專利名稱：一種豬防御素pBD1多肽及其在抑制豬病原菌中應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種豬防御素PBDl多肽、編碼其的基因及其在抑制豬病原圃中應(yīng)用。
背景技術(shù)：
我國(guó)是養(yǎng)豬和豬肉生產(chǎn)大國(guó)，生豬飼養(yǎng)量、豬肉產(chǎn)量均位居世界第一，豬肉安全始終是關(guān)系到農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展和社會(huì)安定的一個(gè)根本問(wèn)題，具有“無(wú)豬不穩(wěn)，豬糧安天下”的戰(zhàn)略意義。目前抗生素濫用問(wèn)題嚴(yán)重制約了我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展，甚至已經(jīng)到了影響國(guó)計(jì)民生的地步。由于我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)長(zhǎng)期依賴抗生素，造成了疫情難解和疫苗失效。因此尋找和開(kāi)發(fā)優(yōu)質(zhì)、安全、高效、廉價(jià)、無(wú)公害的抗生素替代品，已成為目前世界和我國(guó)關(guān)注的焦點(diǎn)和熱點(diǎn)。防御素是生物界廣泛存在的一類抗菌肽類物質(zhì)，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)主要由上皮細(xì)胞或免疫細(xì)胞產(chǎn)生，除了可以殺死多種細(xì)菌、分枝桿菌、真菌、病毒等病原微生物，還能夠迅速動(dòng)員免疫系統(tǒng)，激活固有免疫和獲得性免疫反應(yīng)抵抗動(dòng)物體外各種生物逆境，是機(jī)體抵御外界微生物侵襲的第一道化學(xué)屏障(Boman, 1995 ；Ganz,2003 ；Yang et al. ,2007) 防御素的抑菌機(jī)理和其蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有關(guān)。防御素是富含半胱氨酸的陽(yáng)離子多肽，可以與帶陰離子的細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合，結(jié)合后其分子中的疏水區(qū)可插入細(xì)胞膜，破壞細(xì)胞膜的完整性，使細(xì)胞的必需代謝物質(zhì)外泄，導(dǎo)致病原菌不可逆性死亡。防御素具有抗病毒的作用則是通過(guò)與病毒外殼蛋白結(jié)合導(dǎo)致病毒失去生物活性(Matsuzaki，2001)。高等動(dòng)物的細(xì)胞由于細(xì)胞膜中負(fù)電荷含量較低而不會(huì)受到防御素的破壞。防御素不直接作用于病原菌的功能蛋白，而是作用于病原菌的細(xì)胞膜發(fā)揮抑菌作用，因此不會(huì)使病原菌對(duì)其產(chǎn)生耐藥性。而且與抗生素相比，防御素還具有抗病毒、激活機(jī)體免疫力的作用。由于具有以上優(yōu)點(diǎn)， 防御素可以成為全新的抗病菌、提升免疫的飼料添加劑，未來(lái)將在動(dòng)物養(yǎng)殖、疾病預(yù)防和提高畜產(chǎn)品品質(zhì)等方面發(fā)揮巨大作用。目前，在脊椎動(dòng)物、無(wú)脊椎動(dòng)物和植物中發(fā)現(xiàn)的防御素已超過(guò)500多種。通過(guò)基因克隆和基因組同源序列分析，在豬體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)12種防御素，均以￠-防御素的形式存在。這些防御素在豬體內(nèi)的表達(dá)部位不同，分布于消化道、呼吸道、淋巴器官、腎、脾、睪丸、 附睪及骨髓等器官內(nèi)以及中性粒細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)，對(duì)豬先天免疫，特別是黏膜先天免疫，發(fā)揮著重要作用(Sang et al. , 2006) 研究發(fā)現(xiàn)pBDl不僅可以殺死Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes 和 Candida albicans 等豬致病菌(Shi et al.，1999)，而且可以激活新生仔豬的先天免疫功能，飼喂500 y g防御素pBDl 可以使新生仔豬獲得對(duì)百日咳鮑特菌的免疫能力，預(yù)防百日咳鮑特菌引起的支氣管肺炎 (Shokrollah et al.