fù)注射， 3天后取出脾，通過Buttin等(1978)所描述的操作與X63骨髓瘤細胞融合。使用免疫原作為固相(5 ii g/ml)以及偶聯(lián)過氧化物酶的抗小鼠免疫球蛋白的F(ab' ) 2片段(Amersham, France)作為顯示ニ抗(Petit等，1987),通過間接EIA篩選雜交瘤培養(yǎng)物上清液中是否存在HCV特異性抗體。稀釋液含有50%正常人血清(NHS)以消除針對可能與HCV病毒顆粒相關(guān)的NHS蛋白的非特異性反應(yīng)性。然后通過限制性稀釋再克隆對HCV產(chǎn)生最強信號 (P/N > 10)的雜交體并且進ー步測定它們的特異性。選出7個克隆(C9. 19. 16、C2. 22. I、 D32. 10、D3. 20. 12X7. 24. 19X7. 14. 41 和 Cl. 9. 3)，將4個克隆(D32. 10X2. 22. 1、C9. 19. 16 和D3. 20. 12)通過注射到降植烷致敏的BALB/c小鼠中以產(chǎn)生腹水而進行増殖，然后通過用 50%飽和的(NH4)2SO4沉淀，隨后在瓊脂糖凝膠-蛋白G(Pharmacia,France)中通過親和層析進行純化。以本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法通過ELISA測定同種型。所分析的7個克隆產(chǎn)生IgGl同種型抗體。單克隆抗體表征使用間接EIA評價上面所提到的單克隆抗體與病毒顆粒的相互作用。用從KT1到 1(T6稀釋(對應(yīng)于100 V- g/ml到lng/ml)的HCV制劑(姆毫升Img蛋白)包被96孔聚苯 こ烯板(Falcon ;Becton Dickinson France S. A, Le Pont de Claix)。平板在 4°C 過夜孵育，然后用含有5% (w/v)牛血清白蛋白(BSA)的Tris-NaCl (TN)緩沖液(20mM Tris-HCl, pH 7. 5和IOOmM NaCl)飽和。將在TN/BSA緩沖液和50%正常人血清(NHS)的混合物中以 5 u g/ml濃度稀釋的mAbD32. 10添加到每個孔中，并且在37°C孵育2小吋。用偶聯(lián)辣根過氧化物酶(HRPO)的抗小鼠免疫球蛋白的F(ab' )2片段(1/5，000稀釋；Immunotech)以及用鄰苯ニ胺(OPD)和過氧化氫(H2O2)作為底物，檢測結(jié)合的抗體。用ELISA讀板器(MRX， Dynex)在450nm測定光密度(OD)。當(dāng)超過截止值(對應(yīng)于陰性對照的均值乘以2. I)時， 則認為結(jié)果是陽性的。所獲得的7種抗體的確識別病毒顆粒。為了建立mAb的天然多肽特異性,使用免疫原作為抗原探針進行免疫印跡(Petit 等，1987)。在還原條件下(2% SDS+5% 2-ME)，在12. 5%凝膠上進行十二烷基硫酸鈉 (SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上后，對在50% NHS中稀釋的 mAb (2到g/ml)作為ー抗進行檢驗,通過與作為ニ抗的偶聯(lián)過氧化物酶的抗小鼠免疫球蛋白的(Fab' )2片段(1/10，000稀釋，IMMUN0TECH)孵育，檢測結(jié)合的IgG。通過Amersham 的增強化學(xué)發(fā)光(ECL+)系統(tǒng)顯現(xiàn)條帶。除了 D32. 10外，所有被檢驗的mAb在還原條件下與HCV多肽呈陰性反應(yīng)。值得注意的是除了 Cl. 9. 3和C7. 24. 19在EIA中與人IgG微弱地反應(yīng)(大約是陰性值的5倍)夕卜， 所選的mAb既不與人血清白蛋白也不與免疫球蛋白(Ig)的Y或ii鏈反應(yīng)。還通過免疫沉淀檢查7種抗體的多肽特異性。根據(jù)以前所描述的方法(Dubuisson 等，1996)用35S-Translabel (ICN)代謝性標(biāo)記由表達HCV蛋白(E1、E2或E1E2)的痘苗病毒重組體感染的H印G2細胞。用在IOmM Tris-HCl (pH7. 5), 150mM NaCl，和2mM EDTA中的0. 5% NP-40溶解細胞。沉淀用Laemmli樣品緩沖液處理并在還原或非還原條件下通過 SDS-PAGE進行分析(D。所檢驗的單克隆抗體不顯示針對細胞成分的非特異性反應(yīng)性， 除了 C9. 19. 16 ( > 200kDa)、D3. 20. 12 (在70,50和46kDa的3個強條帶)以及更微弱地，C2. 22. l(70、50、46kDa)和D32. 10 (多個非常弱的備帶)(圖1A,對照載體)。當(dāng)兩個HCV糖蛋白分別表達時，所有抗體都特異性免疫沉淀El (BlB)和E2(圖1C)，以及當(dāng)這些蛋白共表達時沉淀E1E2異ニ聚體(圖1D)，。有趣地是，在非還原和還原條件下進行SDS-PAGE后的模式不同(圖1D、1E)。所有抗體都識別ニ硫鍵連接的E1E2聚集體，其在非還原條件下在凝膠的上部檢測到(圖1E)。發(fā)現(xiàn)ー種mAb，D32. 10，主要與聚集體反應(yīng)并且也與E1E2非共價連接的成熟復(fù)合體反應(yīng)(圖1E,非還原條件)。通過Western印跡分析,所有mAb都不識別在異種系統(tǒng)中表達的變性的重組El或E2蛋白，提示它們識別HCV病毒顆粒上的構(gòu)象表位。歸納起來，這些結(jié)果表明這些mAb特異性識別在天然血清來源的HCV病毒顆粒表面表達的ニ硫鍵連接的E1E2復(fù)合體。這非常有可能是由于它們與El和E2蛋白之間共享的構(gòu)象表位反應(yīng)。選擇與在其共價或非共價形式下的E1E2復(fù)合體相互作用的單克隆抗體D32. 10 用于進一歩研究。單克隆抗體D32. 10抗原作圖為了檢驗D32. 10的HCV型特異性，根據(jù)已經(jīng)描述的方法，用從10—1到10_6稀釋(對應(yīng)于100 Ii g/ml到lng/ml)的4種不同HCV制劑(姆毫升I毫克蛋白)進行間接EIA。除了免疫原HCV制劑外，使用從同一患者中獲得的制劑，以及從患有慢性丙型肝炎的2名不同患者中獲得的兩種其它制劑，其中一名患者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在血清中攜帯不同的基因型，即HCVla 和HCV2a。發(fā)現(xiàn)D32. 10能識別所有四種HCV制劑，因此表明其能識別不限于免疫原Ib基因型的抗原決定簇。為了評價D32. 10的天然多肽特異性,進行Western印跡分析。使用未處理的富集 HCV的沉淀作為抗原探針，以不同濃度，從0. I到lmg/ml。將抗原在還原或非還原條件下 (2% SDS±5% 2-巰基こ醇(2-ME))在12. 5%凝膠上進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上后，使用在50% NHS中稀釋的mAb D32. 10 (2到 5 U g/ml)作為ー抗進行免疫印跡。然后通過與作為ニ抗的偶聯(lián)過氧化物酶的抗小鼠免疫球蛋白的(Fab' )2片段(1/10，000稀釋；DAK0)孵育，檢測結(jié)合的小鼠IgG0通過Amersham 的增強化學(xué)發(fā)光(ECL+)系統(tǒng)顯示蛋白條帶。