專利名稱：一種從低蛋白質(zhì)含量組分中提取蛋白質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種從低蛋白質(zhì)含量組分中提取蛋白質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)是在蛋白質(zhì)水平上定量、動(dòng)態(tài)、整體性地研究生物體的全新領(lǐng)域，它旨在闡明生物體全部蛋白質(zhì)的表達(dá)模式及功能模式，其內(nèi)容包括蛋白質(zhì)的定性鑒定、定量檢測(cè)、細(xì)胞內(nèi)定位、相互作用研究等，最終揭示蛋白質(zhì)功能，是基因組DNA序列與基因功能之間的橋梁。蛋白質(zhì)組學(xué)研究的根本基礎(chǔ)是得到高質(zhì)量的用于檢測(cè)分析的蛋白質(zhì)樣品，目前用于生物組織蛋白質(zhì)提取的方法主要有直接提取法、三氯乙酸(TCA)/丙酮沉淀法及酚抽提法。直接提取法是將生物組織在高滲透壓的溶液中破碎后高速離心后收集溶解蛋白質(zhì)的上清液作為研究對(duì)象。該種提取方法操作簡(jiǎn)便，但是蛋白質(zhì)含量低，含有大量影響后續(xù)蛋白質(zhì)組學(xué)分析的雜質(zhì)；三氯乙酸(TCA)/丙酮沉淀法能夠快速高效的提取生物組織蛋白質(zhì)，有效抑制蛋白水解酶和修飾酶活性，但對(duì)組織中高分子量蛋白質(zhì)的溶解性較差，難于沉淀低分子量蛋白質(zhì)，難以除去可溶性多糖和酚類等雜質(zhì)；酚抽提法是目前應(yīng)用廣泛的蛋白質(zhì)提取方法，能夠高效的提取高純度的蛋白質(zhì)，但植物組織中富含的色素、多酚、醌、脂等其他多種次生代謝產(chǎn)物使得酚抽提法具有局限性。本發(fā)明的申請(qǐng)人早期曾經(jīng)提出一種改進(jìn)的適用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析的蛋白質(zhì)提取方法(BPP)，它很好的解決了色素、多醌、脂類干擾問(wèn)題，但僅適用于蛋白質(zhì)含量較高的動(dòng)植物組織中(如植物的根莖葉等組織)，對(duì)蛋白質(zhì)含量低的組織提取效果不佳，而這些組織中可能含有關(guān)鍵蛋白質(zhì)，需要高效的蛋白質(zhì)提取方法為基礎(chǔ)揭示關(guān)鍵代謝途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種從低蛋白質(zhì)含量組分中提取蛋白質(zhì)的方法，該方法蛋白提取效率高，可從含量低的組份中提取出高質(zhì)量蛋白。本發(fā)明的上述目的是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種從低蛋白質(zhì)含量組分中提取蛋白質(zhì)的方法，包括以下步驟(1)以低蛋白質(zhì)含量的生物組織為原料，加入蛋白質(zhì)提取液進(jìn)行組織勻漿化，將勻漿化的溶液等分為若干份樣品；(2)取步驟(1)中獲得的任一份樣品，加入Tris-飽和酚后震蕩，離心，取離心后上層酚相，用Tris-飽和酚補(bǔ)足體積，加到步驟(1)中的第二份樣品中震蕩，離心，取離心后上層酚相，上述兩份樣品中的蛋白質(zhì)均濃縮溶解在第二份樣品的上層酚相中；(3)繼續(xù)將第二份樣品的上層酚相，用Tris-飽和酚補(bǔ)足體積，加到第三份樣品中震蕩，離心，取離心后上層酚相，上述三份樣品中的蛋白質(zhì)均濃縮溶解在第三份樣品的上層酚相中，重復(fù)上述過(guò)程，至所有份樣品中的蛋白質(zhì)均濃縮溶解在最后一份樣品的上層酚相中；(4)取最后一份樣品的上層酚相，加入等體積的蛋白質(zhì)提取液混合，離心；(5)取離心后上層相，加入硫酸銨甲醇溶液沉淀蛋白質(zhì)，并低溫保存即得到蛋白質(zhì)沉淀。其中在上述步驟中步驟(1)中所述的低蛋白質(zhì)含量的生物組織包括生物組織洗脫液、微生物胞外培