，2006)。在腸道中，防御素可以通過(guò)增加其表達(dá)量直接殺死入侵的致病性細(xì)菌，比如豬致病性沙門氏菌Salmonella Typhimurium可以明顯使豬空腸上皮細(xì)胞系的 pBDl 和 pBD2 的表達(dá)量增加(Edwin et al. ,2009), Salmonella Enteritidis 感染可以使豬腸道細(xì)胞系PBDl的表達(dá)量增加10倍(Edwin et al.，2006)。豬防御素還具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的作用，在日糧中添加PBDl的肉用仔雞的生長(zhǎng)性能、小腸吸收營(yíng)養(yǎng)能力以及腸道黏膜免疫能力均有明顯增強(qiáng)(Bao et al.，2008)。由于防御素在動(dòng)物體內(nèi)的天然含量很低，提取步驟繁瑣，而化學(xué)合成法的生產(chǎn)成本昂貴，嚴(yán)重影響了防御素的研究和應(yīng)用?；蚬こ谭ㄊ谦@得大量、廉價(jià)防御素的最佳途徑。防御素在大腸桿菌、酵母菌、昆蟲(chóng)、植物中的表達(dá)已有相關(guān)報(bào)道。彭力(2004)在大腸桿菌中表達(dá)了人P防御素2，優(yōu)化了發(fā)酵條件和產(chǎn)物分離的方法。任海清(2009)在畢赤酵母 GS115中表達(dá)了豬防御素pBDl。JISHU SHI等人(1999)利用桿狀病毒載體，成功的在草地夜蛾體內(nèi)表達(dá)了豬防御素pBDl。王義琴等(2001) 人以小球藻作為宿主，成功表達(dá)了兔防御素，為兔防御素的產(chǎn)業(yè)化奠定了基礎(chǔ)，張秀海等(2000)在番茄中成功地表達(dá)了兔防御素 NP-1。雖然在以上所述幾種生物系統(tǒng)中成功表達(dá)了防御素，但是防御素的異源表達(dá)量低依然是制約防御素產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的瓶頸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種豬防御素pBDl多肽及其在抑制豬病原菌中應(yīng)用。首先，本發(fā)明提供一種豬防御素pBDl多肽，其為由SEQ ID No. 2所示的氨基酸組成的蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供的豬防御素pBDl多肽，去除了豬防御素pBDl中的信號(hào)肽序列和部分前導(dǎo)肽，選取了豬防御素PBDl的23 64位氨基酸序列。然而，應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明公開(kāi)的氨基酸序列，在不影響其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，得到所述蛋白的突變序列。因此，本發(fā)明的豬防御素PBDl多肽還包括由SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列中經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有同等活性的由 SEQ ID No. 2所不的蛋白質(zhì)衍生的蛋白質(zhì)。優(yōu)選的，衍生蛋白的氨基酸序列與SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列的同源性可為 70%以上，優(yōu)選80%以上，更優(yōu)選90%以上。本發(fā)明還提供上述多肽的基因。優(yōu)選的，其序列如SEQ ID No. I所示。本發(fā)明還提供含有豬防御素pBDl多肽基因的載體、細(xì)胞系及重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。優(yōu)選的重組菌為大腸桿菌。本發(fā)明還提供制備所述豬防御素pBDl多肽的方法，其為通過(guò)發(fā)酵所述的重組菌進(jìn)行制備。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)高密度發(fā)酵所述的重組大腸桿菌制備豬防御素 pBDl多肽,具體包括如下步驟I)取新鮮單菌落接種培養(yǎng)5 IOh后的發(fā)酵液作為種子液；2)將步驟I)的種子液以體積比I 3 30接種到新鮮培養(yǎng)基中，通氣攪拌發(fā)酵， 將發(fā)酵液中的溶解氧控制在25-32%，溫度控制在25 30°C ;3)流加酸或堿，將發(fā)酵液中的pH值控制在7. 0 7. 5 ;4)當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到0D60010 15時(shí)，加入終濃度為0. 7-0. 9mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。其中，步驟2)所述的培養(yǎng)基成分為葡萄糖4_7g/L，酵母提取物25_35g/L，蛋白胨 15-25g/L, (NH4) 2HP043-4g/L，KH2P043-4g/L，K2HP044_6g/L，MgSO4 7H20 6_9g/L，NaCl 19-22g/L。