根據(jù)以前Sato等(1993)所描述的方法對循環(huán)的HCV病毒體進行糖苷酶消化。用在IOOmM檸檬酸/磷酸緩沖液(pH 6.0)中的5、10或 20mU/ml的糖苷酶A(肽-N-糖苷酶A或PNGase A ；R0CHE)在37°C對富集HCV的沉淀(HCV-L， 4u g)處理18小時。也通過在37°C在含有內(nèi)切糖苷酶H(Roche的endo H, 5mU/u I) ,20mM ニ硫蘇糖醇(DTT)和0. I % Triton XlOO的50mM醋酸鈉緩沖液(pH 5. 5)中過夜孵育，對純化的HCV病毒顆粒進行去糖基化。除了省略酶外，使用與PGNase A消化或endo H消化相同的條件進行對照消化。然后用含有還原劑的電泳樣品緩沖液處理樣品并通過SDS-PAGE 進行分析。在圖2中顯示W(wǎng)estern印跡實驗的結(jié)果。當(dāng)在還原條件下(2% SDS/5% 2-ME)分析相同樣品的兩個濃度(2. 5和5 ii g，分別是泳道2和3)吋，mAb D32. 10識別68kDa的主要條帶和31kDa的另一條帶，分別對應(yīng)于E2和E1。然而，在非還原條件下，mAb 32. 10識別在凝膠的上部回收的ニ硫鍵連接的復(fù)合體(> 200kDa)。這些高分子量條帶d，泳道I) 非常有可能對應(yīng)于異ニ聚的E1E2復(fù)合體。已經(jīng)顯示天冬酰胺連接的復(fù)合體類型糖鏈存在于HCV天然病毒體的表面(Sato 等，1993)，因此檢查用不同濃度(20、10和5mU/ml)的糖苷酶(PNGase A)處理HCV制劑后D32. IOmAb識別HCV特異性蛋白的能力。如在圖3A(分別是泳道1、2和3)中所示，D32. 10 與El的去糖基化形式，特別是25kDa反應(yīng)，其在最高酶濃度累積。去糖基化后可通過D32. 10 清楚地檢測到El相關(guān)產(chǎn)物，而處理后不能清楚地鑒定E2相關(guān)產(chǎn)物。內(nèi)切糖苷酶H(endo H) 消化允許研究在天然HCV病毒顆粒上表達的E1E2復(fù)合體對endo H切割的敏感性。如在厘 3B中所示，對于E2 (從68到42kDa)和El (從34到24kDa)蛋白都觀察到分子量遷移，提示 El和E2在血清來源的天然HCV病毒顆粒上具有復(fù)雜的糖基化，這可以解釋部分endo H抗性，如endo H抗性復(fù)合聚糖和敏感形式的混合物。D32. 10表位作圖a.肽文庫的篩選為了進一步表征mAb D32. 10識別的表位，使用該抗體篩選十二肽噬菌體展示文庫Ph. D.-12 卩遼菌體展示肽文庫試劑盒購自New England BioLabs Inc.。這是一種與M13噬菌體的小外殼蛋白(pill)融合的組合肽12聚體。在pill的N末端表達所展示的肽12聚體。該文庫由約I. 9xl09個電穿孔的序列構(gòu)成，擴增一次在10 u I所提供的噬菌體中產(chǎn)生約20個拷貝的每個序列。根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明，并作ー些改動，進行3次生物淘選 (biopanning)。簡而言之,將10 y g生物素化的mAb D32. 10偶聯(lián)到用40 y g鏈霉抗生物素包被的35mm聚苯こ烯Petri平皿(Falcon)上。將平皿在4°C過夜孵育并用含有0. 5%吐溫-20 的 50mM Tris,150mM NaCl，pH 7. 5 (TBS) (TBS-T)沖洗6 次。在第一輪選擇中，允許來自最初文庫的41101°個噬菌體與平皿結(jié)合的IgG在搖動的條件下在4°C反應(yīng)4小吋。通過用TBS-T重復(fù)沖洗除去未結(jié)合的噬菌體。然后用400 ill洗脫緩沖液(0. IN HC1，用甘氨酸將pH調(diào)整到2. 2, lmg/ml BSA)從平皿洗脫結(jié)合的噬菌體。用75 yl IM Tris-HCl pH 9. I 中和后，然后根據(jù)使用手冊中的建議，通過感染20ml I 100稀釋的大腸桿菌(E.coli) ER2537(recA+菌株細胞)的過夜培養(yǎng)物，擴增洗脫的噬菌體。將培養(yǎng)物在37°C劇烈振蕩培養(yǎng)4. 5小吋。獲得上清液，并根據(jù)以前所描述的方法(Scott等，1990)用聚こニ醇(PEG) 沉淀。在第二輪和第三輪選擇中，在添加到用IOii g鏈霉抗生物素包被的35nm聚苯こ烯 Petri平皿前，將來自前ー輪的20%擴增噬菌體分別與終濃度為10和InM的生物素化mAb D32. 10在4°C預(yù)先孵育過夜。接下來的操作與第一輪相同。然后克隆并擴增來自第三次生物淘選洗脫液的噬菌體，用于DNA測序和免疫分析。對于DNA測序,根據(jù)Sambrook等(1982)所描述的方法從純化的卩遼菌體制備單鏈 DNA。根據(jù)修改的Sanger (Sanger等，1977)法,使用BigDye 終止子循環(huán)測序Ready反應(yīng)試劑盒(Perkin-Elmer),用 Applied biosystems DNA 測序儀(377A 型)測定基因 III 插入片段的核苷酸序列。用對應(yīng)于PlII基因序列的引物5' H0-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-0H 3/ (SEQ ID N04)進行循環(huán)測序。從核苷酸序列推定插入片段的氨基酸序列。對于上清液噬菌體的ELISA，用100 yl溶于0. IM NaHCO3緩沖液(pH 8. 6)，終濃度為100 u g/ml的mAb D32. 10或不相關(guān)的mAb包被成排ELISA平板孔。將平板在4°C過夜孵育，然后用含有5mg/ml BSA的0. IM NaHCO3緩沖液(pH 8. 6)封閉。在4°C孵育2小時后， 用含有0. 5%吐溫的TBS沖洗平板6次。向微量滴定平板的每個孔中添加每種噬菌體克隆的4倍系列稀釋液，終體積為IOOiU TBS-T,以每排第一個孔IO12個病毒體開始，以第12個孔2xl05個病毒體結(jié)束。將平板在室溫下振蕩孵育2小時，然后如上用TBS-T洗6次。在使用I : 5，000稀釋的偶聯(lián)辣根過氧化物酶的抗M13mAb (Pharmacia)的夾心試驗中，檢測