養(yǎng)液或培養(yǎng)基。步驟(1)中所述蛋白質(zhì)提取液的用量為低蛋白質(zhì)含量的生物組織原料總體積的 1 3倍。步驟(1)和步驟(4)中所述的蛋白質(zhì)提取液包括以下含量的組分100mM EDTA(乙二胺四乙酸)，IOOmM Tris-飽和酚，50mM四硼酸鈉，50mM維生素C，質(zhì)量體積比為1 5% 的PVPP(交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮)，體積百分含量為1 2%的Triton X-100，體積百分含量為2 4%的β -巰基乙醇，質(zhì)量體積比為30 35%的蔗糖(即在IOOmL水中含有30g蔗糖)。步驟(1)中將勻漿化的溶液等分為3 20份樣品。步驟O)中Tris-飽和酚的用量為若干份樣品中每份樣品體積的1/3 1，步驟 (2)和步驟(3)中用Tris-飽和酚補(bǔ)足體積至與若干份樣品中各樣品的原體積相同。步驟⑵和步驟(3)中所述Tris-飽和酚的pH值pH大于7. 8。步驟(2)、步驟(3)和步驟(4)中以1000 1500g的轉(zhuǎn)速離心10 20分鐘。步驟(5)中硫酸銨甲醇溶液的質(zhì)量濃度優(yōu)選為50g/L，實(shí)際上，只要硫酸銨在甲醇溶液中過(guò)飽和即可，其用量為上層相體積的5 6倍。步驟(5)中于-20 _40°C低溫保存6-8小時(shí)以上。其中硫酸銨溶于甲醇后，需要在磁力攪拌器上攪拌8小時(shí)以上，便于硫酸銨溶解。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明以低蛋白質(zhì)含量的生物組織為原料，加入蛋白質(zhì)提取液進(jìn)行組織勻漿化，將勻漿化的溶液等分為若干份樣品；將若干份樣品采用逐步濃縮的方式將各個(gè)組分中低含量的蛋白質(zhì)全部濃縮于最后一份樣品中，獲得相對(duì)高含量的蛋白質(zhì)，并采用蛋白提取液進(jìn)行提取后，將獲得的高含量蛋白質(zhì)于硫酸銨甲醇溶液中沉淀出蛋白質(zhì)，并低溫保存即得到高含量的蛋白質(zhì)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)本發(fā)明從含量低的生物組分中可以提取出蛋白質(zhì)；(2)本發(fā)明所提取的蛋白質(zhì)沒(méi)有色素、多醌、脂類雜質(zhì)干擾問(wèn)題；(3)本發(fā)明得到的蛋白液可用于單向SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、雙向SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳及質(zhì)譜鑒定等蛋白質(zhì)組學(xué)研究中。


圖1是實(shí)施例1中巴西橡膠樹(shù)膠乳中橡膠粒子洗脫液蛋白質(zhì)單向SDS-PAGE，分離的蛋白質(zhì)是實(shí)施例1中提取得到的六種組分，泳道1 橡膠粒子膜蛋白質(zhì)4，泳道2 橡膠粒子膜蛋白質(zhì)3，泳道3 橡膠粒子膜蛋白質(zhì)2，泳道4 橡膠粒子膜蛋白質(zhì)1，泳道5 橡膠粒子膜蛋白質(zhì)2CK，泳道6:橡膠粒子膜蛋白質(zhì)1CK，泳道M 蛋白質(zhì)分子量Marker，其中直線指示能夠進(jìn)入洗脫液中的橡膠粒子膜蛋白質(zhì)，并且本方法能夠有效提取的蛋白質(zhì)組分；圖2是實(shí)施例2中巴西橡膠樹(shù)膠乳中橡膠粒子洗脫液蛋白質(zhì)雙向SDS-PAGE，其中a是橡膠粒子洗脫液I(WSl)蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜，b是橡膠粒子洗脫液2(WS》蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜，c是洗脫液1蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)pH4-5. 