本發(fā)明構(gòu)建的重組菌經(jīng)體外表達(dá)后，能有效的抑制豬常見(jiàn)病原菌的活性，如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、豬鏈球菌等。本發(fā)明改造了豬防御素pBDl的多肽序列，并利用大腸桿菌工程菌進(jìn)行體外表達(dá)， 可以大量、廉價(jià)獲得有生物學(xué)活性的防御素，解決了天然防御素難于分離，化學(xué)合成法的生產(chǎn)成本昂貴的問(wèn)題，有利于豬防御素的大規(guī)模生產(chǎn)。并且，發(fā)酵生產(chǎn)的豬防御素PBDl仍具有較高的生物活性，可抑制多種豬病原菌。



圖I大腸桿菌的密碼子偏好性分析。圖2大腸桿菌重組載體pET32_pBDl的構(gòu)建過(guò)程。圖3載體構(gòu)建電泳圖。其中，A為pBDl基因的PCR擴(kuò)增；B為pET32a質(zhì)粒的酶切； C為重組載體的PCR驗(yàn)證。圖4豬防御素重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。其中，泳道I為BL21空白菌液；2為未經(jīng)誘導(dǎo)空質(zhì)粒菌液；3為經(jīng)誘導(dǎo)的空質(zhì)粒菌液；4為未經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌液；5為經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌液； 6為Marker ；7為經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌上清；8為經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌沉淀。圖5豬防御素重組蛋白的純化層析圖譜。其中，箭頭所指為重組蛋白吸收峰。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例IpBDl成熟肽編碼序列密碼子分析使用SignalP 3. 0軟件分析pBDl序列(GenBank NM213838)，篩選出最優(yōu)的pBDl 的成熟肽序列SEQ ID No. 2。利用graphical codon usage analyser軟件分析大腸桿菌的密碼子偏好性(圖I)，發(fā)現(xiàn)PBDl序列的密碼子偏好性都大于20%，合成序列SEQ ID No. I (英駿公司序列合成)。實(shí)施例2大腸桿菌重組豬防御素pBDl表達(dá)載體的構(gòu)建大腸桿菌重組豬防御素pBDl表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程如圖2所示。根據(jù)序列SEQ ID No. 1，設(shè)計(jì)引物 pBDl-F :5’-CCGCTCGAGAAAAACATAGGAAAITC-3’ 和 pBD I-R :5’ -CCGCTCGAGTCATTACTTCCTITTGCAGCAITTG-3’。在上游引物 5’ 端引入酶切位點(diǎn)BamHI，在下游引物5 ‘端引入終止密碼子TCATTA和酶切位點(diǎn)BamHI。以實(shí)施例I中由英駿公司合成的SEQID No. I序列為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性5分鐘；94°C熱變性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸30秒，30個(gè)循環(huán);72°C延伸3分鐘。PCR體系為引物 pBDl-F I u L, pBDl-Rl U L, IOXdNTP 2 U L, IOXExTaq Buffer 2 U L, ExTaq 酶 0. 5 ii L，加超純水補(bǔ)充體系到20ii L。PCR產(chǎn)物經(jīng)I. 8%瓊脂糖凝膠電泳，電泳圖見(jiàn)圖3A。 