專利名稱：一種草魚白細(xì)胞介素10酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于酶聯(lián)免疫檢測(cè)(ELISA)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種草魚白細(xì)胞介素 10競(jìng)爭(zhēng)抑制酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
白細(xì)胞介素10 (interleukin-10, IL-10)是一種重要的細(xì)胞因子。1989年 Fiorentino等發(fā)現(xiàn)小鼠Th2細(xì)胞能分泌一種抑制Thl細(xì)胞分泌干擾素等細(xì)胞因子的物質(zhì)，因此將這種物質(zhì)命名為細(xì)胞因子分泌抑制因子(cytokine synthesis inhibiting factor, CSIF)，后稱為白細(xì)胞介素10。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，該細(xì)胞因子對(duì)炎癥、惡性腫瘤、自身免疫性疾病起重要作用。它能抑制T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的增值分化，同時(shí)也能促進(jìn)B細(xì)胞的穩(wěn)定分化，它的免疫多樣性使其在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用。目前的研究還表明，白細(xì)胞介素10對(duì)于炎癥性動(dòng)物有免疫調(diào)節(jié)功能和可能的治療作用。草魚(Ctenopharyngodon idellus)屬鯉形目鯉科雅羅魚亞科草魚屬，俗稱有 鯇、油鯇、草鯇、白鯇、草魚、草根(東北)、混子、黑青魚等。英文名=Grass carp。因其生長(zhǎng)迅速，飼料來(lái)源廣，是中國(guó)淡水養(yǎng)殖的四大家魚之一，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。但草魚抗病力和成活率較低，易患出血病、爛鰓病、赤皮病和腸炎病等，加之高密度養(yǎng)殖增加了水產(chǎn)動(dòng)物之間病原體交叉感染的機(jī)會(huì)，使病害日益加劇，因此研究草魚免疫系統(tǒng)的各類免疫反應(yīng)及其機(jī)制十分必要。白細(xì)胞介素10在魚類免疫反應(yīng)中具有廣泛生物學(xué)活性，對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)控發(fā)揮著必不可少的作用，因此檢測(cè)草魚中IL-IO的分泌狀況不僅有利于了解草魚免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，而且為開展該魚類的疾病防治提供有用信息。但是，目前魚類IL-IO的分泌檢測(cè)方法并沒(méi)建立，主要因?yàn)橛补囚~IL-IO與哺乳動(dòng)物、兩棲動(dòng)物的IL-IO兩棲動(dòng)物的IL-IO分子結(jié)構(gòu)差異較大，不能用其他種族的IL-IO抗原及其抗體代替分析檢測(cè)硬骨魚IL-10。同時(shí)魚類IL-IO抗體的缺乏使對(duì)IL-IO的分泌檢測(cè)和功能的精細(xì)鑒定陷入瓶頸。本研究通過(guò)重組蛋白草魚IL-10制備多克隆抗體，并成功建立IL-10的ELISA檢測(cè)系統(tǒng)，為檢測(cè)IL-10的分泌及闡明其功能地位提供了基礎(chǔ)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立草魚白細(xì)胞介素10ELISA檢測(cè)方法，可用于草魚IL-10蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)，由于采用多克隆抗體，費(fèi)用較低且具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，檢測(cè)限為