19結(jié)合的噬菌體。使用含有(PD和H2O2的商業(yè)化顏色試劑盒(bioMerieux)使平板顯色。孵育10分鐘后，用ELISA讀板器在492nm讀取平板。對于每個噬菌體克隆稀釋液，結(jié)果以用所檢驗的抗HCV mAb獲得的值和用無關(guān)mAb獲得的值之間的差異表示。然后通過檢驗一式三份免疫反應(yīng)克隆的最佳稀釋液證實結(jié)果。對于測序分析，通過使用Mac Vector, Ver. 4. 5軟件(Kodak)將肽的氨基酸序列與 HCV El和E2蛋白序列比較。基本上，用LFASTA程序檢測最高相似性的區(qū)域，其試驗性地搜索最佳的局部同一性(Pearson和Lipman, 1988)。三輪選擇后，在指示特異性結(jié)合噬菌體的擴增的洗脫液中發(fā)現(xiàn)4%的噬菌體輸入。 因此，隨機分離88個克隆，對它們的DNA進行測序并且推定插入片段的氨基酸序列。獲得了 48個不同序列，在幾個實例中發(fā)現(xiàn)了其中的ー些序列。然而，當(dāng)在ELISA試驗中檢驗它們與D 32. 10的免疫反應(yīng)性時，其中沒有ー個給出陽性信號，表明結(jié)合親和力太低以至于無法檢測到。將48個克隆序列與HCV El和E2的序列進行比較。分別有5個和3個序列顯示與位于292-305區(qū)和347-356區(qū)的El殘基相似(在表I中以粗體指示相似)，而分別有7個、4個和2個序列與E2位于481-501、610-631和685-698區(qū)的殘基共有ー些相似性 (在表2中以粗體指示相似)。b.肽合成為了評價在El和E2序列上這些不同定位的意義，復(fù)制El的291-315和347-356 區(qū)以及E2的473-498、607-627和686-697區(qū)，作為偏移一位的重疊的合成十五肽，并檢驗它們與D32. 10的免疫反應(yīng)性。在硝酸纖維素膜上使用9-芴基甲氧羰基氨基酸化學(xué)(Frank，1988)同時合成不同的肽序列。產(chǎn)生適于免疫學(xué)檢測的納摩爾量的每種肽。根據(jù)以前所描述的方法 (Jolivet-Reynaud, 1998)通過間接比色免疫測定分析抗體對膜結(jié)合肽的反應(yīng)性。對應(yīng)于具有抗體反應(yīng)性的肽的點產(chǎn)生陽性藍色信號。通過顯示觀察估計點的強度并且用從0到5等級的相對強度表示。用與292-305 El區(qū)對應(yīng)的肽獲得強陽性信號，而347-356 El區(qū)沒有被D32. 10識別。分別與E2區(qū)482-499和612-626對應(yīng)的肽也與D32. 10發(fā)生免疫反應(yīng)，用E2區(qū)686-697 沒有檢測到信號。在ELISA中El的292-306區(qū)以及E2的480-494和608-622區(qū)作為十五肽與D32. 10相互作用。通過使用重疊的十五肽，HCV El蛋白的297RHWTTQGCNC3°6(SEQ ID N0:1)區(qū)以及 HCV E2 蛋白的613YRLWHYPCT621(SEQ ID NO 3)和48。PDQRPYCWHYPPKPC494 (SEQ ID NO 2)兩個區(qū)都與D32. 10反應(yīng)。在E2中所鑒定的這兩個區(qū)含有由Yagnik等(2000)提出的在E1E2 的異ニ聚體化中涉及的相同基序WHYP。區(qū)分這些區(qū)域很困難，但是作為兩個非重疊區(qū) 479Gpdqrpyc486 (seq id no:26)和 487whyppkpc494 (seq id no:27)分別結(jié)合D32.10，這提示 D32. 10特異性識別每種八肽，因此識別整個序列(480-494)。實施例2血清來源HCV病毒顆粒的表征和純化為了分離不同的HCV群，將最終的富集HCV的沉淀在蔗糖密度梯度(10到60%， w/w)中進行等密度離心(在4°C，210，OOOg離心48小吋)。收集級分(0. 6ml)，通過折光測定法測定姆種級分的密度。通過定量RT-PCR (AmpIicor Monitor, Roche)分析HCV-RNA含量,用Ortho-Clinical Diagnostics試驗測定HCV核心蛋白含量并通過間接EIA測定HCV 病毒顆粒對mAb D32. 10的抗原反應(yīng)性。除了用從KT1到10_4稀釋的不同級分包被孔，如上所述進行間接EIA。鑒定了三個不同群(圖4)。ー個群(級分3到5)在I. 06-1. 08g/ml的蔗糖密度形成條帶，并且通過用D32. 10的間接EIA所獲得的陰性結(jié)果證實實質(zhì)上缺乏病毒包膜，但是含有HCV RNA(約2. 105UI/ml)和HCV核心蛋白(從約2到4pg/ml)。這些似乎是無包膜的病毒顆粒。另ー個群(圖中級分8到10)在I. 14-1. 15g/ml的蔗糖密度形成條帶，并且實質(zhì)上缺乏HCV RNA (低于約IO4到105UI/ml)和HCV核心蛋白(約lpg/ml)，但是含有高水平的對D32. 10反應(yīng)的顆粒(從約I到3. 8 OD450nm單位)。這些HCV亞病毒顆粒似乎僅含有 HCV病毒包膜。第三群(級分11到14)在I. 20-1. 21 g/ml的蔗糖密度形成條帶，含有具有高水平HCV RNA (高于約5. IO5到106UI/ml)和HCV核心蛋白(從約2. 5到8pg/ml)以及對 D 32. 10反應(yīng)(從約0. 5到I. 50D450nm單位)的顆粒。因此，這群實質(zhì)上僅含有純化的HCV 有包I吳的完整病韋顆粒。通過D32. 10免疫沉淀在富集HCV的沉淀(圖5A)，以及在第二群(圖5C)和第三群(圖5B)中含有的病毒顆粒，并通過電子顯微鏡觀察。通過這種方法已經(jīng)分析了幾種HCV 病毒顆粒制劑。HCV有包膜的亞病毒顆粒表現(xiàn)為平均直徑約30nm(33.08nm)的球形顆粒 (圖5C)，而HCV有包膜的完整病毒顆粒同樣表現(xiàn)為球形，但是平均直徑約50nm(48. 72nm) (圖 5B)。實施例2bis血清來源的HCV病毒顆粒的表征和純化本發(fā)明人對感染患者血漿中存在的HCV病毒群還進行了另ー項分析。血清來源的HCV顆粒的純化使用實施例I中所獲得的富集HCV的沉淀(HCV-L)用于物理化學(xué)、免疫學(xué)和形態(tài)學(xué)研究，以及來自另ー個患者的血漿取出法的沉淀(HCV-Fan，基因型la/2a)，其顯示出患有慢性丙型肝炎(CH-C)，具有與嚴(yán)重的皮膚脈管炎相關(guān)的II型冷球蛋白血癥，需要定期血漿置換。如同對于HCV-L患者，后面的HCV-Fan患者顯示血清轉(zhuǎn)氨酶(ALT/AST)水平異常升高，抗HCV抗體陽性，對所有HBV和HIV標(biāo)記陰性。由此表征了 7種制劑。它們在定量Amplicor HCV RNA Monitor試驗(Roche)中對于從 106UI/ml 到 2-3xl07UI/ml 的 HCV RNA(HCV-Fan, HCV-L)陽性，對應(yīng)于 2. 5xl06 拷貝 /ml 到 5-7. 5x IO7 拷貝 /ml。為了分離不同HCV群，將最終的富集HCV的沉淀在蔗糖密度梯度(10到60%或者 30到45%，w/w)中進行等密度離心(在4°C，200，OOOg離心48小時)。收集級分(0.6ml)， 通過折光測定法測定姆種級分的密度。通過定量RT-PCR (Amplicor Monitor, Roche)監(jiān)測 HCV-RNA含量。如上所述，在固相上每種級分以不同稀釋度(1/10到1/10000)包被后，使用MAb D32. 10通過間接EIA檢測HCV包膜(env)反應(yīng)性。通過使用定量Ortho試驗和利用抗核心單克隆抗體混合物(7G12A8、2G9A7和19D9D6)的western印跡，測定HCV核心抗原(Jolivet-Reynaud 等，1998 ；Menez 等，2003)。簡要地說，通過使用0rthoR trak-C 試驗(Ortho-Clinical Diagnostics, Inc)測量在富集HCV的沉淀和在從蔗糖梯度中收集的每種級分中的總HCV核心抗原。