PCR產(chǎn)物用PCR純化試劑盒(天根公司)純化，純化步驟詳見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。純化產(chǎn)物送測(cè)序公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果用DNAman軟件比對(duì)正確。用BamHI酶切PCR純化的產(chǎn)物，酶切體系為PCR純化產(chǎn)物20 ii L，10 X buffer 25 u L，BamHI 3 u L,滅菌超純水補(bǔ)充體系到250 u L，酶切條件是37°C溫育3小時(shí)。大腸桿菌表達(dá)載體pET32a的酶切體系是pET32a質(zhì)粒25 ii L，IOXbuffer 25 U L, BamHI 3 y L，滅菌超純水補(bǔ)充體系到250 y L，酶切條件是37°C溫育3小時(shí)。酶切產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證條帶大小是否正確，見(jiàn)圖3B。豬防御素pBDl基因的酶切產(chǎn)物和pET32a的酶切產(chǎn)物用PCR純化回收試劑盒回收?；厥蘸筮M(jìn)行連接，連接體系是巾￡了32&/^111111131^，？0 酶切回收產(chǎn)物31^，10\了40嫩連接buffer 1111，了4-0嫩連接酶1111，加滅菌超純水補(bǔ)充體系到10111，41過(guò)夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌熱激感受態(tài)JM109 (天根公司)。大腸桿菌熱激轉(zhuǎn)化的方法為將100 U L感受態(tài)細(xì)胞在冰上融化，加入10 ii L連結(jié)產(chǎn)物，輕輕敲打混勻，冰上放置20分鐘。42°C水浴熱擊90秒，取出置于冰上放置5分鐘，力口 A 900 u L的LB培養(yǎng)基。37°C搖床150rpm震蕩培養(yǎng)I小時(shí)后，取出200 u L培養(yǎng)液涂布加入 25 u g/ u L Apr抗生素的LB平板，37°C過(guò)夜培養(yǎng)。挑取單菌落做菌落PCR，PCR體系和條件如上所述。PCR產(chǎn)物經(jīng)I. 8%瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果見(jiàn)圖3C，PCR產(chǎn)物測(cè)序后，與預(yù)期片段的同源性達(dá)到100%。將構(gòu)建的重組大腸桿菌豬防御素pBDl表達(dá)載體命名為pET32-pBDl。實(shí)施例3大腸桿菌重組豬防御素基因工程菌的構(gòu)建從重組JM109菌株中提取重組質(zhì)粒pET32_pBDl，將質(zhì)粒熱激轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)(天根公司)，得到重組豬防御素基因工程菌BL21-pBDl。從BL21菌中提取質(zhì)粒，驗(yàn)證正確。實(shí)施例4基因工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)挑取基因工程菌BL21-pBDl陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，接種至5mL LB培養(yǎng)基中，Aplr抗生素濃度是25ii g/ii L，37°C，200rpm過(guò)夜搖菌。第二天以1%接種量轉(zhuǎn)接入150mL LB+Ap1培養(yǎng)基中， 37°〇，200印111搖至0060011111 0. 6左右(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，大約2h);加入IPTG至終濃度0. 8mM， 30°C，150rpm繼續(xù)搖菌6小時(shí)。將菌液移至離心管中，4°C，4000g離心，IOmin,倒掉上清，收集細(xì)胞。用50mL腸激酶buffer (20mM Tris-HCl，IOOmM NaCl,pH7. 6)重懸細(xì)胞。使用超聲波破碎儀破碎細(xì)胞，功率設(shè)置為200W，超2s，停3s，超聲20分鐘。鏡檢超聲波的效果。吸取樣品10 U 1，加上5 U I上樣緩沖液(2X)，充分混勻后，點(diǎn)樣于SDS-PAGE膠點(diǎn)樣孔中。蛋白膠脫色后，在22kDa處有一明顯條帶，而對(duì)照樣品BL21、未誘導(dǎo)空載體菌和未誘導(dǎo)重組菌在22kDa處沒(méi)有明顯條帶；誘導(dǎo)空載體菌在ISkDa處有一明顯條帶，推測(cè)是 trxA基因表達(dá)產(chǎn)物；誘導(dǎo)重組菌表達(dá)的蛋白大部分在細(xì)胞破碎液的上清中(圖4)。SDS-PAGE蛋白電泳的操作方法I)菌體樣品的破碎取0D600到達(dá)0. 5-0. 6的菌液I. 0ml，離心棄去上清后，加入
