專利名稱：一種丙型肝炎病毒f蛋白的抗原構(gòu)象表位模擬肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種丙型肝炎病毒F蛋白抗原構(gòu)象表位模擬肽及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
國家衛(wèi)生部2011年12月發(fā)布的全國法定傳染病疫情報(bào)告顯示，我國28種傳染病中，病毒性肝炎的發(fā)病率及死亡率均位居第一。丙型肝炎病毒(h印atitis C virus, HCV) 是導(dǎo)致輸血性或社區(qū)獲得性非甲非乙型肝炎的主要病因，是丙型肝炎的病原體，在世界范圍內(nèi)的感染率是3%，感染者總計(jì)超過I. 7億。在我國，約75%的急性丙肝感染者會(huì)發(fā)展為慢性肝炎，約20%的患者最終發(fā)展為肝硬化和肝細(xì)胞肝癌等終末期肝病。HCV感染已成為我國乃至世界所面臨的嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生難題。丙型肝炎病毒是單股正鏈RNA病毒，黃病毒科丙肝病毒屬，基因組全長(zhǎng)9. 6kb，分為5’非翻譯區(qū)(UTR)、一個(gè)開放閱讀框(ORF)和3’非翻譯區(qū)，編碼10個(gè)主要蛋白C、EU E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。由于 HCV 是 RNA 病毒，RDRP 缺乏校驗(yàn)性，故 HCV 變異率高。目前的標(biāo)準(zhǔn)治療方案是聚乙二醇干擾素聯(lián)用利巴韋林，但平均應(yīng)答率不超過50%， 至今尚無有效的疫苗和特效治療藥物問市。故亟需對(duì)HCV的預(yù)防、控制和治療進(jìn)一步研究。除了以上10種蛋白之外，HCV基因組還編碼一種F蛋白(Synthesis of a novel hepatitis C virus protein by ribosomal frameshift. EMBO J,2001,20 (14) 3840-3848)，是HCV基因組C蛋白編碼移位的產(chǎn)物，在自然感染過程中即可出現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)， F蛋白在體外也可以形成與HCV病毒顆粒外形相似的，直徑約35nm的病毒樣顆粒，提示F蛋白可能參與HCV病毒顆粒的形成，在HCV的病毒生命周期中具有重要作用，并參與HCV的病理進(jìn)程(HCV F蛋白體外自組裝以及在HCV感染者肝組織中的分布研究。中華實(shí)驗(yàn)和臨床感染病雜志，2007，I (3) :138-139)。在不同臨床類型的丙肝患者中，中重度和肝硬化患者F抗體陽性率最高(Expression of hepatitis C virus F protein leads transfected cell to transformation. Journal of Nanjing University(natural sciences),2010,46, 40-42);且肝細(xì)胞肝癌慢性HCV患者F抗體陽性率高于非肝細(xì)胞肝癌慢性HCV患者(High levels of HCV core+1 antibodies in HCV patients with hepatocellular carcinoma. Journal ofGeneral Virology (2011) ,92 :1343-1351)。以上研究表明，F(xiàn) 蛋白抗體可能與丙型肝炎的病情進(jìn)展和預(yù)后有關(guān)，對(duì)患者體內(nèi)F蛋白抗體的檢測(cè)有助于丙型肝炎的控制和監(jiān)測(cè)。丙型肝炎病毒的檢測(cè)目前主要是針對(duì)上述10種結(jié)構(gòu)蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白的ELISA 檢測(cè)和HCV RNA定量等等。F蛋白抗體的檢測(cè)與HCV的診斷、病情進(jìn)展和預(yù)后有一定相關(guān)性，且F蛋白在HCV各種基因型間的同源率高于80%，交叉免疫原性好(CN 101407813B), 故可作為補(bǔ)充手段，加強(qiáng)對(duì)HCV控制和監(jiān)測(cè)，具有重要的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。確定蛋白質(zhì)或肽類抗原表位常用的方法有肽池測(cè)序、肽掃描、定點(diǎn)突變、組合肽庫法等。這些方法需要或者合成大量交疊肽，或者裂解為小肽，或者通過定點(diǎn)突變技術(shù)一個(gè)個(gè)改變氨基酸殘基，再通過多肽結(jié)合試驗(yàn)來測(cè)定，而且得到的結(jié)果通常是線性表位(藥物生物信息學(xué)?