Orthc/ trak-C 試驗是ー種定量免疫捕獲試驗，使用對HCV核心抗原的不同區(qū)域具有特異性的幾種單克隆抗體。該方法使用預(yù)處理步驟以使得樣品制劑游離、免疫復(fù)合，以及使病毒體相關(guān)抗原可以測定(Aoyagi 等，1999)。通過由 Roche Molecular System(Meylan,France)開發(fā)的定量RT-PCR，Amplicor HCV Monitor ，評價HCV RNA。擴增步驟涉及單管、單酶(rTth DNA聚合酶)、單引物對組合的反轉(zhuǎn)錄和DNA聚合作用(Colucci和Gutekunst, 1997)。通過比色微孔平板試驗進行檢測。PCR樣品遺留污染的控制包括AmpErase ，其已被摻入到試驗中用以滅活污染的擴增的DNA(Longc)等，1990)。首先將富集HCV的沉淀在蔗糖密度梯度(10%到60% )中進行等密度離心。通過上述間接EIA方法(圖14A和14C)和使用抗E1E2 MAb D32. 10 (其特異性先前已在實施例 I中詳細定義)的western印跡(圖14B和14D)調(diào)查是否存在顯示E1E2-D32. 10反應(yīng)性的有包膜的病毒顆粒。如在圖14A和14C中所示，在EIA(級分稀釋1/10000)中E1E2-D32. 10 反應(yīng)性從級分9 (密度為I. 12g/ml)到級分16(密度為1.23g/ml)回收，峰在I. 12和I. 17g/ ml之間，“肩”從I. 18到I. 23g/ml。在對應(yīng)低密度復(fù)合物(I. 006到I. 10g/ml)的級分中沒有檢測到或者檢測到非常低的D32. 10反應(yīng)性(級分稀釋1/10)。用基因型Ib的分離物 HCV-L(圖14A)和用基因型Ia/2a的分離物HCV-Fan(圖14C)獲得類似結(jié)果。將分離物 HCV-L的一些級分(6、8、10、12、14)(圖14B)和分離物HCV-Fan的所有級分(4到18)進行 SDS-PAGE并用MAb D32. 10進行western印跡。從級分8 (密度#1. 10g/ml)到梯度的底部清楚地顯現(xiàn)E1E2-D32. 10反應(yīng)性。值得注意的是，在與I. 17到I. 20g/ml的密度對應(yīng)的級分11、12和13中觀察到最強的E1E2反應(yīng)性(圖14D)。在這些級分中可檢測到更高分子量 (HMW)條帶，可能對應(yīng)于在這種密度下形成條帶的病毒顆粒表面上存在的El和E2包膜糖蛋白的寡聚形式。在級分9(密度為I. 13g/ml)中觀察到針對E2和El兩者的另ー強反應(yīng)性， 對應(yīng)于EIA中的峰(圖14C)。所有血清來源的HCV制劑在蔗糖密度梯度(10到60% )中給出相同的E1E2-D 32. 10反應(yīng)性平衡條帶分布圖。為了進一步表征有包膜的HCV群，將HCV-Fan沉淀在I型30到45%的蔗糖梯度 (2ml 30%,3ml 35%,3ml 40%,2ml 45% )中進行等密度離心。在這些實驗條件下，如在圖15A中所示，可清楚地見到兩個E1E2-D32. 10反應(yīng)性峰。間接EIA顯示第一個窄峰(峰 I)在約I. 15g/ml密度處，第二個寬大峰(峰2)在約I. 18g/ml到I. 22g/ml密度處。將來自蔗糖梯度(30-45%)峰1(級分8)和2(級分12和13)的顆粒單獨地進行第二次平衡離心。峰I在2型30到45%鹿糖梯度(3ml 30%>3ml 35%>2ml 40%>2ml 45% )中離心 (圖15B)。僅有ー個窄的E1E2抗原峰(峰I)遷移到I. 13到I. 14g/ml的密度(約32% 蔗糖，級分5和6)。峰2在3型30到45%蔗糖梯度(2ml 30%,2ml 35%,3ml 40%,3ml 45% )中離心(圖15C)。主峰(峰2)沉降更快，在約I. 18g/ml密度處(對應(yīng)于40%蔗糖)顯示最大E1E2抗原性。后面的E1E2抗原峰(峰2)顯示不對稱，向較低密度移動，并且與在I. 14g/ml蔗糖密度形成條帶的E1E2群(峰I)輕微重疊，提示比前者E1E2抗原峰 (峰I)更大的異質(zhì)性(圖15B、15C)。為了闡明在兩群E1E2包被病毒顆粒(峰I和峰2)之間浮力密度的差異，通過 Ortho HCV核心試驗(圖9A)和通過Western印跡(圖15B)檢驗上述I型30到45%蔗糖梯度級分的HCV核心抗原。
簡要而言，使用HCV樣品作為抗原探針(1-5 U g/ml)，通過免疫印跡測定多肽特異性。在還原條件下(2% SDS+5% 2-ME)在12. 5%凝膠上進行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上后，使用在50% NHS中稀釋的抗E1E2 MAb D32. 10 (2 到 5 ii g/ml)或杭-核心 MAb 7G12A8、2G9A7 和 19D9D6 (各 5 y g/ml)作為ー抗，然后通過與作為ニ抗的偶聯(lián)HRPO的抗小鼠免疫球蛋白的(Fab' )2片段(1/10，000稀釋；購自Immunotech)孵育,檢測結(jié)合的IgG。印跡用Amersham的增強化學(xué)發(fā)光(ECL Plus)系統(tǒng)顯色。兩種實驗方法均顯示在大約I. 17到I. 19g/ml密度(40%蔗糖)的第二 E1E2抗原峰(峰2)中回收最大HCV核心抗原反應(yīng)性。通過在Western印跡(圖9B)的分析,在最初的材料(HCV-Fan沉淀)和級分8到13中鑒定了 25kDa的HCV核心蛋白。也檢測到在 50,75和150kDa的條帶，其可能對應(yīng)于HCV核心基因編碼產(chǎn)物的寡聚體。通過定量RT-PCR Monitor試驗(Roche)，在來自最初10到60%蔗糖梯度的所有級分中分析HCV RNA(圖10)。 在I. 055到I. 075g/ml的密度以及在I. 16到I. 21 g/ml的密度出現(xiàn)兩個病毒RNA峰。后面峰的總效價是106IU/ml，對應(yīng)于第二 E1E2抗原峰(峰2)。相比之下，級分9 (密度為I. 13g/ ml)，其對應(yīng)于峰1，含有最低效價的HCV RNA0因此，峰2 (大約I. 17到I. 20g/ml)含有E1E2 復(fù)合體、HCV核心蛋白、高效價HCV RNA并且可能代表完整病毒體。峰I (I. 13到I. 15g/ml) 主要含有E1E2復(fù)合體，并且可能代表亞病毒顆粒(SVP)。低密度復(fù)合物(I. 006到I. IOg/ ml)僅含有核心和HCV RNA，對應(yīng)于裸核殼。因此，使用本發(fā)明的D32. 10單克隆抗體，已經(jīng)分析了在慢性丙型肝炎患者的血清中發(fā)現(xiàn)的最普遍類型的有包膜的病毒顆粒。通過濃縮的病毒材料在蔗糖梯度中的沉降，通過免疫測定和免疫印跡分析蛋白組成(核心和包膜蛋白)，結(jié)合通過定量RT-PCR監(jiān)測HCV RNA，分別鑒定了在I. 13-1. 15g/ml和I. 17-1. 21 g/ml兩種不同密度沉降的兩群E1E2包被的顆粒。第一群對應(yīng)于含有El和E2包膜蛋白，但是缺乏核殼的亞病毒顆粒(SVP)。第二群可能對應(yīng)于HCV病毒體，因為這些顆粒含有El和E2包膜蛋白、核心蛋白和高效價的HCV RNA。血清來源HCV顆粒的形態(tài)學(xué)表征根據(jù)下列方法進行E1E2 (D 32. 10)-特異性單克隆抗體的免疫沉淀后HCV-Fan沉淀的電子顯微鏡術(shù)(免疫電子顯微鏡術(shù)或IEM)。簡要而言，將血清來源的HCV制劑(2、20或200ii g)或來自梯度的級分(0. Iml)與