5范圍、分子量14kD-24kD范圍內(nèi)的雙向電泳圖譜，d是洗脫液洗脫液1蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)pH5. 5-6范圍、分子量72kD-95kD范圍內(nèi)的雙向電泳圖譜，e是洗脫液1的膠圖局部放大圖，蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)PH6-7范圍、分子量 28kD-36kD范圍內(nèi)的雙向電泳圖譜；圖3是實(shí)施例2中巴西橡膠樹(shù)膠乳中橡膠粒子洗脫液蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定圖譜，共選取了不同等電點(diǎn)和分子量共16個(gè)橡膠粒子洗脫液蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例1對(duì)巴西橡膠樹(shù)膠乳中橡膠合成關(guān)鍵細(xì)胞器-橡膠粒子的研究通常采用洗脫液多次洗脫后再提取膜蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析的方法，過(guò)去一直被認(rèn)為不存在于橡膠粒子膜上的蛋白質(zhì)，很可能同樣也是橡膠粒子膜結(jié)合蛋白，這些蛋白質(zhì)可能通過(guò)氫鍵或者范德華力等不緊密結(jié)合的形式與橡膠粒子膜結(jié)合，在洗脫過(guò)程中進(jìn)入到洗脫液中，而由于洗脫液蛋白質(zhì)含量低無(wú)法通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)手段進(jìn)行研究而忽視這部分關(guān)鍵蛋白質(zhì)，本發(fā)明提供的方法能夠很好的提取洗脫液中蛋白質(zhì)，并用于蛋白質(zhì)學(xué)分析。(1)、實(shí)驗(yàn)材料的收集鮮巴西橡膠膠乳經(jīng)35000_45000g離心40分鐘，膠乳分為明顯的三層，最上層白色膏狀物質(zhì)為橡膠粒子，中間層為C-乳清，下層為黃色體，上層即為粗提的橡膠粒子， 取粗提的橡膠粒子，首先按橡膠粒子和洗脫液(20mM Tris(三羥甲基氨基甲烷)，10mM EDTANa2(乙二胺四乙酸二鈉)，0. 5mM DTT(二硫蘇糖醇)，pH 8.0)的重量體積比為 1 10(g/mL)的比例將橡膠粒子懸浮在經(jīng)-20°C預(yù)冷的洗脫液(同上)中，緩慢攪拌30 分鐘后，4°C、25000-35000g離心30分鐘收集流動(dòng)相為洗脫液1 (命名為WSl)，接著將經(jīng)第一次洗滌后的橡膠粒子按橡膠粒子和洗脫液的重量體積比為1 10(g/mL)的比例將上層橡膠粒子懸浮，緩慢攪拌30分鐘后，4°C、25000-350(K)g離心30分鐘收集流動(dòng)相為洗脫液 2(命名為WS2)。收集離心后上層的橡膠粒子按質(zhì)量體積比1 3(g/mL)的比例加入蛋白質(zhì)提取液(蛋白質(zhì)提取液的成分包括100mM EDTA, IOOmM Tris-飽和酚，50mM四硼酸鈉，50mM 維生素C，質(zhì)量體積比為5 %的PVPP，體積百分含量為1 %的Triton X-100，體積百分含量為 4%的β-巰基乙醇，質(zhì)量體積比為30%的蔗糖，下同)，充分渦旋震蕩混勻，-4 4°C低溫保存一周左右，是洗脫后的橡膠粒子組分。鮮巴西橡膠膠乳經(jīng)35000_45000g離心40分鐘，膠乳分為明顯的三層，最上層白色膏狀物質(zhì)為橡膠粒子，收集橡膠粒子按質(zhì)量體積比1 3(g/mL)的比例加入蛋白質(zhì)提取液， 充分渦旋震蕩混勻，"4 4°C低溫保存一周左右，是未洗脫的橡膠粒子組分。(2)、實(shí)驗(yàn)材料的蛋白質(zhì)提取洗脫液及橡膠粒子膜蛋白質(zhì)的提取將洗脫液I(WSl)與等體積蛋白質(zhì)提取液混合，充分震蕩，將混合液體均勻分成10毫升每份，取其中任一份樣品，加入10毫升的Tris-飽和酚(pH > 7. 