專利名稱：一種脫氧河鲀毒素的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種脫氧河飩毒素的提取方法，屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
河飩毒素(tetrodotoxin，TTX)是從河飩魚的內(nèi)臟中提取出的一種毒性極強(qiáng)的非蛋白物質(zhì)之一，具有獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)和藥理性質(zhì)，是一種著名的神經(jīng)毒素；其毒性比氰化納高1250倍。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，河飩毒素還廣泛存在于蝦虎魚、蠑螈、章魚、貝類、螺類、海星、蟹類等海洋生物體內(nèi)。河飩毒素的結(jié)晶是一種氨基氫化喹唑啉類型化合物，分子式為C11H17N3O8,分子量為3 19. 27。這種令人生畏的毒素，只需O. 3mg-0. 5mg就可致人于死地，因?yàn)樗軐Ｒ坏刈钄嗌窠?jīng)細(xì)胞膜Na+通道，所以，河飩毒素具有鎮(zhèn)痛、戒毒、鎮(zhèn)痙、鎮(zhèn)癢、局麻等功效。多年來，河飩毒素研發(fā)一直備受國內(nèi)外科學(xué)家的密切關(guān)注。脫氧河飩毒素(deoxytetrodotoxin，deoxyTTX)是河飩毒素的衍生物，是一種氨基全氫喹唑啉型化合物，主要應(yīng)用于神經(jīng)生物學(xué)、生理學(xué)、藥理學(xué)和其他科學(xué)研究。deoxyTTX與TTX在一般情況下同時(shí)存在于同一生物體中，都廣泛存在于河飩魚、蝦虎魚、螺類、藍(lán)環(huán)章魚、蟹類、海星、海生陸產(chǎn)的兩棲類、軟體動(dòng)物和節(jié)肢動(dòng)物等海洋生物體內(nèi)，并且，主要存在于河飩魚的卵巢、肝臟、皮膚和腸胃中。其中，deoxyTTX雖然分布于多種生物中，但是，在天然生物體中，deoxyTTX含量極微，在粗品TTX所含的多種衍生物中，deoxyTTX的含量也是非常少。而且，deoxyTTX與TTX所含的多種衍生物的分子量、分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)非常接近，因此，要單一提取deoxyTTX非常困難。目前，關(guān)于deoxyTTX的制取方法，尚未見有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了提供一種脫氧河飩毒素的提取方法，該方法是在河飩毒素的廢棄母液中提取脫氧河飩毒素；主要使用醇醚擴(kuò)散法純化河飩毒素，不僅可提高河飩毒素的純度，同時(shí)可使脫氧河飩毒素聚集于母液中，以該母液為原料，通過色譜分離和層析脫鹽方法處理后，達(dá)到提取脫氧河飩毒素的目的；該制備方法工藝簡單，生產(chǎn)成本低，容易實(shí)施，同時(shí)可使精制河飩毒素后的廢棄母液得到了充分的利用。為了達(dá)到上述目的，一種脫氧河飩毒素提取方法按下列步驟提取的一、制備河飩毒素母液先將粗品河飩毒素置于玻璃燒杯中，加濃度為7% -15%的醋酸溶解，得到“A”溶液，在“A”溶液中加入劑量為“A”溶液量1-10倍的無水乙醇，攪拌均勻，溶解后得到“B”溶液，將“B”溶液通過離心機(jī)分離，除去其中的不溶物，得到河飩毒素上清液；將河飩毒素上清液倒入燒杯后，移到密閉容器中，然后在密閉容器內(nèi)放置一杯乙醚溶液，將密閉容器內(nèi)的溫度控制在10°C _35°C;當(dāng)乙醚向河飩毒素-醋酸-乙醇-水溶液擴(kuò)散后，經(jīng)過10-60小時(shí)的反應(yīng)，即可析出河飩毒素結(jié)晶，得到母液“C” ；二、高效液相色譜分離