O.1 -100ng/mT,n為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明利用重組表達(dá)的草魚白細(xì)胞介素10作為免疫原免疫健康白兔得到多克隆抗體，再用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記該多克隆抗體，最后用重組草魚白細(xì)胞介素10蛋白和HRP標(biāo)記的多克隆抗體建立競(jìng)爭(zhēng)抑制酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法。上述技術(shù)方案包括以下步驟I)抗原蛋白的制備將草魚IL-IOcDNA序列克隆到原核表達(dá)載體pET_30a (+)中，構(gòu)建重組原核表達(dá)載體，并將此載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行原核表達(dá)(周紅、韋鶴、汪新艷，一種草魚白細(xì)胞介素10基因和蛋白及其重組表達(dá)方法，中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?01110096027. I)。所得重組蛋白即為抗原蛋白。2)草魚白細(xì)胞介素10多克隆抗體的制備以重組草魚白細(xì)胞介素10蛋白為抗原，免疫新西蘭大白兔并利用多克隆抗體制備與純化技術(shù)獲得草魚白細(xì)胞介素10多克隆抗體，該抗體可與草魚白細(xì)胞介素10特異的結(jié)合。3)草魚白細(xì)胞介素10多克隆抗體的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記采用馬來(lái)酰亞胺活化的辣根過(guò)氧化物酶試劑盒(購(gòu)自Thermo Scientific公司) 標(biāo)記草魚IL-10多克隆抗體。4) ELISA 操作方法(I)經(jīng)過(guò)棋盤滴定法確定ELISA檢測(cè)時(shí)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的草魚白細(xì)胞介素10 多克隆抗體的最適稀釋倍數(shù)為I : 2000，包被抗原的濃度為2 μ g/mL，每孔100 μ L。(2)包被以O(shè). 05Μ的碳酸鹽緩沖液稀釋草魚白介素10重組蛋白至2μ g/mL，以此作為包被原加入酶標(biāo)板中，每孔100μ 1，4°C孵育過(guò)夜后甩干孔內(nèi)液體，并用PBST洗滌三次，每次300 μ I/孔，3分鐘每次。(3)封閉用封閉液(PBS稀釋的5%脫脂奶粉、O. 3% BSA溶液)室溫封閉兩小時(shí)， 300 μ I/孔。(4)酶標(biāo)抗體與待測(cè)抗原的孵育用抗原/抗體稀釋液(PBST)將重組草魚重組 IL-10 蛋白稀釋到對(duì)應(yīng)濃度(O. 2ng/mL、lng/mL、5ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、100ng/mL、 200ng/mL)作為標(biāo)準(zhǔn)品，取各標(biāo)準(zhǔn)品50 μ I與50 μ IHRP-ILlOAb (PBST做IO3倍稀釋)混勻后室溫孵育2小時(shí)。對(duì)待測(cè)樣品的檢測(cè)取待測(cè)樣品50 μ I后與50 μ I I 1000稀釋的 HRP-ILlOAb混合，同樣室溫孵育2小時(shí)。酶標(biāo)板封閉完成后甩干封閉液，并用300 μ I PBST 洗滌三次,加入上述抗原抗體混合液,室溫孵育2小時(shí)。(5)顯色甩干孔內(nèi)液體，用300 μ I PBST洗滌五次，每次3分鐘，洗滌后一定注意甩干孔內(nèi)液體，然后加入100 μ I TMB底物，37°C反應(yīng)20分鐘后加入50 μ I 2Μ H2SO4終止反應(yīng)。(6)讀數(shù)、結(jié)果處理采用酶標(biāo)儀在吸光度450nm下讀取數(shù)據(jù)，根據(jù)所得數(shù)據(jù)計(jì)算樣品抑制率。樣品抑制率％ =陰性樣品吸光值-標(biāo)準(zhǔn)品/待測(cè)樣品吸光值)/陰性樣品吸光值X 100%,最后以標(biāo)準(zhǔn)品抑制率為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線， 以標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行定量分析。本發(fā)明的有益效果以重組草魚IL-10蛋白作為包被原，建立了草魚IL-10檢測(cè)的 ELISA方法，為檢測(cè)草魚中白細(xì)胞介素10的蛋白表達(dá)水平提供了快速高效的檢測(cè)手段，該法穩(wěn)定可靠，且成本較低。