8)后劇烈震蕩，以 15000g的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，取離心后上層酚相，用Tris-飽和酚(pH > 7. 8)補(bǔ)足10毫升， 加到另一份樣品中劇烈混合震蕩，以15000g的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，繼續(xù)將第二份樣品的上層酚相，用Tris-飽和酚補(bǔ)足10mL，加到第三份樣品中震蕩，離心，取離心后上層酚相，上述三份樣品中的蛋白質(zhì)均濃縮溶解在第三份樣品的上層酚相中，重復(fù)上述步驟，至10份樣品中的蛋白質(zhì)均濃縮溶解在最后一份樣品的上層酚相中；取離心后上層相加入等體積的蛋白質(zhì)提取液(提取液組成同上)，劇烈混合，以15000g的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，取離心后上層相加入5倍體積的硫酸銨甲醇溶液沉淀蛋白質(zhì)，-20 V低溫6-8小時(shí)以上，其中硫酸銨甲醇溶液通過(guò)將50g硫酸銨加入到IL甲醇溶液中，磁力攪拌器上攪拌8小時(shí)以上獲得，獲得的橡膠粒子膜蛋白質(zhì)1，即圖1的泳道4中所示蛋白質(zhì)。同樣，將洗脫液2(WS2)采用與洗脫液I(WSl)相同的方式，獲得采用本發(fā)明提取方法獲得的橡膠粒子膜蛋白質(zhì)2，即圖1中泳道3所示的蛋白質(zhì)。取(1)中收集的洗脫后橡膠粒子和未洗脫橡膠粒子組分5g，分別加入蛋白質(zhì)提取液5mL，將混合物劇烈漩渦振蕩30分鐘，4°C、15000g離心15分鐘后，收集流動(dòng)液體，棄掉不溶物。在流動(dòng)液體內(nèi)加入等體積Tris-飽和酚(pH > 7. 8)后劇烈震蕩15分鐘，15000g離心15分鐘后，取離心后上層相加入等體積蛋白質(zhì)提取液，劇烈震蕩15分鐘，15000g離心15 分鐘后取離心后上層相，加入5倍體積的硫酸銨/甲醇溶液沉淀蛋白質(zhì)，-20°C低溫6-8小時(shí)以上，分別得到洗脫后的橡膠粒子膜蛋白，命名為膜蛋白質(zhì)3，如圖1中泳道2所示以及未洗脫后的橡膠粒子膜蛋白，命名為膜蛋白質(zhì)4，如圖1中泳道1所示。分別取橡膠粒子洗脫液1、洗脫液2使用三氯乙酸/丙酮提取法提取蛋白質(zhì)作為對(duì)照。將與上文相同體積和質(zhì)量的橡膠粒子樣品加入樣品3倍體積的三氯乙酸/丙酮提取液 (10% TCA和0. 07%的β -巰基乙醇的丙酮)，充分震蕩15 20分鐘，15000g離心15分鐘后取離心后上層液體，加入5倍體積的冷丙酮(_20°C)，-20°C沉淀過(guò)夜。分別獲得膜蛋白質(zhì)ICK (橡膠粒子洗脫液1三氯乙酸/丙酮提取)、膜蛋白質(zhì)2CK (橡膠粒子洗脫液2三氯乙酸/丙酮提取)。將橡膠粒子膜蛋白質(zhì)1、膜蛋白質(zhì)2、膜蛋白質(zhì)3、膜蛋白質(zhì)4、膜蛋白質(zhì)1CK、膜蛋白質(zhì)2CK沉淀過(guò)夜的蛋白質(zhì)經(jīng)離心后，-20°C預(yù)冷Mi以上的甲醇洗滌蛋白質(zhì)沉淀2次，-200C 預(yù)冷他以上的丙酮洗滌蛋白沉淀1次，超凈工作臺(tái)內(nèi)中等強(qiáng)度風(fēng)吹干蛋白質(zhì)沉淀，溶于蛋白質(zhì)裂解液中，蛋白質(zhì)裂解液含、[7M尿素，2M硫脲，質(zhì)量百分含量2% CHAPS (乙醇胺丙基二甲氨基丙磺酸鹽)，13mM DTT(二硫蘇糖醇)，下同]在室溫融解蛋白2小時(shí)以上。用 Bradford蛋白質(zhì)定量方法測(cè)定蛋白濃度，結(jié)果顯示可以從200毫升洗脫液1中提取到5毫克蛋白質(zhì)，能夠用于蛋白質(zhì)單向SDS-PAGE及雙向PAGE的電泳檢測(cè)。