；瘜W(xué)工業(yè)出版社，2004)。研究顯示，蛋白質(zhì)或多肽刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體的表位， 90%為構(gòu)象性表位，僅10%為線性表位。因此，確定抗原的空間構(gòu)象表位對(duì)于抗原-抗體的免疫診斷和病毒疫苗和特效性藥物的開發(fā)具有更重要的意義(抗原表位預(yù)測(cè)的免疫信息學(xué)方法研究進(jìn)展。中國免疫學(xué)雜志，2008，24 =857-861)。本發(fā)明米用的卩遼菌體展不技術(shù)(Filamentousfusion phage novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science，1985， 228(4705) :1315-1317),是將外源蛋白與絲狀噬菌體融合展示于噬菌體顆粒表面，并能保持外源蛋白相對(duì)獨(dú)立的、原有的空間結(jié)構(gòu)。噬菌體肽庫是由大量的單個(gè)噬菌體組成，每個(gè)噬菌體可展示一個(gè)肽段，可用于展示不同肽段的重組噬菌體庫。噬菌體在其顆粒表面表達(dá)出外源蛋白后，以特異性抗體為靶分子，篩選隨機(jī)噬菌體12肽庫，并通過抗體濃度逐步降低、 洗脫液濃度逐步升高的方法，篩選出與特異性抗體親和力越來越高的攜帶特定構(gòu)象肽段的噬菌體陽性克隆，再以ELISA、免疫印跡法鑒定其與抗體的親和力，核酸測(cè)序確定其編碼基因，用生物信息學(xué)方法分析序列，最終確定特異的蛋白構(gòu)象模擬肽。目前，對(duì)HCV表位的研究主要是C區(qū)、E1/E2區(qū)、NS3、NS4、NS5區(qū)的表位，抗HCV血清學(xué)檢測(cè)主要來自這幾個(gè)區(qū)，C區(qū)構(gòu)象表位主要存在于19-26位，34-39位，73-83位氨基酸殘基(Identification of antigenic sites on three hepatitis C virus proteins using phage-displayed peptide libraries. J Med Virol,1998,56 :105-111)。El 區(qū)抗原性表位主要存在于297-306位氨基酸殘基，E2區(qū)抗原性表位主要存在于480-494位氛基酸殘基和 613-621 位氛基酸殘基(Mapping of a conformational epitope shared between El and E2 on the serum-derived human hepatitis C virus envelope. J Biol Chem，2003，278 :44385-44392)。NS3 區(qū)構(gòu)象表位位于 1396-1398，1376-1378 位氨基酸殘基(Characterization of mimotopes mimicking an immunodominant conformational epitope on the hepatitis C virus NS3 helicase. J Med Virol,2004, 72 :385-395)。NS4 區(qū)構(gòu)象表位包含 1698-1709 位氛基酸殘基(Usefulness of the phage display technology for the identification of a hepatitis C virus NS4A epitope recognized early in the course of the disease. J Viro Meth,2005,8 :9-17)。NS5 區(qū)抗原表位主要位于NS5A區(qū)2215-2313位氨基酸殘基，其中2238-2313位氨基酸殘基含有強(qiáng)的抗原性表位(Antigenic heterogeneity of the hepatitis C virus NS5A protein. J Clin Microbiol,2002,40 :61-67) 現(xiàn)今對(duì)丙肝病毒F蛋白抗原性的研究主要是包含線性表位的F基因全序列，有研究者采用原核表達(dá)的插入有大腸桿菌嗜性密碼子F蛋白的65 134位氨基酸制備檢測(cè)試劑盒(CN 101407813B)，該方法實(shí)現(xiàn)的關(guān)鍵是作為包被抗原的F蛋白片段(連續(xù)的70個(gè)氨基酸殘基序列)的獲取，由于所需分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的復(fù)雜性，其實(shí)現(xiàn)難度較大，制備成本較高；而如SEQ ID NO. I所示序列的采用噬菌體肽庫篩選丙肝病毒F蛋白的抗原構(gòu)象表位模擬肽至今未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是篩選出一種丙型肝炎病毒F蛋白抗原構(gòu)象表位模擬肽，利用噬菌體展示技術(shù)，以噬菌體隨機(jī)12肽庫與小鼠抗HCV-F抗體結(jié)合，篩選得到的由12個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的短肽。