圖I是western blotting驗(yàn)證草魚白細(xì)胞介素10多克隆抗體特異性膠圖，圖中泳道I為重組草魚白細(xì)胞介素10,泳道2為草魚頭腎白細(xì)胞蛋白,A圖中一抗孵育液為草魚白細(xì)胞介素10多克隆抗體稀釋液，B圖中一抗孵育液為相同比例稀釋的對(duì)照組(未經(jīng)重組草魚白細(xì)胞介素10蛋白免疫的新西蘭大白兔)兔血清。圖2是草魚白細(xì)胞介素10ELISA檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式下面，結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)的說(shuō)明。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。一 試劑馬來(lái)酰亞胺活化的辣根過(guò)氧化物酶試劑盒購(gòu)自Thermo Scientific公司四甲基聯(lián)苯胺(TMB)購(gòu)自天根生物技術(shù)公司其他試劑均為分析純?cè)噭┒?步驟I、免疫原的制備將草魚IL-lOcDNA序列克隆到原核表達(dá)載體pET_30a(+)中，構(gòu)建重組原核表達(dá)載體，并將此載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)ImM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白IL-10，該蛋白主要以可溶形式表達(dá)，采用Ni2+親和層析和凝膠過(guò)濾層析純化得到重組草魚IL-10蛋白。(周紅、韋鶴、汪新艷，一種草魚白細(xì)胞介素10基因和蛋白及其重組表達(dá)方法，中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?201110096027. I)。2、草魚白細(xì)胞介素10多克隆抗體的制備選取4只2月齡、體重I. 5-2kg的健康新西蘭大白兔，雌雄各半，每?jī)芍粸橐粋€(gè)實(shí)驗(yàn)組，將免疫原用生理鹽水溶解，配成2mg/mL的溶液后與等量的完全弗氏佐劑混合用攪拌法將其乳化，乳化直至將一滴乳劑滴入水中不散開漂在水面上為止。初次免疫將乳化好的試劑于兔子背部多點(diǎn)注射，每只注射lmL。初次免疫后進(jìn)行4次加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫用弗氏不完全佐劑乳化，加強(qiáng)免疫用肌肉注射，每隔10天加強(qiáng)免疫一次，劑量與初次免疫相同。最后一次加強(qiáng)免疫后從耳緣靜脈采血，采用直接酶聯(lián)免疫法測(cè)定抗體效價(jià)，確定抗體效價(jià)可用后耳靜脈和心臟同時(shí)放血獲得抗血清，收集于50mL離心管中。將此抗血清經(jīng)過(guò)高速離心并過(guò)濾后進(jìn)行純化，最后將抗體保存在含有50%甘油、O. 05% NaN3的PBS溶液中，-20°C冷凍保存。3、草魚白細(xì)胞介素10多克隆抗體的特異性驗(yàn)證收集草魚頭腎白細(xì)胞總蛋白作為待測(cè)樣品，重組草魚白細(xì)胞介素10蛋白為陽(yáng)性對(duì)照，用western blotting方法檢測(cè)所獲得的草魚白細(xì)胞介素10多克隆抗體特異性,實(shí)驗(yàn)證明所制備多克隆抗體能特異識(shí)別草魚白細(xì)胞介素10蛋白(如附圖I)。4、草魚IL-10多克隆抗體的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記采用Thermo Scientif ic公司的馬來(lái)酰亞胺活化的辣根過(guò)氧化物酶試劑盒標(biāo)記草魚IL-10多克隆抗體。5、ELISA 反應(yīng)過(guò)程I)經(jīng)過(guò)棋盤滴定法確定ELISA檢測(cè)時(shí)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的草魚白細(xì)胞介素10 多克隆抗體的最適稀釋倍數(shù)為I : 2000，包被抗原的濃度為2 μ g/mL，每孔100 μ L。2)將重組草魚白細(xì)胞介素10蛋白用包被緩沖液稀釋到2 μ g/mL，在酶標(biāo)板中每空加入100μ 1，4°C孵育過(guò)夜。次日取出酶標(biāo)板傾去孔中液體,甩干后用PBST洗滌四次，每次洗滌加入PBST 300 μ 1，洗滌3分鐘。