(3)、洗脫液蛋白質(zhì)和橡膠粒子膜蛋白質(zhì)的單向SDS-PAGE 使用質(zhì)量百分含量為12. 5%的SDS-PAGE配制兩塊厚度1. 5毫米的分離凝膠，膠凝結(jié)好后，配制質(zhì)量百分含量為4%的SDS-PAGE濃縮膠，使用15齒梳制作15孔濃縮膠，最大上樣體積為100微升。按照蛋白質(zhì)分子量Marker、洗脫液1、洗脫液2、未洗脫橡膠粒子膜蛋白質(zhì)、洗脫后橡膠粒子膜蛋白質(zhì)的順序上樣，上樣蛋白質(zhì)含量為30微克。使用Hoefer SE 600chrOma單向凝膠電泳儀器，設(shè)置恒功率參數(shù)，進(jìn)行單向SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠染色過(guò)夜、脫色、掃描后，分析圖像。如圖1所示，圖中顯示蛋白質(zhì)條帶分離清楚，能夠反映出蛋白質(zhì)樣品特性，圖1 泳道M 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1 膜蛋白質(zhì)4，泳道2 膜蛋白質(zhì)3，泳道3 膜蛋白質(zhì)2，泳道4 膜蛋白質(zhì)1，泳道5 膜蛋白質(zhì) 2CK，泳道6 膜蛋白質(zhì)1CK。試驗(yàn)結(jié)果表明，采用本發(fā)明方法，可以將采用常規(guī)方法不能測(cè)試出來(lái)的膜蛋白質(zhì)1 和膜蛋白質(zhì)2測(cè)試出來(lái)，能夠提取到不同分子量的蛋白質(zhì)，無(wú)論從蛋白質(zhì)的數(shù)量和種類還是蛋白質(zhì)的質(zhì)量都要優(yōu)于TAC/丙酮提取方法。圖1中箭頭指示的是高豐度蛋白質(zhì)，使用本發(fā)明方法以及TAC/丙酮方法都能提取的到，但本發(fā)明的方法提取的蛋白質(zhì)量膠多而且蛋白質(zhì)雜質(zhì)含量較少，除去高豐度蛋白質(zhì)， 本實(shí)驗(yàn)方法還能提取到低表達(dá)豐度或低含量的蛋白質(zhì)。實(shí)施例2(1)、實(shí)驗(yàn)材料的收集鮮巴西橡膠膠乳經(jīng)35000_45000g離心40分鐘，取上層白色膏狀物質(zhì)橡膠粒子， 按橡膠粒子和洗脫液的重量體積比為1 10 (單位為g/mL)的比例將橡膠粒子懸浮在經(jīng)-20°C預(yù)冷的洗脫液中，洗脫液的成分同上。緩慢攪拌30分鐘后，4°C、25000-35000g離心30分鐘收集流動(dòng)相為洗脫液1 (命名為WSl)，將經(jīng)洗脫液1洗脫后的橡膠粒子，按橡膠粒子和洗脫液的重量體積比為1 10 (單位為g/mL)的比例將上層橡膠粒子懸浮，緩慢攪拌 30分鐘后，4°C、25000-35000g離心30分鐘收集流動(dòng)相為洗脫液2 (命名為WS2)。(2)、實(shí)驗(yàn)材料的蛋白質(zhì)提取將洗脫液1 (WSl)、洗脫液2 (WS2)分別與等體積提取液混合，充分震蕩，將混合液體均勻分成10毫升的每份。共分為20份，取其中一份樣品加入10毫升的TriS-飽和酚(pH > 7. 8)后劇烈震蕩，15000g離心15分鐘。取離心后上層相，用Tris-飽和酚(pH > 7. 8) 補(bǔ)足10毫升，加到另一份樣品中劇烈混合震蕩，15000g離心15分鐘，繼續(xù)將第二份樣品的上層酚相，用Tris-飽和酚補(bǔ)足體積，加到第三份樣品中震蕩，離心，取離心后上層酚相，上述三份樣品中的蛋白質(zhì)均濃縮溶解在第三份樣品的上層酚相中，重復(fù)上述步驟至所有樣品的蛋白質(zhì)濃縮溶解在最后一份樣品的酚相中。取離心后上層相加入等體積的蛋白質(zhì)提取液，劇烈混合，15000g離心15分鐘后。取離心后上層相加入5倍體積的硫酸銨/甲醇溶液沉淀蛋白質(zhì)，_20°C低溫6-8小時(shí)以上，得到蛋白質(zhì)WSl和蛋白質(zhì)WS2。