本發(fā)明的另一目的是提供上述丙型肝炎病毒F蛋白的抗原構(gòu)象表位模擬肽，在制備丙型肝炎F抗體的診斷試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)的一種丙型肝炎病毒F蛋白的抗原構(gòu)象表位模擬肽，其特征是由12個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的小肽，序列如SEQ ID NO. I所示SEQ ID NO. I :NH2-Lys-Pro-Ser-Gly-Asn-Leu-Gly-P;ro-Asp-Gly-Th;r-Se;r-COOH。編碼權(quán)利要求I所述的丙型肝炎病毒F蛋白的抗原構(gòu)象表位模擬肽的核苷酸序列。所述編碼權(quán)利要求I所述的丙型肝炎病毒F蛋白的抗原構(gòu)象表位模擬肽的核苷酸序列為5’ -AAGCCGTCTGGTAATTTGGGTCCGGATGGTACTTCT-3’ (SEQ ID NO. 7)。所述的丙型肝炎病毒F蛋白的抗原構(gòu)象表位模擬肽的融合蛋白。所述的丙型肝炎病毒F蛋白的抗原構(gòu)象表位模擬肽，在制備丙型肝炎F抗體的診斷試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的丙型肝炎病毒F蛋白抗原構(gòu)象表位模擬肽是用以下方法得到的首先用分子生物學(xué)方法擴(kuò)增丙肝病毒F蛋白基因進(jìn)行原核表達(dá)，純化重組F蛋白， 免疫BALB/c小鼠，分離抗血清制備小鼠抗F蛋白抗體。以純化的小鼠抗F蛋白抗體包被酶標(biāo)板，用噬菌體12肽庫進(jìn)行篩選，逐漸減少包被的小鼠抗F蛋白抗體的濃度并提高漂洗液中吐溫-20的濃度以加大篩選壓力，使洗脫下的噬菌體與靶分子結(jié)合的親和力越來越高， 特異性越來越強(qiáng)，經(jīng)過4輪篩選和ELISA鑒定獲得親和力強(qiáng)、特異性高的噬菌體陽性克隆， DNA測(cè)序并進(jìn)行序列分析，通過免疫印跡鑒定、生物信息學(xué)軟件DNAstar多重比對(duì)等方法， 確定丙型肝炎病毒F蛋白抗原構(gòu)象表位模擬肽序列。與野生型F蛋白氨基酸序列比較，該空間構(gòu)象抗原表位序列保守但并不連續(xù)，且能與F蛋白抗體特異性結(jié)合，由此確定該12肽為模擬的丙型肝炎病毒F蛋白抗原構(gòu)象表位。本發(fā)明有益效果本發(fā)明首次將噬菌體展示技術(shù)用于丙型肝炎病毒F蛋白的抗原構(gòu)象表位模擬肽篩選。采用噬菌體肽庫篩選F蛋白抗原構(gòu)象表位模擬肽，可在噬菌體顆粒表面展示F蛋白的天然空間構(gòu)象及生物活性，由此所得到的構(gòu)象表位，與采用化學(xué)或生物方法篩選得到的線型序列表位肽完全不同，但卻具有很好的免疫原性，較傳統(tǒng)方法相比，對(duì)于蛋白或多肽抗原構(gòu)象表位模擬肽的篩選具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。由于噬菌體表面的融合蛋白可以直接分泌到培養(yǎng)液中，免去了繁瑣的純化過程，而且噬菌體顆粒穩(wěn)定，更適用于研究和應(yīng)用。本發(fā)明所述的丙型肝炎病毒F蛋白的抗原構(gòu)象表位模擬肽，僅有12個(gè)氨基酸殘基，可以通過人工方法合成得到，為制備F抗體檢測(cè)試劑盒的包被抗原提供了更大的便捷， 可節(jié)省許多人力物力成本，對(duì)后期應(yīng)用于檢測(cè)試劑、疫苗和藥物的開發(fā)具有明顯而不可替代的優(yōu)勢(shì)。


圖I :純化后的HCV-F蛋白的SDS-PAGE電泳分析，其中M :蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 :純化后重組F蛋白；2 :全菌沉淀(陽性對(duì)照);3 :空質(zhì)粒的對(duì)照菌TGl (陰性對(duì)照);圖2純化后的抗HCV-F抗體的Western blot (免疫印跡)分析，其中M :蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，I :F蛋白SDS-PAGE電泳結(jié)果，2 :F蛋白與抗HCV-F陽性血清反應(yīng)，3 :對(duì)照小鼠血清 (陰性對(duì)照)；圖3 :噬菌體肽庫生物淘洗流程。