將母液“C”真空加熱濃縮后，加入氨水將母液“C”pH值調(diào)節(jié)至7. 5-10后，析出沉淀物，將此沉淀物通過水洗、真空冷凍干燥處理后，即可獲得白色的含脫氧河飩毒素沉淀物；將此白色的含脫氧河飩毒素沉淀物加入濃度為20% -30%的醋酸或磷酸溶解，得到“D”溶液；使用高效制備液相色譜儀對(duì)“D”溶液進(jìn)行液相色譜分離，色譜條件C18反相柱；流動(dòng)相為含有l(wèi)mmol/L-15mmol/L離子對(duì)試劑的O. 05mol/L-0. 5mol/L緩沖液和O. 5% -5%甲醇，其流動(dòng)相的流速為6mL/min-15mL/min ;使用示差折光檢測器或紫外檢測器進(jìn)行檢測；在高效液相色譜分離過程中，按出峰圖譜可收集到脫氧河飩毒素的餾分；
三、層析脫鹽處理將上述脫氧河飩毒素餾分，緩慢加入裝有生物凝膠或酸性陽離子樹脂的層析柱中，再用濃度為3% -20%的醋酸溶液進(jìn)行洗脫，收集pH值為4-7的餾分；然后使用氨水將此餾分的PH值調(diào)節(jié)至7. 5-10，即可析出白色固體；將白色固體經(jīng)過水洗和真空冷凍干燥處理后，即可得到純度較高的脫氧河飩毒素結(jié)晶。所述的離子對(duì)試劑包括辛烷磺酸鈉、庚烷磺酸鈉、己烷磺酸鈉、戊烷磺酸鈉。所述的緩沖液可使用磷酸鹽緩沖液或檸檬酸鹽緩沖液。所述的流動(dòng)相的pH值為5-7。脫氧河飩毒素的具體提取方法(試驗(yàn)例)一、制備河飩毒素母液取粗品TTX 800mg，置于玻璃燒杯中，用12mL濃度為15%的醋酸溶解，得到“A”溶液，在“A”溶液中加入50mL無水乙醇，攪拌均勻，溶解后得到“B”溶液，將“B”溶液通過離心機(jī)分離，除去其中的不溶物，得到河飩毒素上清液；將河飩毒素上清液倒入燒杯后，移到密閉容器中，然后在密閉容器內(nèi)放置一杯乙醚溶液，將密閉容器內(nèi)的溫度控制在28°C，由于乙醚溶液的揮發(fā)性極強(qiáng)，瓶內(nèi)的乙醚溶液會(huì)自然揮發(fā)擴(kuò)散，當(dāng)乙醚的揮發(fā)物與河飩毒素上清液相溶后，經(jīng)過36小時(shí)的反應(yīng)；即可析出河飩毒素結(jié)晶，并得到母液“C” ；二、高效液相色譜分離將母液“C”真空加熱濃縮后，加入氨水將母液“C”pH值調(diào)節(jié)至8. 5后，析出沉淀物，將沉淀物通過水洗、真空冷凍干燥處理后，即可獲得白色的含脫氧河飩毒素沉淀物；將此沉淀物加入濃度為15%的醋酸溶解，得到“D”溶液；使用高效制備液相色譜儀對(duì)“D”溶液進(jìn)行液相色譜分離，色譜條件C18反相柱(20mmX250mm);流動(dòng)相為含有2mmol/L-10mmol/L庚烷磺酸鈉的O. 08mol/L磷酸鹽緩沖液和O. 8%的甲醇，其流動(dòng)相的流速為10mL/min ;使用示差折光檢測器進(jìn)行檢測；在高效液相色譜分離過程中，按出峰圖譜可收集到脫氧河飩毒素的懼分250mL ；三、層析脫鹽處理將上述脫氧河飩毒素餾分250mL，緩慢加入裝有酸性陽離子樹脂的層析柱中(20mmX 400mm)，再用濃度為10%的醋酸溶液進(jìn)行洗脫，收集pH值為4_7的餾分；然后使用氨水將此餾分的pH值調(diào)節(jié)至9. O,即可析出白色固體；將白色固體經(jīng)過水洗和真空冷凍干燥處理后，即可得到純度較高的脫氧河飩毒素結(jié)晶llmg。本發(fā)明脫氧河飩毒素的樣品鑒定結(jié)論將上述脫氧河飩毒素結(jié)晶樣品經(jīng)中國科學(xué)院化學(xué)研究所作質(zhì)譜(SIMS)測定和美國斯坦福大學(xué)化學(xué)系作核磁共振光譜(1H-NMR)測定。
測定結(jié)果ll_deoxyTTX的分子式和結(jié)構(gòu)如下分子式=C11H17O7N3分子量303.11結(jié)構(gòu)式