適量超純水和等體積的2X上樣buffer重懸菌體，充分煮沸使菌體細(xì)胞裂解，冰上冷卻后電泳或者在_20°C保存。2)將制備好的10%的分離膠和5%的濃縮膠膠版安裝至模具中。I. 77ml 5%濃縮膠的配制濃縮膠buffer 0. 42ml ；凝膠儲(chǔ)液0. 25ml ；超純水Iml ；10% APS 8u I ；TEMED 3 U I。 5. 33ml的10%分離膠的配制分離膠buffer I. 33ml ；
凝膠儲(chǔ)液I. 77ml ；超純水2. 23ml ；
10% APS 75u I ；TEMED 7 U I。3)在模具中加入分離膠后，膠面加入少許水覆蓋使膠面平齊，室溫放置30分鐘后，用濾紙吸干膠面上的水層。立即加入適量濃縮膠，插上梳子后室溫放置至少I個(gè)小時(shí)。4)將膠板放入電泳槽中，將梳子拔出。5)將處理好的蛋白樣品加入點(diǎn)樣孔，電泳2-3個(gè)小時(shí)至溴酚蘭到達(dá)底部。6)染色將分離膠放入考馬斯亮藍(lán)染色液中染色。7)脫色將染好色的分離膠在脫色液中脫色，期間不斷換脫色液。蛋白電泳用各種溶液的配制I)凝膠貯液雙丙烯酰胺0. 8g，丙烯酰胺30g，加入去離子水補(bǔ)足溶液到IOOml ；2)4X 分離膠緩沖液的成分:1. 5mol/l Tris-HCl,0. 4% SDS 調(diào)整至 pH8. 8 ；3)4X 濃縮膠緩沖液的成分:0. 5mol/l Tris-HCl,0. 4% SDS 調(diào)整至 pH6. 8 ；4)電極緩沖液的配制甘氨酸 14. 41g，Tris-HCl 3. 03g, SDS1. Og 調(diào)整至 pH8. 3，
容量瓶定容至IL ；5)按需要加入10%過(guò)硫酸銨，10% SDS, TEMED適量；6)上樣緩沖液的組成50ml 甘油，6. 05g Tris-HCl，IOg SDS, 25ml 巰基乙醇，0. 5g 溴酚藍(lán)適量，調(diào)整至PH6. 8，容量瓶定容至500ml ；7)染色液使用考馬斯亮藍(lán)染色液，具體配制方法見(jiàn)說(shuō)明書(shū)；8)脫色液的配制15%乙醇，15%乙酸溶于去離子水。實(shí)施例5TrxA_His_pBDl重組蛋白的純化使用Ni-NTA Superflow Cartridge親和層析柱(QIAGEN公司生產(chǎn))純化 TrxA-His-pBDI蛋白。純化方法是用10倍體積的Buffer NPI-10平衡柱體，10倍體積的 Buffer NPI-20沖洗柱體，用5-10倍體積的Buffer NPI-250洗脫蛋白。整個(gè)過(guò)程流速控制在lml/min。蛋白純化過(guò)程的層析圖譜見(jiàn)圖5。實(shí)施例6腸激酶酶切TrxA-Hi s-pBD I重組蛋白由于用pET32a表達(dá)的蛋白有很長(zhǎng)的TrxA和His標(biāo)簽，影響表達(dá)蛋白的功能，因此常常需要用腸激酶切去標(biāo)簽。使用ro-10脫鹽柱(GE Healthcare)將洗脫蛋白的buffer NPI-250置換成腸激酶buffer。具體方法是移去脫鹽柱的蓋帽和流出口，使脫鹽柱的保存液流出。用NPI-250buffer注滿柱體，待液體完全流出后，再注滿，如此反復(fù)四次。在柱體內(nèi)加入2. 5mL樣品，待樣品完全流出后，加入3. 5mL腸激酶buffer，用干凈離心管接流出的液體。在buffer置換后的3. 5mL蛋白中加入3 ill腸激酶(欣百諾生物)，37°C過(guò)夜酶切。實(shí)施例7pBDl蛋白的純化和抑菌能力的測(cè)定用腸激酶酶切后的樣品，經(jīng)G-25葡聚糖交聯(lián)柱純化，純化后的樣品對(duì)金黃色葡萄球菌(抑菌直徑I. 8cm)和大腸桿菌K88 (抑菌直徑I. 4cm)有很好的抑制作用。抑菌能力測(cè)定方法在每個(gè)無(wú)菌平皿中等距放入4個(gè)牛津杯，配制MH培養(yǎng)基(瓊脂含量I. 0% ) 15mL，濕熱滅菌后恒溫至60°C，加入5%金黃色葡萄球菌菌液(或大腸桿菌 K88)混勻，配制成帶金黃色葡萄球菌(或大腸桿菌K88)的瓊脂，震蕩混勻后直接倒在無(wú)菌培養(yǎng)皿中，緩緩轉(zhuǎn)動(dòng)平板使培養(yǎng)基均勻鋪開(kāi)。