圖4 :陽性噬菌體克隆單鏈模板的DNA電泳分析M，DNAmarker DL 2000 ;1 15， 第四輪淘篩后15個(gè)陽性噬菌體克隆單鏈模板。圖5 :陽性噬菌體、空載體與F蛋白、抗HCV-F抗體競(jìng)爭(zhēng)抑制性ELASA實(shí)驗(yàn)。圖6-1 圖6-9 :丙肝病毒F蛋白氨基酸序列與重組F蛋白及陽性噬菌體克隆12 肽序列比對(duì)；Fl ACJ04214. I ；F2 ACJ04212. I ；F3 ACJ04207. I ；F4 ACJ04205. I ；F5 ACH99675. I ；F6 ACH99673. I ；F7 ACH99671. I ；F8 ACH99649. I ；F9 ACE82437. I ；F10 ABV46152. 2 ；F11 ACA50643. I ；F12 ABV46061. 2 ；F13 ABV46241. I ；F14 ABV46229. I ；F15 ABV46227. I ；F16 :重組 F蛋白；F epito :嗤囷體陽性克隆白勺12妝序列。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作更進(jìn)一步的說明。結(jié)合

本發(fā)明的具體實(shí)施方法，如下實(shí)施例I、丙型肝炎病毒F蛋白的原核表達(dá)和純化I、材料E. coli TGl 購自 Stratagen 公司。IPTG購自 Promega 公司。Glutathione Sepharose 4B凝膠購自Pharmacia公司。PCR試劑盒購自申能博彩公司。引物由上海博亞公司合成。各種限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、載體及蛋白Marker購自TaKaRa公司。DNA凝膠回收試劑盒購自上海華舜公司。2、方法I)引物上游引物Pl :5' -GT GGATCC AGCACAAATCCTAAGCCTCAGAG-3; (SEQ ID NO. 2)；上游引物P2:5' -CTAAGCCTCAGAGAAAGCCAAACGTAACACC-3' (SEQ ID NO. 3)；上游引物P3 :5' -GT GGATCC CCAAACGTAACACC-3' (SEQ ID NO. 4)；下游引物P4 :5' -GA GAATTC GCAACCAGGCAGA-3' (SEQ ID NO. 5) 上述引物參照南京醫(yī)科大學(xué)蔣春梅的碩士學(xué)位論文《丙型肝炎病毒F蛋白基因的克隆表達(dá)及初步應(yīng)用研究》。其中P1、P3中斜粗體下劃線部分為BamH I酶切位點(diǎn)，P4中斜粗體下劃線部分為EcoR I酶切位點(diǎn)，為保證酶切位點(diǎn)的有效切割，在切割序列外側(cè)設(shè)有保護(hù)性堿基。2) PCR擴(kuò)增反應(yīng)HCV-F (PCR 總反應(yīng)體系共 20 μ I) ddH20 13. 7 μ 1，10XPCR Buffer 2· 0 μ 1， MgCl2 (25mmol/l) I. 2 μ 1，dNTP Mixture (10mmol/l) O. 2 μ I，上游引物(25 μ mol/L) O. 2 μ 1， 下游引物(25ymol/L)(X 2μ 1，Taq DNA 聚合酶(λ 5 μ 1，HCV cDNA(模板)2· O μ 1，合計(jì) 20. O μ I混勻。上述試劑加入PCR反應(yīng)管中混勻后稍離心，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
第I輪用P3、P4作為引物擴(kuò)增HCV cDNA，擴(kuò)增條件:95°C預(yù)變性4min，95°C 40s， 55°C 30s, 72°C 60s，共35個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增出20 160aa的序列。再分別利用(P2、P4)和(P1、P4)兩對(duì)引物進(jìn)行第2輪和第3輪擴(kuò)增，以加上O框前10個(gè)aa序列第2輪用P2、P4引物擴(kuò)增第I輪的PCR產(chǎn)物，擴(kuò)增條件95°C 40s，50°C 30s， 72°C 60s，共35個(gè)循環(huán)；第3輪用P1、P4引物擴(kuò)增第2輪的PCR產(chǎn)物，。擴(kuò)增條件95°C 40s，52°C 30s， 72°C 60s，共35個(gè)循環(huán);最后72°C延伸IOmin0取8 μ . I擴(kuò)增產(chǎn)物用I. O %瓊脂糖凝膠(含EB)電泳。3)重組表達(dá)載體 pGEX-4T-2-F 的構(gòu)建 HCV-F(ddH20 27. O μ I, Buffer 6· O μ I， DNA25. O μ 1，BamH I I. O μ 1，EcoR I I. O μ I)和 pGEX_4T_2 載體(ddH20 32. 