0.Iml MAb D32. 10(5u g)或同一同種型(IgGl)的無關(guān)單克隆抗體(F35. 25，HBV抗-preSl) (Petit等，1989)混合。在37°C孵育I小時，然后在4°C孵育16小吋。接著將混合物在 IOmlTNE緩沖液中稀釋并在48，OOOg離心I小吋。將沉淀在0. Iml TNE緩沖液中重懸。將 D32. 10-免疫沉淀的HCV顆粒吸附5分鐘到glow-discharged Formvar/碳包被的cupron 格柵上并用I %こ酸雙氧鈾(pH 4.5)染色4分鐘。然后使用JEOL 100CX電子顯微鏡 (Imaging facility,Laennec Faculty,Lyon,France)觀察該制劑。對于間接免疫金標(biāo)記， 用作為ニ抗的山羊抗小鼠I gG膠體金顆粒的I : 50稀釋液(直徑IOnm5Bi0Cell Research Laboratories)鮮育格棚。對照實驗顯示制劑的大小不均勻隨著抗原抗體比而變化(結(jié)果沒有顯示)。為了保持形態(tài)完整，HCV顆粒的分離過程僅涉及沉淀和蔗糖梯度離心。在這種實驗條件下，如在圖IlA中所示，獲得相對較好限定的顆粒大小分布圖。不對稱的峰集中在約35nm。這種大小 (30到40nm)的顆粒占大多數(shù)(56% )?；旧辖^大多數(shù)顆粒(80% )直徑大于30nm，平均值為38. 28nm(156個顆粒中的125個)，其中的20%在40到50nm之間(均值=43. 61nm),4% 在50和60nm之間(均值=55. 69nm)。所有顆粒中僅20%直徑小于30nm (均值=26. 35nm)。 電子顯微鏡照片(圖11B)顯示HCV顆粒以相對規(guī)則的光滑表面為特征。圖UB a和b組， 例示了 HCV有包膜的顆粒的大小不均勻性。圖UB c組顯示直徑50nm的顆粒，d組顯示那些顆粒直徑35nm。在35nm的顆粒表面上出現(xiàn)相當(dāng)同質(zhì)的更高密度(圖11B, d組)，而在 50nm直徑的顆粒中央可清楚地觀察到更低密度的更亮區(qū)(圖llB，c組)。當(dāng)使用無關(guān)的第一單克隆抗體時，通過IEM沒有觀察到顆粒(圖11B, e組)。對蔗糖梯度峰I和2的顆粒進行免疫沉淀、染色以及通過IEM進行分析(圖12A-12B)。如在圖12A中所示，峰I中的絕大多數(shù)(85. 4% )是直徑約20nm的球形顆粒(41個顆粒中有35個，平均值=20. 6nm)。僅 14. 6%的顆粒直徑大于30nm，可能對應(yīng)于與峰2的重疊。峰2似乎比峰I材料大小更不均勻(圖12B)。然而，在這群中最普遍的形式(77.5%)的平均直徑約41nm(89個顆粒中有 69個，均值=41. 15nm)，其可能對應(yīng)于整個HCV病毒體的直徑。在這種制劑中可見到ー些較小的30nm直徑的顆粒(13. 5% )，可能由于與峰I的重疊所致。異質(zhì)的主要的較快沉降峰(峰2)主要由35和50nm直徑的大顆粒組成，而同質(zhì)的次要的較慢沉降峰(峰I)主要由大約20nm直徑的小顆粒組成。總的說來，形態(tài)學(xué)研究表明兩種大小類別的E1E2包被的 HCV顆粒共同存在于感染患者的血清中。通過間接免疫金標(biāo)記(圖13)，所有球形有包膜的顆粒，先前通過IEM鑒定,都特異性固定IOnm金標(biāo)記的ニ抗。因此，通過用MAb D32. 10的免疫-電子顯微鏡術(shù)，測定總的有包膜的群(富集HCV 的沉淀)以及每種E1E2群各自的相對較好限定的顆粒大小分布。有包膜的HCV顆粒大小上不均勻，但是可容易地鑒定兩個不同大小類別的顆粒。多數(shù)種類由直徑從35nm到50nm變化的大顆粒構(gòu)成，可能視包膜的晶格結(jié)構(gòu)而定，對應(yīng)于完整的含有衣殼的有包膜顆粒。另ー 種更同質(zhì)的種類由直徑約20nm的小顆粒構(gòu)成,對應(yīng)于無衣殼的SVP。進ー步鑒定結(jié)合MAb D32. 10的所有這些顆粒并使用用抗小鼠IgG-金顆粒的間接標(biāo)記，通過電子顯微鏡術(shù)觀察。除了感染性的病毒體外還形成非感染性SVP是黃病毒感染的共同特征(Russel 等，1980)。已提出這些代表無衣殼的空病毒包膜(Mason等，1991)。其也發(fā)生在感染こ型肝炎病毒(HBV)的細胞中，以及通過單獨表達包膜蛋白生產(chǎn)分泌的SVP(Laub等，1983)。這些顆粒小于病毒體。這證明這些蛋白在存在或缺乏核心時內(nèi)在地能夠自我形成特異性微粒結(jié)構(gòu)。這些顆粒裝配并經(jīng)歷與整個病毒體相同的成熟過程，包括糖基化和碳水化合物加工。 用這種重組包膜SVP的免疫顯示它們在動物模型中(Konishi等，1992 ；Heinz等，1995)和在人中(Leroux-Roels等，1994)是極好的保護性免疫原。完整病毒體和SVP 與 MAb D32. 10 的反應(yīng)性顯示，El (297-306)-E2 (480-494) (613-621)構(gòu)象表位以基本上相同的方式呈現(xiàn)在HCV病毒體和SVP的表面上。然而，在通過基因重組獲得并在異種系統(tǒng)棒狀病毒/昆蟲細胞(Baumert等，1999)或反轉(zhuǎn)錄病毒/293 T細胞(Bartosch等，2003)中生產(chǎn)的顆粒上缺乏在血清來源的病毒體和SVP上檢測到的這種表位，提示這種復(fù)合位點缺乏和/或存在于這些重組HCV顆粒表面上分開的難接近的區(qū)域上。前者HCV樣顆粒(HCV-LP)保留在ER中，后者HCV假顆粒(HCVpp)中僅有ー小部分到達細胞表面。值得注意的是MAb D32. 10既不與HSA也不與免疫球蛋白的Y或U鏈反應(yīng)。其能夠特異性免疫沉淀E1、E2以及E1E2異ニ聚體，當(dāng)這兩種蛋白分別或者一起由痘苗病毒重組體在H印G2細胞中表達時。其因此主要與ニ硫鍵連接的聚集體反應(yīng)，與E1E2非共價連接的成熟復(fù)合物的反應(yīng)更微弱。然而，通過印跡分析，其不識別在這種異種系統(tǒng)中所表達的變性的重組El或E2蛋白。這有利于在血清來源的病毒表面上E1、E2和E1E2的排列， 其不同于在重組HCV顆粒中發(fā)現(xiàn)的排列。天然結(jié)構(gòu)依賴于裝配條件。如果在異種系統(tǒng)中缺乏調(diào)控獨特結(jié)構(gòu)形成的條件，那么當(dāng)兩者都分離自感染患者的血清時，與SVP和病毒體表面的相似形成對照，VLP和HCVpp中二聚體的排列不相似。在重組亞病毒顆粒(RSP)和病毒體中，黃病毒包括蜱傳腦炎病毒(TBEV)的包膜蛋白(E)包裝的ー個特別值得注意的特征是，它們以頭到尾的取向平躺在病毒表面上(Ferlengi等，2001)。