3)封閉充分洗滌后，用封閉緩沖液封閉酶標(biāo)板，300 μ I/孔，室溫孵育2小時(shí)。4)酶標(biāo)抗體與待測(cè)樣本/標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)合將IL-10酶標(biāo)抗體(I 1000稀釋，稀釋液為PBST) 50 μ I與50 μ I待測(cè)樣品或50 μ I標(biāo)準(zhǔn)品(標(biāo)準(zhǔn)品為按特定濃度稀釋的重組草魚IL-10蛋白)混合，充分混勻后室溫孵育2小時(shí)。5)封閉完成后傾去板內(nèi)封閉液，用PBST洗滌3次，每次每孔加入PBST 300 μ 1，洗滌3分鐘。6)洗滌后加入3)中孵育的抗原抗體復(fù)合物，每孔100 μ I，室溫孵育2小時(shí)。7)傾去板內(nèi)液體，用PBST洗滌5次，每次每孔用300 μ I PBST，洗滌三分鐘。8)充分洗滌后，徹底甩干孔內(nèi)液體，加入100 μ I TMB，37°C反應(yīng)20分鐘。9)讀數(shù)與結(jié)果判定與TMB反應(yīng)完成后每空加入2M H2SO4 50 μ I終止反應(yīng)，最后在450nm處讀取吸光值，根據(jù)所得數(shù)據(jù)計(jì)算樣品抑制率(陰性樣品吸光值_標(biāo)準(zhǔn)品/待測(cè)樣品吸光值)/陰性樣品吸光值X 100%，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品抑制率和標(biāo)準(zhǔn)品濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(見附圖2)，以標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行定量分析。為驗(yàn)證本發(fā)明效果的可靠性，進(jìn)行以下鑒定將配好的重組草魚白細(xì)胞介素10標(biāo)準(zhǔn)系列溶液(O. 2ng/mL、lng/mL、5ng/mL、IOng/mL> 30ng/mL> 100ng/mL>200ng/mL)按上述 ELISA檢測(cè)過(guò)程檢測(cè)，計(jì)算各濃度的抑制率。以抑制率為縱坐標(biāo)，重組草魚白細(xì)胞介素10溶液濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。競(jìng)爭(zhēng)ELISA結(jié)果及相關(guān)參數(shù)見表1，標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線見附圖2。從附圖2可見在O. l-100ng/ml范圍內(nèi)該試劑盒具有良好的線性。表I競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA結(jié)果的相關(guān)參數(shù)
濃度(ng/ml)濃度對(duì)數(shù)0D450抑制率％1002.0000.08891.091501.699O. 18581.27515I. 176O. 29270. 4455O. 6990.41458. 0972.5O. 3980.49849. 5950.5-O. 301O. 64934. 312O. I-IO. 75123. 988(2)結(jié)果重現(xiàn)性針對(duì)草魚白細(xì)胞介素10檢驗(yàn)ELISA方法的精密度測(cè)試，批間重復(fù)6次，所得不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光值變異系數(shù)(cv% )如表2所示。表2不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光值變異系數(shù)(η = 6)
權(quán)利要求
1.一種草魚白細(xì)胞介素10酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，其特征在于該檢驗(yàn)方法是利用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗草魚白細(xì)胞介素10的多克隆抗體和重組草魚白細(xì)胞介素10蛋白建立的競(jìng)爭(zhēng)抑制酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)方法，其特征在于該方法包括以下步驟1)抗原蛋白的制備利用原核表達(dá)系統(tǒng)制備重組草魚白細(xì)胞介素10蛋白作為抗原蛋白。2)草魚白細(xì)胞介素10多克隆抗體的制備以重組草魚白細(xì)胞介素10蛋白為抗原，免疫新西蘭大白兔并利用多克隆抗體制備與純化技術(shù)獲得草魚白細(xì)胞介素10多克隆抗體，該抗體可與草魚白細(xì)胞介素10特異的結(jié)合。