待其凝固，用無(wú)菌鑷子小心夾出牛津杯，4°C備用。每個(gè)孔中加入100 u L純化出的蛋白，蓋好皿蓋，小心移至37°C培養(yǎng)箱，平皿正放靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)20小時(shí)后，打開(kāi)皿蓋，移去牛津杯，用卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。實(shí)施例8豬防御素大腸桿菌工程菌的高密度發(fā)酵在5L發(fā)酵罐(鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)有限責(zé)任公司)中盛放3L培養(yǎng)基(培養(yǎng)基成分為葡萄糖5g/L，酵母提取物30g/L，蛋白胨20g/L，(NH4)2HPO4 3g/L, KH2PO4 3g/L， K2HPO4 5g/L, MgSO4 7H208g/L, NaCl 20g/L)。發(fā)酵條件為將新鮮單菌落接種培養(yǎng)6h后的發(fā)酵液作為種子液。取種子液200ml 轉(zhuǎn)接至3L培養(yǎng)基(即發(fā)酵罐裝填系數(shù)為60%左右)中進(jìn)行培養(yǎng)。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)調(diào)節(jié)攪拌速度、通氣量等將溶氧控制在30%上；溫度控制在28°C通過(guò)酸堿泵自動(dòng)補(bǔ)加I. OM H2SO4或I. OM NaOH，使發(fā)酵液的pH值控制在7. 2左右。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到0D600約為11時(shí)， 加入終濃度為0. 8mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)8小時(shí)后停止發(fā)酵。收集菌體，超聲波破碎后， 純化蛋白(實(shí)施例5的方法)，蛋白表達(dá)量達(dá)到6. 38mg/mL。實(shí)施例9豬防御素大腸桿菌工程菌的高密度發(fā)酵在5L發(fā)酵罐(鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)有限責(zé)任公司)中盛放3L培養(yǎng)基(培養(yǎng)基成分為葡萄糖4g/L，酵母提取物35g/L，蛋白胨15g/L，(NH4)2HPO4 4g/L, KH2PO4 4g/L， K2HPO4 4g/L, MgSO4 7H20 9g/L, NaCl 19g/L)。發(fā)酵條件為將新鮮單菌落接種培養(yǎng)IOh后的發(fā)酵液作為種子液。取種子液IOOml 轉(zhuǎn)接至3L培養(yǎng)基(即發(fā)酵罐裝填系數(shù)為60%左右)中進(jìn)行培養(yǎng)。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)調(diào)節(jié)攪拌速度、通氣量等將溶氧控制在25% ;溫度控制在30°C。通過(guò)酸堿泵自動(dòng)補(bǔ)加I. OM H2SO4或I. OM NaOH，使發(fā)酵液的pH值控制在7. 5左右。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到0D600約為10時(shí)， 加入終濃度為0. 7mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)10小時(shí)后停止發(fā)酵。收集菌體，超聲波破碎后，純化蛋白(實(shí)施例5的方法)，蛋白表達(dá)量達(dá)到8. 52mg/mL。實(shí)施例10豬防御素大腸桿菌工程菌的高密度發(fā)酵 在5L發(fā)酵罐(鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)有限責(zé)任公司)中盛放3L培養(yǎng)基(培養(yǎng)基成分為葡萄糖7g/L，酵母提取物25g/L，蛋白胨25g/L，(NH4)2HPO4 3g/L, KH2PO4 3g/L， K2HPO4 4g/L, MgSO4 7H20 6g/L, NaCl 22g/L)。發(fā)酵條件為將新鮮單菌落接種培養(yǎng)5h后的發(fā)酵液作為種子液。取種子液300ml 轉(zhuǎn)接至3L培養(yǎng)基(即發(fā)酵罐裝填系數(shù)為60%左右)中進(jìn)行培養(yǎng)。