結(jié)構(gòu)域III上的側(cè)表面， 其具有Ig樣折疊并參與受體結(jié)合，容易接近，而融合肽是ー種內(nèi)環(huán)(Rey等，1995)。因此， 黃病毒通過受體介導(dǎo)的胞吞作用和在內(nèi)體中低pH誘導(dǎo)的融合進入細胞(Rice，1996)。據(jù)信正在裝配的顆粒通過經(jīng)由ER或早期分泌途徑的中間區(qū)室的膜出芽而獲得其包膜。顆粒然后通過高爾基體外側(cè)網(wǎng)絡(luò)(TGN)被運輸?shù)劫|(zhì)膜，成熟并因此獲得復(fù)合糖。所有這些步驟對于病毒裝配都是關(guān)鍵的，并且在復(fù)制循環(huán)的許多階段中都起著決定性的作用。出乎意料地，所有HCV顆粒似乎都顯示相似的生物物理屬性，無論它們來源為何。 在昆蟲細胞中裝配的、來自HCV-J株cDNA或來自感染性克隆H77c的HCV-LP的蔗糖梯度沉降模式在蔗糖平衡梯度中是I. 14到I. 20g/ml (ffellnitz等，2002)。大多數(shù)顆粒的直徑是 40到60nm。然而，在HCV-LP外表面的El和E2胞外域上存在的所有表位(ffellnitz等， 2002)與MAb D32. 10的El和E2特異性不同。因此，即使顆粒在蔗糖中以同一密度沉降，它們也具有不同的免疫反應(yīng)性，其可能與不適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)運和/或折疊有關(guān)，并且在細胞結(jié)合和感染性方面將明顯地導(dǎo)致不同的功能特性。與血清有包膜的HCV顆粒相反，從感染HCV個體的血漿中分離的HCV核心顆粒似乎與在昆蟲細胞中所生產(chǎn)的核殼樣顆粒相似。HCV核殼在CsCl梯度中I. 32到I. 34g/ml的密度形成條帶，并且在大小上非常不均勻，直徑從38到62nm (Mai I Iard等，2001)。所有這些顆粒都與抗核心MAb反應(yīng)，但是不與通過用重組蛋白免疫所產(chǎn)生的抗El和抗E2 MAb反應(yīng)(Deleersnyder 等，1997 ；Dubuisson 等，1994)。因此，不同類型的HCV相關(guān)顆粒(HCV-LP、血清HCV核殼、血清HCV病毒體)在大小和/或密度上具有ー些相似之處，但是顯示不同抗原特性(E1E2復(fù)合體、有包膜的病毒體或無包膜核殼的不適當(dāng)?shù)幕蜻m當(dāng)?shù)恼郫B)。因此，總之這證明具有好的免疫學(xué)工具對于分析 HCV顆粒的真實抗原性質(zhì)很重要，同樣地對于鑒定天然HCV病毒體也很重要。根據(jù)這些數(shù)據(jù)和其它人的那些數(shù)據(jù)(Andre等，2002 ;Maillard等，2001)，能獲得更多關(guān)于在慢性丙型肝炎患者血清中循環(huán)的不同形式HCV相關(guān)顆粒的完整譜知識。蔗糖梯度中的低密度級分(1.06g/ml)含有衣殼樣結(jié)構(gòu)，與脂蛋白結(jié)合形成脂-病毒-顆粒(LVP)， 以及視個別變異而定與HCV RNA和免疫球蛋白結(jié)合(Andre等，2002)。LVP表現(xiàn)為直徑大于 IOOnm的大顆粒，通過LDL受體結(jié)合肝細胞系(Andre等，2002)。從去污劑處理的血清中分離的無包膜的HCV核殼在CsCl中的浮力密度是I. 32到I. 34g/ml，大小上不均勻(Maillard 等，2001)，最近表明其顯示F YR樣活性(Maillard等，2004)，這可解釋含有HCV RNA的顆粒與“非免疫”抗體結(jié)合作為在蔗糖梯度中高密度(I. 28到I. 35g/ml)的HCV核心-IgG復(fù)合物。中間密度的級分，在I. 13到I. 21 g/ml之間，這里鑒定為E1E2包被的HCV顆粒。假
25定的整個HCV病毒體(由核殼、脂膜以及兩個El和E2包膜糖蛋白構(gòu)成)的平均密度(I. 18 到I. 20g/ml)，與黃病毒的平均密度相似(Bradley等，1991)。從MAb D32. 10的精細特異性推出的側(cè)面包膜蛋白相互作用的假設(shè)也與來自TBEV的重組SVP和整個病毒顆粒的包膜的組織相似(Schalich等，1996)。最后，在感染HCV患者血清中存在僅含有E1E2包膜蛋白， 顯示不同沉降性質(zhì)(I. 13到I. 15g/ml)以及不同顆粒大小20nm)，但是與整個病毒顆粒具有相似抗原特征的SVP，這支持HCV和黃病毒之間的ー些相似性?？傊?通過使用新的MAb D32. 10，第一次鑒定了 (i)HCV完整病毒體，含有HCV RNA和核心抗原，在其表面上表達E1E2包膜復(fù)合物， 作為“大顆?！?，直徑35-50nm并在I. 17-1. 21 g/ml形成條帶；(ii)包膜SVP的HCV群，作為“小顆粒”，缺乏衣殼和HCV RNA,直徑20_30nm并在 I. 13-1. 15g/ml 形成條帶。這種有包膜的顆?？赡芤虼舜硌芯縃CV包膜糖蛋白結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的相關(guān)模型，并且是接種方法的極好候選物。另外，在不同組患者中以及在HCV相關(guān)疾病的不同階段進ー步追蹤循環(huán)HCV顆粒的譜將會是有趣的。實施例3獲得針對純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的單克隆抗體將在蔗糖密度梯度中進行等密度離心、含有純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的上面所提到的富集HCV沉淀的級分，用于制備單克隆抗體。將這種級分用于免疫小鼠井根據(jù)上述說明分離雜交瘤。由此獲得ー種單克隆抗體，(D4. 12. 9)，其顯示出特異性識別天然 HCV E2蛋白，在Western印跡實驗中(圖6),和天然HCV病毒顆粒，如在實施例2中證實的 (MD。事實上，Ml顯示D4. 12. 9以與D32. 10相似的方式識別HCV有包膜的亞病毒顆粒 (級分8到11)和HCV有包膜的完整病毒顆粒(級分11到14)。實施例4來自感染患者的抗HCV抗體的表位表征通過使用包括它們本身的肽，評價El和E2衍生的與D32. 10反應(yīng)的肽序列(實施例I)對感染HCV患者的血清的免疫反應(yīng)性。生產(chǎn)El (第290-317位氨基酸)和E2 (第471-500位和第605-629位氨基酸)序列作為生物素化的合成肽，通過ELISA用11份健康個體的血清和44份感染HCV患者的血清(編為Al到A44)進行檢驗。用100 ill溶于0. IM碳酸鹽緩沖液(pH 9. 6)，濃度為10 U g/ml的鏈霉抗生物素在 4°C過夜包被微量滴定平板孔，并用含有10%山羊血清的PBS在37°C封閉I小吋。然后在加入IOOiU生物素化肽溶液(在PBS中IOii g/ml)在37°C孵育2小時前，用含有0. 05% 吐溫-20的PBS洗滌平板三次。用PBS-吐溫新沖洗后，加入100 u I在含有10%山羊血清的PBS-吐溫中I : 50稀釋的檢驗血清，并且在37°C孵育2小吋。再次用PBS-吐溫沖洗平板。然后加入在PBS-吐溫-山羊血清中I : 5000稀釋的ニ杭-偶聯(lián)過氧化物酶的山羊抗人 IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories)。平板在 37°C孵育 I 小時，然后用 PBS-吐溫再沖洗一次。使用含有鄰苯ニ胺和過氧化氫的Biomerieux顏色試劑盒使平板顯色。孵育10分鐘后，用ELISA讀板器在492nm讀取平板。報告值是一式三份的平均0D。計算每種肽的截止識別(用HCV陰性血清獲得的均值+3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差)。其允許證