0 μ I, Buffer 6. 0μ I, DNA 20. 0 μ 1，BamH I I. O μ 1，EcoR I I. O μ I)用 EcoR I 及 BamH I 雙酶切后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，按DNA膠回收試劑盒的操作說明回收目的片斷。將回收的HCV-F基因和pGEX-4T-2載體用T4DNA連接酶于16°C連接過夜，并轉(zhuǎn)化用氯化鈣法制備的感受態(tài)大腸桿菌TG1。在鋪有IPTG及X-Gal的氨芐青霉素平板上于37°C培養(yǎng)過夜，次日進(jìn)行藍(lán)白菌落篩選。挑取白色菌落，以堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA，進(jìn)行雙酶切及測(cè)序鑒定為PGEX-4T-2-F重組表達(dá)載體。4)融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化將以PGEX-4T-2-F轉(zhuǎn)化的大腸桿菌接種到LB培養(yǎng)基中(含有100mg/L的氨芐青霉素)，于37°C搖床振蕩培養(yǎng)至A6tltl = O. 6 O. 8左右。加入終濃度為O. lmmol/L的IPTG，于37°C誘導(dǎo)培養(yǎng)4h。收取菌液，于4°C以4000rpm離心 IOmin,棄去上清，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。每Ig大腸桿菌沉淀加入5mL冰浴的裂解緩沖液中 (含有l(wèi)ml/L的TritonX-100，lmmol/L蛋白酶抑制劑PMSF的磷酸鹽緩沖液，pH7. 4)，用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)破碎菌體，直至細(xì)胞懸浮液變得澄清(冰浴條件下進(jìn)行)。將裂解液于4°C以 12000rpm離心15min,收集上清液，與Glutathione Sepharose 4B混勻，于室溫?cái)嚢杌靹颉?將混合液體緩緩加入親和層析柱上，用10倍體積的PBS (pH7. 4)洗滌柱子3次，再用洗脫液 (10mmol/L還原型谷胱甘肽及50mmol/L的Tris_HCl，pH8. 0)洗脫。室溫靜置IOmin后，收集洗脫下來的蛋白溶液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定(圖I)，于_30°C保存?zhèn)溆?。?shí)施例2、F蛋白抗體的純化與鑒定I)材料HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自南京阿恩地公司。6 8周齡BALB/c小鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，由南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所飼養(yǎng)。福氏完全佐劑和福氏不完全佐劑均為sigma產(chǎn)品。Western blot試劑盒購自華美生物工程公司。2)抗HCV-F抗體的制備分光光度計(jì)法測(cè)得純化的HCV-F濃度是I μ g/ μ L，按I : I 體積比混勻抗原和佐劑，用無菌注射器反復(fù)抽吸30min使其完全乳化。2只小鼠作為空白對(duì)照，8只進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn)。第一周，初次免疫40 μ g/只的劑量對(duì)小鼠進(jìn)行多點(diǎn)皮下注射乳化后的抗原和福氏完全佐劑。第三周，以20yg/只(抗原和福氏不完全佐劑)的劑量進(jìn)行注射加強(qiáng)免疫。第二次免疫I周以后，剪鼠尾采血，用間接ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)超過 I 10000。接著以劑量20 μ g/只(不加佐劑)加強(qiáng)免疫I次，I周后摘眼球取血。分離血清，-20°C保存。3)間接ELISA測(cè)定抗體效價(jià)方陣滴定法確定包被抗原的稀釋度是I : 100 (濃度為10 μ g/ml)，每孔加入100 μ I用包被緩沖液I : 100稀釋的抗原，濕盒4°C過夜，棄去孔內(nèi)液體，加入封閉液，37°C放置lh。洗滌5次，加入100 μ I I 50,1 100，I 200，I 400， I 800，I 1600，I 3200，I 6400，I 10000，I 20000 稀釋的抗體和陰性對(duì)照(正常鼠血清)、空白對(duì)照(封閉液)，37°C放置lh。洗滌5次，每孔加入100 μ 1，I 3000稀釋的HRP羊抗鼠IgG。37°C放置lh。