沉淀過(guò)夜的蛋白質(zhì)經(jīng)離心后，-20°C預(yù)冷Mi以上的甲醇洗滌蛋白質(zhì)沉淀2 次，-20°C預(yù)冷他以上的丙酮洗滌蛋白沉淀1次，超凈工作臺(tái)內(nèi)中等強(qiáng)度風(fēng)吹干蛋白質(zhì)沉淀，溶于蛋白質(zhì)裂解液中，用Bradford蛋白質(zhì)定量方法測(cè)定蛋白濃度，結(jié)果顯示可以從200 毫升洗脫液1中提取到5毫克蛋白質(zhì)，從200毫升洗脫液2中能夠提取到3毫克左右的蛋白質(zhì)。(3)、洗脫液蛋白質(zhì)雙向SDS-PAGE 提取的WSl、WS2蛋白質(zhì)通過(guò)Bradford法蛋白質(zhì)定量后，計(jì)算上樣量為1200微克， 上樣體積為450微升。使用M厘米的GE Healthcare公司的pH范圍4_7的預(yù)制線性梯度 IPG膠條，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行一向等電聚焦過(guò)程。聚焦結(jié)束后的膠條經(jīng)過(guò)DTT和碘乙酰胺平衡后，于觀厘米長(zhǎng)X 25厘米寬X 1.5毫米厚的12. 5%的SDS-PAGE分離膠上進(jìn)行二向電泳。 電泳結(jié)束后凝膠經(jīng)過(guò)考馬斯亮藍(lán)G250染色后采集凝膠圖像進(jìn)行分析。圖2顯示通過(guò)本發(fā)明方法提取的低含量組織(WS1、WS》的蛋白質(zhì)適合雙向電泳分離，并且在不同PH范圍和分子量范圍內(nèi)的分離效果十分理想。圖2中a和b顯示使用本實(shí)驗(yàn)方法得到的兩種洗脫液蛋白質(zhì)(洗脫液1、洗脫液 2)能夠進(jìn)行普通的蛋白質(zhì)雙向電泳分離后分析，能夠得到足夠多的蛋白質(zhì)，同時(shí)電泳圖譜清晰，無(wú)明顯拖尾現(xiàn)象，說(shuō)明本發(fā)明的方法能夠得到較純的蛋白質(zhì)，圖C、圖d、圖e以洗脫液 1的蛋白質(zhì)為例子，顯示出不同表達(dá)豐度、不同PH范圍、不同分子量的蛋白質(zhì)都能夠提取出來(lái)并且電泳結(jié)果理想。G)、WS1、WS2中蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定選取不同等電點(diǎn)和分子量共16個(gè)橡膠粒子洗脫液蛋白點(diǎn)進(jìn)行膠內(nèi)胰蛋白酶解和質(zhì)譜鑒定(圖3所示)，鑒定結(jié)果通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)手段分析。認(rèn)為本發(fā)明提供的方法具有高質(zhì)譜兼容性(表1)。表1洗脫液中蛋白質(zhì)一級(jí)質(zhì)譜鑒定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種從低蛋白質(zhì)含量組分中提取蛋白質(zhì)的方法，其特征是包括以下步驟(1)以低蛋白質(zhì)含量的生物組織為原料，加入蛋白質(zhì)提取液進(jìn)行組織勻漿化，將勻漿化的溶液等分為若干份樣品；(2)取步驟(1)中獲得的任一份樣品，加入Tris-飽和酚后震蕩，離心，取離心后上層酚相，用Tris-飽和酚補(bǔ)足體積，加到步驟(1)中的第二份樣品中震蕩，離心，取離心后上層酚相，上述兩份樣品中的蛋白質(zhì)均濃縮溶解在第二份樣品的上層酚相中；(3)繼續(xù)將第二份樣品的上層酚相，用Tris-飽和酚補(bǔ)足體積，加到第三份樣品中震蕩，離心，取離心后上層酚相，上述三份樣品中的蛋白質(zhì)均濃縮溶解在第三份樣品的上層酚相中，重復(fù)上述過(guò)程，至所有份樣品中的蛋白質(zhì)均濃縮溶解在最后一份樣品的上層酚相中；(4)取最后一份樣品的上層酚相，加入等體積的蛋白質(zhì)提取液混合，離心；(5)取離心后上層相，加入硫酸銨甲醇溶液沉淀蛋白質(zhì)，并低溫保存即得到蛋白質(zhì)沉淀。