26明44份HCV陽性血清中有6份產(chǎn)生抗El (第290-317位氨基酸)(圖8A)、44份中有6份產(chǎn)生抗E2 (第471-500位氨基酸)(圖8B)以及44份中有16份產(chǎn)生抗E2 (第605-629位氨基酸)(圖8C)的陽性反應(yīng)。血清A7、A14、A21、A33、A39和A40與這三種肽產(chǎn)生陽性信號，而E2 (605-629)也被10份更多血清識別。在感染HCV患者血清中存在能與由D32. IOmAb識別的El和E2的三個區(qū)域同時反應(yīng)的特異性抗體，強烈支持它們在循環(huán)的有包膜的HCV病毒顆粒表面的毗鄰以及它們在小鼠和在人中的免疫原性。本發(fā)明包含下述內(nèi)容I.能特異性結(jié)合天然HCV病毒包膜的構(gòu)象抗體。2.根據(jù)項目I的構(gòu)象抗體，能夠特異性結(jié)合天然HCV E2蛋白。3.根據(jù)項目I或2的構(gòu)象抗體，能夠中和患者的HCV感染。4.根據(jù)項目I到3中任何一項的構(gòu)象抗體，能夠沉淀在其共價或非共價形式下的 HCV E1E2復(fù)合體。5.根據(jù)項目I到4中任何一項的構(gòu)象抗體，能夠特異性結(jié)合天然HCV El蛋白。6.根據(jù)項目I到5中任何一項的構(gòu)象抗體，能夠特異性結(jié)合天然HCV El蛋白、結(jié)合天然HCV E2蛋白以及能夠沉淀在其共價或非共價形式下的HCV E1E2復(fù)合體。7.根據(jù)項目I到6中任何一項的構(gòu)象抗體，能夠特異性結(jié)合由下列序列中的至少一種構(gòu)成的表位-HCV 蛋白 El 第 297 到 306 位氨基酸(SEQ ID NO 1)；-HCV 蛋白 E2 第 480 到 494 位氨基酸(SEQ ID NO 2)；-HCV 蛋白 E2 第 613 到 621 位氨基酸(SEQ ID NO :3)。8.根據(jù)項目7的構(gòu)象抗體，能夠特異性結(jié)合由下列序列中的每ー種構(gòu)成的表位-HCV 蛋白 El 第 297 到 306 位氨基酸(SEQ ID NO 1)；-HCV 蛋白 E2 第 480 到 494 位氨基酸(SEQ ID NO 2)；-HCV 蛋白 E2 第 613 到 621 位氨基酸(SEQ ID NO :3)。9.根據(jù)項目I到8中任何一項的構(gòu)象抗體，其中所述的抗體是單克隆抗體。10.根據(jù)項目I到9中任何一項的單克隆抗體，由2003年3月19日在 CNCM(Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris, France)保藏的登錄號為CNCM 1-2983的雜交瘤分泌。11.根據(jù)項目I到9中任何一項的單克隆抗體，由2003年3月19日在 CNCM(Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris, France)保藏的登錄號為CNCM 1-2982的雜交瘤分泌。12.2003 年 3 月 19 日在 CNCM(Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris, France)保藏的登錄號為 CNCM 1-2983 的雜交瘤。13.2003 年 3 月 19 日在 CNCM(Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris, France)保藏的登錄號為 CNCM 1-2982 的雜交瘤。14.藥物組合物，包含至少ー種項目I到11的抗體作為活性物質(zhì)和藥學(xué)上可接受的載體。15.至少ー種項目I到11的抗體用于制備診斷、預(yù)防或治療HCV感染的藥物的用途。16.能結(jié)合至少ー種項目10或11的抗體的有包膜的病毒顆粒。17.結(jié)合項目16的有包膜的病毒顆粒的抗體。18.源自人血液、血漿或血清最初樣品的HCV病毒顆粒的組合物，其中HCV RNA拷貝的濃度比其來源的人血液、血漿或血清最初樣品中的HCV RNA拷貝濃度高約100到1000 倍，特別是高于約IO7拷貝/ml。19.根據(jù)項目18的組合物，其中HCV RNA拷貝數(shù)是從每毫克蛋白約IO8到約109UI。20.根據(jù)項目18或19的組合物，其中所述組合物的體積是從約0. Iml到約IOml。21.實質(zhì)上缺乏HCV RNA和缺乏HCV核心蛋白的分離的HCV有包膜的亞病毒顆粒。22.根據(jù)項目21的分離的HCV有包膜的亞病毒顆粒，其中所述亞病毒顆粒易于結(jié)合項目I到11的任何抗體。23.組合物，其包含純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒，所述純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒含有HCV RNA、HCV核心蛋白和HCV包膜，并且易于結(jié)合項目I到11的任何抗體。24.制備HCV病毒顆粒的組合物的方法，包括下列步驟-對從HCV感染患者的澄清的血漿取出法得到的樣品進行至少兩次超速離心，以獲得富集HCV的沉淀；-在水溶液中重懸富集HCV的沉淀以獲得HCV病毒顆粒的組合物。25. HCV病毒顆粒的組合物，如根據(jù)項目24的方法獲得。26.制備HCV有包膜的亞病毒顆粒的組合物的方法，包括下列步驟-對從HCV感染患者的澄清的血漿取出法得到的樣品進行至少兩次超速離心，以獲得富集HCV的沉淀；-在水溶液中重懸富集HCV的沉淀；-在蔗糖密度梯度中超速離心重懸的富集HCV的沉淀以將重懸的富集HCV的沉淀的組成成份根據(jù)它們的密度分離成級分；-回收實質(zhì)上不含HCVRNA、實質(zhì)上不含HCV核心蛋白以及含有能結(jié)合權(quán)利要求10 或11的單克隆抗體的顆粒的級分，特別是蔗糖密度為大約I. 13到I. 15g/ml的級分，以獲得HCV有包膜的亞病毒顆粒的組合物。27. HCV有包膜的亞病毒顆粒的組合物，如根據(jù)項目26的方法獲得。28.制備純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的組合物的方法，包括下列步驟-對從HCV感染患者的澄清的血漿取出法得到的樣品進行至少兩次超速離心，以獲得富集HCV的沉淀；-在水溶液中重懸富集HCV的沉淀；-在蔗糖密度梯度中超速離心重懸的富集HCV的沉淀以將重懸的富集HCV的沉淀的組成成份根據(jù)它們的密度分離成級分；-回收含有每毫升從約5.IO5到約IO6UI的HCV RNA、每毫升從約50到約IOOpg的 HCV核心蛋白，以及含有能結(jié)合權(quán)利要求10或11的單克隆抗體的顆粒的級分，特別是蔗糖密度為大約I. 