專利名稱：一種小麥凝集素類蛋白TaJRL2及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種小麥凝集素類蛋白TaJRL2及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物在整個(gè)生命周期中會面臨各種細(xì)菌、真菌、病毒、蚜蟲、蝗蟲、螟蟲、飛蛾等病蟲害的危害等，這些病蟲害對植物生長發(fā)育產(chǎn)生諸多不利的影響。為了應(yīng)對各種病蟲害，植物自身形成了一系列調(diào)控機(jī)制除了通過在侵染部位合成和積累木質(zhì)素、植保素等物質(zhì)來阻止病菌的入侵和擴(kuò)展之外，植物還通過誘導(dǎo)防衛(wèi)反應(yīng)產(chǎn)生廣譜抗性來應(yīng)對病原菌的侵入。研究表明，植物的防衛(wèi)反應(yīng)受兩類基因的控制，一類是R基因，一類是病程相關(guān)基因，前者屬于基礎(chǔ)抗性，后者屬于誘導(dǎo)型抗性。R基因產(chǎn)物作為受體，直接或者間接的參與病原蛋白互作，從而啟動(dòng)植物體內(nèi)的抗病信號途徑。這類抗病反應(yīng)產(chǎn)生的抗病性較強(qiáng)，但是由于R基因的資源有限，尤其是對某些復(fù)雜的數(shù)量性狀抗病性如小麥的赤霉病抗性，這類R基因的獲得尤其困難。除開資源有限較難獲得之外，R基因介導(dǎo)的抗性具有病原種類和病原生理小種的特異性，抗譜不廣，抗性易于喪失。與R基因相比較，病程相關(guān)基因介導(dǎo)的抗性具有抗性持久、抗譜廣泛和資源豐富等優(yōu)點(diǎn)。在缺乏R基因的情況下，通過克隆病程相關(guān)基因提高植物的抗性顯得尤為重要。這類病程相關(guān)基因的共同特點(diǎn)是在經(jīng)過病原菌誘導(dǎo)后表達(dá)量明顯升高或減少。小麥?zhǔn)鞘澜缟现匾募Z食作物之一，但病蟲害的影響往往導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)的下降。病原菌對植物的侵害及引起的一系列防衛(wèi)反應(yīng)在不同植物與病原菌之間存在相似性，因此，我們可以通過抗病反應(yīng)相關(guān)基因的應(yīng)用來提高植物廣譜及長效的抗性?？共》磻?yīng)的調(diào)控因子分為正調(diào)控因子和負(fù)調(diào)控因子兩類。正調(diào)控因子的超量表達(dá)，可以快速而有效的啟動(dòng)抗病反應(yīng)，提高植物的抗病性，拓寬植物的抗譜；而抑制該基因的表達(dá)則會導(dǎo)致抗病性的減弱。凝集素是一類非免疫起源的糖結(jié)合蛋白，各種生物中分布廣泛、種類眾多，家族內(nèi)各成員的結(jié)構(gòu)和功能亦差異懸殊。根據(jù)特征性質(zhì)的不同可以將植物凝集素分為七個(gè)亞家族莧科凝集素、葫蘆科韌皮部凝集素、橡膠蛋白結(jié)構(gòu)域凝集素、豆科凝集素、單子葉植物甘露糖結(jié)合凝集素、II型核糖體失活蛋白凝集素和jacalin相關(guān)凝集素。值得說明的是，本發(fā)明的TaJRL2蛋白是來源于小麥的jacalin相關(guān)凝集素,在本發(fā)明提出之前，Genbank中與TaJRL2的同源性最高的多肽鏈為小麥蛋白TaJRLl，兩者的同源性為42%，其次是大麥的mJRL蛋白LEM2，兩者的同源性僅為40%
發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種能提高小麥赤霉病抗性的小麥凝集素類蛋白 TaJRL2。本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供上述蛋白的編碼基因。
本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供上述基因在培育抗赤霉病小麥品種中的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下
一種小麥凝集素類蛋白 TaJRL2 (Triticum aestivum Jacalin Related Lectin
2)，它是具有序列表中SEQ ID NO :2所不的氣基酸序列的蛋白質(zhì)。該蛋白包含148個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為7. 14，含有I個(gè)jacalin結(jié)構(gòu)域，為AA11-AA146。在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行序列比對沒有發(fā)現(xiàn)與該多肽鏈同源性超過50%的蛋白序列公布。在已公布的蛋白序列中，與該多肽鏈同源性最高的蛋白質(zhì)序列是小麥蛋白TaJRLl，兩者的同源性為42 %，其次是大麥的mJRL蛋白LEM2，兩者的同源性僅為40 %。因此，TaJRL2是一個(gè)新的jccalin類似蛋白。編碼所述的小麥凝集素類蛋白TaJRL2的基因TaJRL2。所述的基因TaJRL2優(yōu)選下列核苷酸序列之一1)SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；2)在65°C以上高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與SEQ ID NO : I限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。