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從低蛋白質(zhì)含量組分中提取蛋白質(zhì)的方法，其特征是步驟 (1)中所述的低蛋白質(zhì)含量的生物組織包括生物組織洗脫液、微生物胞外培養(yǎng)液或培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從低蛋白質(zhì)含量組分中提取蛋白質(zhì)的方法，其特征是步驟 (1)中所述蛋白質(zhì)提取液的用量為低蛋白質(zhì)含量的生物組織原料總體積的1 3倍。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從低蛋白質(zhì)含量組分中提取蛋白質(zhì)的方法，其特征是步驟 (1)和步驟⑷中所述的蛋白質(zhì)提取液包括以下含量的組分100mM EDTA, IOOmM Tris-飽和酚，50mM四硼酸鈉，50mM維生素C，質(zhì)量體積比為1 5%的PVPP，體積百分含量為1 2%的Triton X-100，體積百分含量為2 4%的β -巰基乙醇，質(zhì)量體積比為30 35%的蔗糖。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從低蛋白質(zhì)含量組分中提取蛋白質(zhì)的方法，其特征是步驟(1)中將勻漿化的溶液等分為3 20份樣品。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從低蛋白質(zhì)含量組分中提取蛋白質(zhì)的方法，其特征是步驟(2)中Tris-飽和酚的用量為若干份樣品中每份樣品體積的1/3 1倍，步驟( 和步驟(3)中用Tris-飽和酚補(bǔ)足體積至與若干份樣品中每份樣品的原體積相同。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從低蛋白質(zhì)含量組分中提取蛋白質(zhì)的方法，其特征是步驟 (2)和步驟(3)中所述Tris-飽和酚的pH值大于7. 8。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從低蛋白質(zhì)含量組分中提取蛋白質(zhì)的方法，其特征是步驟 ⑵、步驟(3)和步驟⑷中以1000 1500g的轉(zhuǎn)速離心10 20分鐘。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從低蛋白質(zhì)含量組分中提取蛋白質(zhì)的方法，其特征是步驟 (5)中硫酸銨甲醇溶液的質(zhì)量濃度為50g/L，其用量為上層相體積的5 6倍。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從低蛋白質(zhì)含量組分中提取蛋白質(zhì)的方法，其特征是步驟 (5)中于-20 _40°C低溫保存6-8小時(shí)以上。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種從低蛋白質(zhì)含量組分中提取蛋白質(zhì)的方法，包括以下步驟以低蛋白質(zhì)含量的生物組織為原料，加入蛋白質(zhì)提取液進(jìn)行組織勻漿化，將勻漿化的溶液等分為若干份樣品；將若干份樣品采用逐步濃縮的方式將各個(gè)組分中低含量的蛋白質(zhì)全部濃縮于最后一份樣品中，獲得相對(duì)高含量的蛋白質(zhì)，并采用蛋白提取液進(jìn)行提取后，于硫酸銨甲醇溶液中沉淀出蛋白質(zhì)，并低溫保存即得到高含量的蛋白質(zhì)。該方法蛋白提取效率高，可從含量低的組份中提取出高含量的蛋白質(zhì)。
文檔編號(hào)C07K1/36GK102532258SQ20121006781
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月15日
發(fā)明者常麗麗, 王丹, 王旭初, 王海燕, 郭安平 申請(qǐng)人:中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所