每孔加入TMB底物A、B液各一滴，37°C避光顯色15min， 再分別加入2mol/L硫酸50 μ I終止反應(yīng)，立即用酶標(biāo)儀測(cè)定A450值，測(cè)得血清抗體效價(jià)> I 10000。4)抗HCV-F抗體的Western blot檢測(cè)將融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后再電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。以5g/L脫脂奶粉封閉lh，依次滴加(I 100)鼠抗HCV-F抗血清(室溫反應(yīng) 2h，TBS洗滌4次)及(I 1000)羊抗鼠IgG(室溫反應(yīng)2h，TBS洗滌4次)，然后用DAB溶液顯色(圖2)，雙蒸水沖洗終止反應(yīng)。實(shí)施例3、噬菌體隨機(jī)肽庫篩選1)M13 卩遼菌體十二妝庫(Ph. D. -12 Phage Display Peptide Library Kit)購自 New England Biolabs 公司2)篩選方法將稀釋于包被液(碳酸緩沖溶液，pH 9. 6)中的鼠抗HCV-F抗體 (100yg/ml)包被酶標(biāo)板，4°C過夜，加入封閉液4°C 2-3小時(shí)，用TBST洗滌，甩干洗滌液。每孔加入稀釋的噬菌體隨機(jī)肽庫，每輪加入的噬菌體數(shù)量均應(yīng)在2 X IO1ch11CFU,室溫孵育I小時(shí)，甩掉液體，用含O. I %吐溫-20 (v/v)的TBST緩沖液漂洗，最后用100 μ I pH 2. 2甘氨酸-鹽酸緩沖液洗脫與F蛋白抗體特異性結(jié)合的噬菌體，并立即用10 μ I pH 9. 8Tris緩沖液中和，取10 μ I進(jìn)行噬菌體滴度測(cè)定，其余噬菌體轉(zhuǎn)入新鮮菌液(ER27380D = O. 2 O. 4) 中進(jìn)行擴(kuò)增，37°C 4-5小時(shí)后，4°C，IOOOOrpm離心lOmin，取上清重復(fù)離心一次，用PEG沉淀收獲噬菌體，經(jīng)梯度稀釋滴定后投入下一輪篩選(圖3)。第二輪篩選時(shí)，抗HCV-F抗體的包被濃度為50 μ g/ml, TBST漂洗液中吐溫-20濃度為O. 3% (v/v)。第三輪篩選時(shí)抗HCV-F 抗體的包被濃度為20 μ g/mL, TBST漂洗液中吐溫-20濃度為O. 5% (v/v)。第四輪篩選時(shí)抗HCV-F抗體的包被濃度為10 μ g/ml, TBST漂洗液中吐溫濃度為O. 5% (v/v)。實(shí)施例4、噬菌體滴度的測(cè)定每輪篩選都必須對(duì)投入和洗脫下來的噬菌體進(jìn)行滴定測(cè)定，計(jì)算產(chǎn)率。將待測(cè)噬菌體梯度(I : 10 I : IO12)稀釋，加到含有大腸桿菌ER2738 (0D為O. 2 O. 4)的LB培養(yǎng)基中，孵育1-5分鐘，加入熔化的45°C頂層瓊脂中，立即均勻鋪于含X-gal和IPTG的底層LB瓊脂板上。37°C過夜，計(jì)數(shù)藍(lán)色克隆數(shù)并計(jì)算噬菌體滴度。生物淘洗的產(chǎn)率根據(jù)該公式進(jìn)行計(jì)算產(chǎn)率=洗出噬菌體數(shù)/投入噬菌體數(shù)。隨著淘篩的進(jìn)行，洗脫下來的噬菌體與 F蛋白抗體的親和力越來越高，產(chǎn)率也逐漸升高，與F蛋白結(jié)合陽性的噬菌體克隆得到富集 (表 I)。表I
Unit第一輪第二輪第三輪第四輪投入噬菌體數(shù)6 X IO93. 6 X IO9I. 8 X IO10I. IXlO10
實(shí)施例5、噬菌斑的擴(kuò)增及噬菌體陽性克隆的鑒定挑取在LB (Tet/IPTG/X-gal)平板上生長(zhǎng)的ER2738單克隆于LB (Tet抗性)培養(yǎng)液中，37°C搖床250rpm擴(kuò)增至OD6tltl = 0.4 O. 5，用LB (Tet抗性)培養(yǎng)液I 10稀釋，每個(gè)試管中加入2ml。第四輪淘洗后的洗脫產(chǎn)物經(jīng)梯度稀釋滴定，挑取在LB平板(Tet/IPTG/ X-gal)上生長(zhǎng)的單個(gè)藍(lán)色噬菌體克隆接種到含2ml大腸桿菌ER2738的LB培養(yǎng)液中，37°C 搖床250rpm 4 5h。離心棄沉淀，上清用PEG沉淀噬菌體，并用等體積TBS重懸。將擴(kuò)增重懸于TBS的噬菌體加入到包被抗HCV-F抗體的酶標(biāo)板(10 μ g/mL)上，以空的M13噬菌體作陰性對(duì)照，37°C孵育lh，TBST漂洗三次，加入I : 5000倍稀釋的HRP標(biāo)記的鼠抗HCV-F 抗血清，37°C孵育Ih，漂洗后加OPD底物顯色，酶標(biāo)儀檢測(cè)A49tlt5以P/N > 2. I者判為陽性， 測(cè)得結(jié)果(圖5)。