3)草魚白細(xì)胞介素10多克隆抗體的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記采用馬來(lái)酰亞胺活化的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記草魚IL-10多克隆抗體。4)ELISA操作方法(1)經(jīng)過(guò)棋盤滴定法確定ELISA檢測(cè)時(shí)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的草魚白細(xì)胞介素10多克隆抗體的最適稀釋倍數(shù)為I : 2000，包被抗原濃度為2 μ g/mL，每孔100 μ L。(2)包被以O(shè).05M的碳酸鹽緩沖液稀釋草魚白介素10重組蛋白至2 48/11^，以此作為包被原加入酶標(biāo)板中，每孔100 μ 1，4°C孵育過(guò)夜后甩干孔內(nèi)液體，并用PBST (pH為7. 4的 PBS緩沖液中含O. 05% Tween-20)洗滌三次，每次300 μ I/孔，3分鐘每次。(3)封閉用封閉液(pH為7.4的PBS稀釋的5%脫脂奶粉、O. 3% BSA溶液)室溫封閉兩小時(shí)，300 μ I/孔。(4)酶標(biāo)抗體與待測(cè)抗原的孵育用抗原/抗體稀釋液(PBST)將重組草魚重組IL-10 蛋白稀釋到對(duì)應(yīng)濃度(O. 2ng/mL、lng/mL、5ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、100ng/mL、200ng/mL) 作為標(biāo)準(zhǔn)品，取各標(biāo)準(zhǔn)品50μ I與50μ I酶標(biāo)IL-10多克隆抗體(HRP-ILlOAb) (PBST做 IO3倍稀釋)混勻后室溫孵育2小時(shí)。對(duì)待測(cè)樣品的檢測(cè)取待測(cè)樣品50μ I后與50μ I I : 1000稀釋的HRP-ILlOAb混合，同樣室溫孵育2小時(shí)。酶標(biāo)板封閉完成后甩干封閉液, 并用300 μ I PBST洗滌三次，加入上述抗原抗體混合液，室溫孵育2小時(shí)。(5)顯色甩干孔內(nèi)液體，用300μ I PBST洗滌五次，每次3分鐘，洗滌后一定注意甩干孔內(nèi)液體，然后加入100 μ I TMB底物，37°C反應(yīng)20分鐘后加入50 μ I 2Μ H2SO4終止反應(yīng)。(6)讀數(shù)、結(jié)果處理采用酶標(biāo)儀在吸光度450nm下讀取數(shù)據(jù)，根據(jù)所得數(shù)據(jù)計(jì)算樣品抑制率。樣品抑制率％=(陰性樣品吸光值-標(biāo)準(zhǔn)品/待測(cè)樣品吸光值)/陰性樣品吸光值X 100最后以標(biāo)準(zhǔn)品抑制率為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行定量分析。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種草魚白細(xì)胞介素10(IL-10)競(jìng)爭(zhēng)抑制酶聯(lián)免疫檢測(cè)(ELISA)方法。用重組表達(dá)的草魚白細(xì)胞介素10蛋白作為免疫原免疫健康的新西蘭大白兔得到多克隆抗體，再用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記該抗體，最后以重組草魚IL-10蛋白為包被抗原建立起競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA方法，可用于草魚白細(xì)胞介素10的蛋白檢測(cè)。此ELISA方法檢測(cè)范圍是0.1-100ng/mL。采用多克隆抗體和競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA方法，費(fèi)用低且穩(wěn)定性重復(fù)性好。目前該方法首次建立了競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA方法檢測(cè)草魚白細(xì)胞介素10的蛋白表達(dá)。
文檔編號(hào)C07K16/24GK102608332SQ201210076768
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月22日
發(fā)明者周紅, 楊牧, 汪新艷, 趙太強(qiáng), 韋鶴 申請(qǐng)人:電子科技大學(xué)