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)調(diào)節(jié)攪拌速度、通氣量等將溶氧控制在32% ;溫度控制在30°C通過(guò)酸堿泵自動(dòng)補(bǔ)加I. OM H2SO4或I. OMNaOH,使發(fā)酵液的pH值控制在7. 0左右。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到0D600約為15時(shí)， 加入終濃度為0. 9mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)8小時(shí)后停止發(fā)酵。收集菌體，超聲波破碎后， 純化蛋白(實(shí)施例5的方法)，蛋白表達(dá)量達(dá)到7. 38mg/mL。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種豬防御素PBDl多肽，其為1)由SEQID No. 2所示的氨基酸組成的蛋白質(zhì)；或2)在SEQID No. 2所示的氨基酸序列中經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有同等活性的由I)衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求I所述多肽的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQID No. I所示。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的載體。
5.含有權(quán)利要求4所述載體的重組菌。
6.如權(quán)利要求5所述的重組菌，其特征在于，其為大腸桿菌。
7.一種制備權(quán)利要求I所述多肽的方法，其為通過(guò)發(fā)酵權(quán)利要求5或6所述的重組菌進(jìn)行制備。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，通過(guò)高密度發(fā)酵權(quán)利要求6所述的重組菌進(jìn)行制備，具體包括如下步驟1)取新鮮單菌落接種培養(yǎng)5 IOh后的發(fā)酵液作為種子液；2)將步驟I)的種子液以體積比I 3 30接種到新鮮培養(yǎng)基中，通氣攪拌發(fā)酵，將發(fā)酵液中的溶解氧控制在25-32%，溫度控制在25 30°C ;3)流加稀酸或稀堿，將發(fā)酵液中的pH值控制在7.0 7. 5 ;4)當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到0D60010 15時(shí)，加入終濃度為0.7-0. 9mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)；5)收集菌體并破碎，純化重組蛋白。
9.權(quán)利要求I所述多肽在抑制豬病原菌中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的豬病原菌選自金黃色葡萄球菌、 大腸桿菌、豬鏈球菌。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種豬防御素pBD1多肽、編碼其的基因及其在抑制豬病原菌中應(yīng)用。本發(fā)明提供的豬防御素pBD1多肽，其為1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸組成的蛋白質(zhì)；或2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明改造了豬防御素pBD1的多肽序列，并利用大腸桿菌進(jìn)行體外表達(dá)，可以大量、廉價(jià)獲得有生物學(xué)活性的防御素，解決了天然防御素難于分離，化學(xué)合成法的生產(chǎn)成本昂貴的問(wèn)題，有利于豬防御素的大規(guī)模生產(chǎn)。并且，發(fā)酵生產(chǎn)的豬防御素pBD1仍具有較高的生物活性，可抑制多種豬病原菌。
文檔編號(hào)C07K14/47GK102617724SQ20121007974
公開(kāi)日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月23日
發(fā)明者馮秋月, 吳雅琨, 彭子欣, 王安如, 謝飛 申請(qǐng)人:北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司, 湖南大北農(nóng)農(nóng)業(yè)科技有限公司, 鄭州市大北農(nóng)飼料科技有限公司