實(shí)施例6、陽性噬菌體克隆DNA序列的測(cè)定與分析參照Ph.D.-12 Phage Display Peptide Library Kit 的卩遼菌體單鏈DNA模板抽提方法提取ssDNA。用大腸桿菌ER2738對(duì)15個(gè)陽性噬菌體克隆進(jìn)行擴(kuò)增，當(dāng)含有四環(huán)素的 LB培養(yǎng)液中的大腸桿菌ER2738株處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)初期(0D_ = O. 4 O. 5)時(shí)，取5ml該菌液加入50 μ I單克隆噬菌體上清，370C，250rpm搖4. 5_5h ;培養(yǎng)液4°C，IOOOOrpm,離心5min, 取上清重復(fù)離心一次，再取80%上清。取Iml噬菌體上清加入400 μ I PEG，4°C IOmin沉淀曬菌體；4°C，12000rpm離心IOmin,獲得卩遼菌體沉淀;加入200 μ I Loddie Buffer (IOmM Tris-HCl, pH8. O, ImM EDTA，4M Nal，常溫避光保存)，重懸噬菌體；加入500 μ I無水乙醇， 混勻室溫放置lOmin, 12000rpm離心IOmin,棄上清,用70%乙醇洗漆沉淀,室溫干燥5min, 將沉淀溶于30 μ I滅菌超純水中，取5μ I進(jìn)行電泳分析(圖4)，剩余的噬菌體單鏈模板用96gIII測(cè)序引物進(jìn)行Sanger雙脫氧法核酸序列自動(dòng)測(cè)序，M13_96gIII測(cè)序引物序列為 5’-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’ (SEQ ID NO. 6)。結(jié)果顯示挑取的15個(gè)陽性噬菌體克隆插入的核酸序列完全一致，編碼鏈序列均為5’-AAGCCGTCTGGTAATTTGGGTCCGGATGGTACTTCT-3’ (SEQ ID NO. 7)，根據(jù)噬菌體肽庫說明書中提供的M13噬菌體密碼子表，翻譯出展示于陽性曬菌體表面的 12 妝為 NH2-Lys-Pro-Ser-Gly-Asn-Leu-Gly-Pro-Asp-Gly-Thr-Ser-COOH (S EQ ID NO. I)。實(shí)施例7、陽性噬菌體克隆的特異性檢測(cè)競(jìng)爭(zhēng)性抑制ELISA :將稀釋于包被液(pH 9. 6的碳酸鹽緩沖液)中的抗HCV-F抗體(100 μ g/ml)包被96孔酶標(biāo)板，4°C過夜，BSA封閉。純化的重組F蛋白或抗HCV-F抗體與等體積的噬菌體培養(yǎng)上清混合，加入酶標(biāo)板中37°C孵育lh。TBST漂洗三次，加入HRP標(biāo)記的鼠抗M13單克隆抗體，37°C孵育lh，漂洗后加底物OPD顯色15分鐘，顯色結(jié)束后用2M 硫酸終止顯色反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測(cè)A49(i。按如下公式計(jì)算競(jìng)爭(zhēng)抑制率[(A1-A2)/Al] X100%, Al為無抑制物競(jìng)爭(zhēng)時(shí)的A49tl, A2為有抑制物競(jìng)爭(zhēng)時(shí)的A49tlt5陽性噬菌體克隆與重組F蛋白之間的特異性結(jié)合可被鼠抗HCV-F抗血清和重組F蛋白所抑制，競(jìng)爭(zhēng)抑制率分別為68. 3% 和64. 4% (如圖5)。實(shí)施例8、序列比對(duì)和分析
從NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫上搜索不同來源的F蛋白氨基酸序列，用DNAstar中的 MegAlign組件，將重組F蛋白和另外15個(gè)來源于不同基因型的丙肝病毒F蛋白的氨基酸序列與噬菌體陽性克隆的12肽序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)12個(gè)氨基酸殘基與15個(gè)不同來源的丙肝病毒F蛋白序列一致，但并不連續(xù)(圖6-1 圖6-9)。這12個(gè)保守的氨基酸分別是 Lys (6)、Pro (7)、Ser (24)、Gly (40)、Asn (63)、Leu (64)、Gly (74)、Pro (75)、Asp (95)、 Gly (96)、Thr (111)、Ser (139)。由于一級(jí)結(jié)構(gòu)上呈不連續(xù)性且距離較遠(yuǎn)(大約在133個(gè)氨基酸殘基的范圍內(nèi))，故不能確定為線性表位，此乃構(gòu)象表位。實(shí)施例9、衣殼蛋白gill融合了 F蛋白12肽抗原構(gòu)象表位模擬肽的噬菌體的擴(kuò)增噬菌體12肽庫是通過把隨機(jī)12肽與噬菌體表面的gill蛋白融合，將12肽表達(dá)在噬菌體衣殼蛋白gill的N末端形成12肽-gill融合蛋白，再經(jīng)過噬菌體衣殼蛋白的裝配,將12肽展不于曬菌體顆粒的表面。