17到I. 21 g/ml的級分，以獲得純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的組合物。29.純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的組合物，如根據(jù)項目28的方法獲得。30.制備項目10的單克隆抗體的方法，包括下列步驟-用根據(jù)權(quán)利要求18的HCV病毒顆粒的組合物，或者如根據(jù)權(quán)利要求24制備的組合物免疫動物，特別是哺乳動物，并回收產(chǎn)生的抗體；-在所產(chǎn)生的抗體中，根據(jù)它們結(jié)合在上面所提到的HCV病毒顆粒的組合物中所包含的HCV病毒顆粒的能力，選擇單克隆抗體。31.制備項目11的單克隆抗體的方法，包括下列步驟-用根據(jù)權(quán)利要求23的純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的組合物，或者如根據(jù)權(quán)利要求28制備的組合物免疫動物，特別是哺乳動物，并回收產(chǎn)生的抗體；-在所產(chǎn)生的抗體中，根據(jù)它們結(jié)合在上面所提到的純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的組合物中所包含的純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的能力，選擇單克隆抗體。32.藥物組合物，其包含項目21或22的亞病毒顆?；蛘唔椖?7的組合物作為活性物質(zhì)，以及藥學(xué)上可接受的載體。33.項目21或22的HCV有包膜的亞病毒顆?；蛘唔椖?7的組合物的用途，用于誘導(dǎo)針對所述HCV有包膜的亞病毒顆?；蛘哚槍θ缭陧椖?2中所定義的HCV有包膜的完整病毒顆粒的免疫反應(yīng)。34.項目21或22的HCV有包膜的亞病毒顆?；蛘唔椖?7的組合物的用途，用于制備診斷、預(yù)防或治療HCV感染的藥物。參考文獻Andre, P.，F(xiàn). Komurian-PradeI, S. Deforges, M. Perret，J. L Berland, M. Sodoyer, S.Pol, C.Brechot, G. Paranhos-Baccala, 矛ロ V. Lotteau. 2002 しharacterization of low-and very-J_ow_density hepatitis C virus RNA—containing particles. J Virus 76 :6919-28Aoyagi K，Ohue C，Iida K，Kimura T，Tanaka E，Kiyosawa K，Yagi S. J. Clin. Microbiol. (1999)37 :1802-1808Bartenschlager R，Lohman V. J Gen. Virol. (2000)81 1631-1648Bartosch，B.，J. Dubuisson，和F. L Cosset. 2003. Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1—E2 envelope protein complexes. J Exp Med 197 :633-42.Baumert, T. F.，J. Vergalla，J. Satoi，M. Thomson, M. Leclzmann, D. Herion，
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1.肽，包含SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :2 或 SEQ ID NO :3 定義的序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的肽，由SEQID NO 1,SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3定義的序列構(gòu)成。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2的肽，其中所述肽是生物素化的。
4.權(quán)利要求1-3中任一項的肽的用途，其用于檢測HCV感染患者血清中特異性抗體的存在，所述特異性抗體能夠與由2003年3月19日保藏在CNCM(Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris, France),保藏登錄號為 CNCM1-2983的雜交瘤所分泌單克隆抗體所識別的El和E2的三個區(qū)域同時反應(yīng)，其中所述的El 和E2的3個區(qū)域分別由下述序列構(gòu)成其中所述的El和E2的3個區(qū)域分別由下述序列構(gòu)成-SEQ ID NO 1所示的HCV蛋白El第297到306位氨基酸；-SEQ ID NO 2所示的HCV蛋白E2第480到494位氨基酸；和 -SEQ ID NO 3所示的HCV蛋白E2第613到621位氨基酸，
5.檢測HCV感染患者血清中特異性抗體的存在的方法，所述特異性抗體能夠與由 2003 年 3 月 19 日保藏在 CNCM(Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris, France),保藏登錄號為CNCM 1-2983的雜交瘤所分泌單克隆抗體所識別的El和E2的三個區(qū)域同時反應(yīng)，其中所述的El和E2的3個區(qū)域分別由下述序列構(gòu)成SEQIDNO1所示的HCV蛋白El第297到306位氨基酸；SEQIDNO2所示的HCV蛋白E2第480到494位氨基酸；和SEQIDNO3所示的HCV蛋白E2第613到621位氨基酸，所述方法包括步驟-將權(quán)利要求1-3中任一項的肽與所述血清接觸，以允許所述肽與任何存在于血清中的特異性抗體的復(fù)合體的形成；和 -檢測任何形成的復(fù)合體的存在。
6.權(quán)利要求5的方法，其中包括使用辣根過氧化物酶綴合的山羊抗人IgG檢測任何形成的復(fù)合體的存在。
7.權(quán)利要求5或6的方法，其中的肽是生物素化的，而且其中在接觸步驟之前，所述肽結(jié)合于用鏈霉親和素包被的固體表面。
全文摘要
本發(fā)明涉及針對HCV的新構(gòu)象抗體以及更特別地涉及單克隆抗體。本發(fā)明還涉及易于被所述抗體識別的顆粒的組合物，以及涉及包含它們的藥物組合物。本發(fā)明還涉及HCV有包膜的亞病毒顆?；蚣兓腍CV有包膜的完整病毒顆粒，以及制備它們的方法。
文檔編號C07K16/10GK102584947SQ201210064719
公開日2012年7月18日 申請日期2004年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月1日
發(fā)明者C·洛利夫雷-雷諾, M-A·珀蒂 申請人:國家健康醫(yī)學(xué)研究所, 拜奧默里克斯股份有限公司