權(quán)利要求
1.ー種脫氧河飩毒素的提取方法，其特征包括以下步驟 一、制備河飩毒素母液 先將粗品河飩毒素置于玻璃燒杯中，加濃度為7% -15%的醋酸溶解，得到“A”溶液，在“A”溶液中加入劑量為“A”溶液量1-10倍的無水こ醇，攪拌均勻，溶解后得到“B”溶液，將“B”溶液通過離心機(jī)分離，除去其中的不溶物，得到河飩毒素上清液；將河飩毒素上清液倒入燒杯后，移到密閉容器中，然后在密閉容器內(nèi)放置一杯こ醚溶液，將密閉容器內(nèi)的溫度控制在10°C -35 °C ；當(dāng)こ醚向河飩毒素-醋酸-こ醇-水溶液擴(kuò)散后，經(jīng)過10-60小時(shí)的反應(yīng)，即可析出河飩毒素結(jié)晶，得到母液“C” ； ニ、高效液相色譜分離 將母液“C”真空加熱濃縮后，加入氨水將母液“C”pH值調(diào)節(jié)至7. 5-10后，析出沉淀物，將此沉淀物通過水洗、真空冷凍干燥處理后，即可獲得白色的含脫氧河飩毒素沉淀物；將此白色的含脫氧河飩毒素沉淀物加入濃度為20% -30%的醋酸或磷酸溶解，得到“D”溶液；使用高效制備液相色譜儀對(duì)“D”溶液進(jìn)行液相色譜分離，色譜條件C18反相柱；流動(dòng)相為含有l(wèi)mmol/L-15mmol/L離子對(duì)試劑的O. 05mol/L-0. 5mol/L緩沖液和O. 5% -5%甲醇，其流動(dòng)相的流速為6mL/min-15mL/min ;使用示差折光檢測器或紫外檢測器進(jìn)行檢測；在高效液相色譜分離過程中，按出峰圖譜可收集到脫氧河飩毒素的餾分； 三、層析脫鹽處理 將上述脫氧河飩毒素餾分，緩慢加入裝有生物凝膠或酸性陽離子樹脂的層析柱中，再用濃度為3% -20%的醋酸溶液進(jìn)行洗脫，收集pH值為4-7的餾分；然后使用氨水將此餾分的PH值調(diào)節(jié)至7. 5-10，即可析出白色固體；將白色固體經(jīng)過水洗和真空冷凍干燥處理后，即可得到純度較高的脫氧河飩毒素結(jié)晶。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種脫氧河飩毒素的提取方法，其特征在于所述的第二步驟中的離子對(duì)試劑，主要包括辛烷磺酸鈉、庚烷磺酸鈉、己烷磺酸鈉和戊烷磺酸鈉。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種脫氧河飩毒素的提取方法，其特征在于所述的緩沖液為磷酸鹽緩沖液或檸檬酸鹽緩沖液。
全文摘要
一種脫氧河鲀毒素的提取方法，先將粗品河鲀毒素用醋酸溶解，并加入無水乙醇攪拌均勻，離心除去其中的不溶物，得到河鲀毒素上清液，將上清液在裝有乙醚的密閉容器中加溫，析出河鲀毒素結(jié)晶，并得到母液；將上述母液濃縮后，加入氨水調(diào)節(jié)pH值，析出沉淀物，將此沉淀物通過處理后，即可獲得含脫氧河鲀毒素沉淀物；將此沉淀物加入醋酸或磷酸溶解，使用高效制備液相色譜儀對(duì)其進(jìn)行液相色譜分離，使用示差折光檢測器或紫外檢測器進(jìn)行檢測，按出峰圖譜可收集到脫氧河鲀毒素的餾分；將上述餾分，加入層析柱中，用醋酸溶液進(jìn)行洗脫，收集餾分；然后使用氨水調(diào)節(jié)此餾分的pH值即可析出白色固體將白色固體，經(jīng)過處理后，即可得到脫氧河鲀毒素結(jié)晶。
文檔編號(hào)C07D491/22GK102627652SQ20121007128
公開日2012年8月8日 申請日期2012年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月15日
發(fā)明者馮子龍, 吳新民, 趙振良, 趙海濤, 郝志毅, 黃海楓, 黃致強(qiáng) 申請人:河北省海洋與水產(chǎn)科學(xué)研究院