用大腸桿菌ER2738對(duì)展示丙肝病毒F蛋白12肽抗原構(gòu)象表位模擬肽的噬菌體克隆進(jìn)行擴(kuò)增，當(dāng)含有四環(huán)素的LB培養(yǎng)液中的大腸桿菌ER2738株處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)初期(OD6tltl = O. 4 O. 5)時(shí)，取20ml該菌液加入200 μ I單克隆噬菌體上清，37°C，250rpm搖4. 5 5h ; 培養(yǎng)液4°C，IOOOOrpm，離心5min，取上清重復(fù)離心一次，再取80%上清。每毫升噬菌體上清加入400 μ I PEG, 4°C IOmin沉淀噬菌體；4°C，12000rpm離心IOmin,獲得噬菌體沉淀，用 4ml生理鹽水重懸。每個(gè)噬菌體衣殼蛋白gill的N端都融合了丙肝病毒F蛋白12肽抗原構(gòu)象表位模擬肽。實(shí)施例10、丙型肝炎F抗體診斷試劑盒的構(gòu)建直接以人工合成的SEQ ID No. I所示的模擬抗原表位12肽作為抗原，以終濃度 10 μ g/ml稀釋于包被液(碳酸緩沖溶液，pH 9. 6)中，以每孔100 μ I包被96孔酶標(biāo)板， 37°C，2h，PBST洗板三次，用5%脫脂奶粉，4°C封閉過夜；棄封閉液，PBST洗板3次，每孔加入100 μ I I 400倍稀釋的經(jīng)丙肝病毒F蛋白免疫的BALB/c小鼠抗血清，同時(shí)以等量 I 400倍稀釋的免疫前小鼠血清做陰性對(duì)照，免疫血清和陰性對(duì)照血清各做3個(gè)重復(fù)孔， 37°C孵育2小時(shí)，PBST洗板3次，每孔加入100 μ I I 1000倍稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠 IgG, 37°C溫育lh，PBST洗板三次，以TMB顯色試劑盒進(jìn)行顯色，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔A45(l。免疫小鼠血清平均A450為O. 485，陰性對(duì)照血清平均A450為O. 102，符合P/N > 2. I的判斷標(biāo)準(zhǔn)。
10
權(quán)利要求
1.一種丙型肝炎病毒F蛋白的抗原構(gòu)象表位模擬肽，其特征是由12個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的小肽，序列如SEQ ID NO. I所示。
2.編碼權(quán)利要求I所述的丙型肝炎病毒F蛋白的抗原構(gòu)象表位模擬肽的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于序列如SEQID NO. 7所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的丙型肝炎病毒F蛋白的抗原構(gòu)象表位模擬肽的融合蛋白。
5.一種權(quán)利要求I所述的丙型肝炎病毒F蛋白的抗原構(gòu)象表位模擬肽，在制備丙型肝炎F抗體的診斷試劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)及免疫學(xué)領(lǐng)域，公開了丙型肝炎病毒F蛋白的抗原構(gòu)象表位模擬肽及其應(yīng)用。該丙型肝炎病毒F蛋白的抗原構(gòu)象表位模擬肽的序列為SEQIDNO.1。本發(fā)明采用噬菌體展示技術(shù)，以鼠抗HCV-F抗血清為包被抗體，篩選了噬菌體12肽庫，然后對(duì)四輪篩選后得到陽性克隆采用ELISA、DNA測(cè)序、免疫印跡、生物信息學(xué)分析等方法，最終找到了能與鼠抗HCV-F抗體特異性結(jié)合的丙型肝炎病毒F蛋白的抗原構(gòu)象表位模擬肽。本發(fā)明提供的丙型肝炎病毒F蛋白抗原構(gòu)象表位模擬肽可用于制備丙型肝炎F抗體診斷試劑盒。對(duì)于丙型肝炎的預(yù)防、控制具有重要的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號(hào)C07K7/08GK102584952SQ201210075990
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月21日
發(fā)明者余曉杰, 孔晶, 岳明, 張?jiān)? 張錦海, 徐孝東, 鄧小昭, 韋娟, 魯衛(wèi)東 申請(qǐng)人:中國人民解放軍南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所, 中國藥科大學(xué), 昆明醫(yī)學(xué)院