小麥凝集素類蛋白TaJRL2的編碼基因進(jìn)一步優(yōu)選序列表中SEQ ID NO :I所示的核苷酸序列。小麥凝集素類蛋白TaJRL2的編碼基因含有447bp的核苷酸。含有所述基因TaJRL2的重組表達(dá)載體。所述的重組表達(dá)載體優(yōu)選是在PBI 121載體的XbaI及BamHI位點(diǎn)之間插入所述基因TaJRL2得到的重組質(zhì)粒。含有所述基因TaJRL2的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。利用現(xiàn)有分子生物學(xué)的方法可以得到不同的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系所述的基因TaJRL2在提高小麥對赤霉病抗性中的應(yīng)用。所述的含有基因TaJRL2的重組表達(dá)載體在提高小麥對赤霉病抗性中的應(yīng)用。利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中超量表達(dá)的載體，將本發(fā)明所提供的凝集素類基因TaJRL2導(dǎo)入植物細(xì)胞，可獲得改變植物對赤霉病抗性的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因植株。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞進(jìn)行篩選，可以對載體進(jìn)行加工，如加入抗生素標(biāo)記基因(如潮霉素、卡那霉素和慶大霉素)，加入抗生素標(biāo)記基因之后的載體用于轉(zhuǎn)化，可以在轉(zhuǎn)化后的植物培養(yǎng)基中加入抗生素，抑制非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和植株的生長，有助于快速和有效的獲得轉(zhuǎn)基因植株。為了便于觀察外源基因的表達(dá)，可以在載體中啟動(dòng)子和外源基因之間加入報(bào)告基因(GUS基因、GFP和熒火蟲熒光素酶報(bào)告基因)，構(gòu)建報(bào)告基因和外源基因融合表達(dá)的載體，該載體用于遺傳轉(zhuǎn)化，可以通過觀察報(bào)告基因的表達(dá)與否和表達(dá)量高低，推測外源基因在植物體內(nèi)表達(dá)情況。為了轉(zhuǎn)基因植物釋放的安全性，也可以構(gòu)建載體時(shí)不攜帶任何篩選標(biāo)記基因，而在苗期進(jìn)行PCR檢測。含有本發(fā)明的TaJRL2表達(dá)載體可通過使用基因槍法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、花粉管通道，電擊，顯微注射，Ti質(zhì)粒，Ri質(zhì)?；蛑参锊《镜瘸Ｒ?guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化后的植物細(xì)胞培育成完整的植株。被轉(zhuǎn)化的植株材料既可以是雙子葉植物，也可以是單子葉植物，如水稻、棉花、小麥、大豆、煙草、擬南芥、大麥、高粱、玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草、苜蓿等。有益效果本發(fā)明提供了一種新的小麥凝集素類蛋白TaJRL2及其編碼基因。通過基因工程的方法將本發(fā)明提供的小麥凝集素類基因轉(zhuǎn)入植物中，可以提高植物對赤霉病的抗性。由于該基因是糧食作物小麥本身存在的內(nèi)源基因，因此，該基因的超量表達(dá)不會影響植物的食品安全性，可以廣泛應(yīng)用于各種植物的抗病蟲性育種過程。


圖I實(shí)施例ISDS-PAGE電泳圖。圖2實(shí)施例2TaJRL2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果。圖3實(shí)施例3TaJRL2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果。圖4轉(zhuǎn)基因小麥的PCR檢測。圖5轉(zhuǎn)基因小麥的GUS檢測結(jié)果，左圖為非轉(zhuǎn)基因小麥葉片，右圖為轉(zhuǎn)基因小麥葉片，由圖明顯呈藍(lán)色。圖6轉(zhuǎn)基因小麥的赤霉菌抗性得到提聞。
五具體實(shí)施例方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所要求保護(hù)的范圍。實(shí)施例I :TaJRL2蛋白的獲得。在抗赤霉病材料望水白開花期，將赤霉菌孢子液用噴霧器噴灑到穗部，所用孢子液為江蘇省范圍內(nèi)強(qiáng)致病力赤霉菌菌株F4、F15, F17及F34的分生孢子混合液，接種后立即將穗子套上塑料袋，保持濕度，以保證赤霉菌發(fā)病。在接種后24小時(shí)后取麥穗，同時(shí)用水接種做為對照，取材后立即用液氮冷凍。取700mg凍存的麥穗，加入70mg的PVP于液氮中磨成粉末，加入5mL10%三氯醋酸/丙酮振蕩混勻、_20°C沉淀I小時(shí)；4°C 15，OOOg離心15min，沉淀重新懸浮于5mL冷丙酮中，-20°C放置2小時(shí)；4°C 15，OOOg離心15min，沉淀懸浮于80%的冷丙酮中，-20°C放置I小時(shí)，離心去丙酮，將沉淀干燥成粉。按每mg干粉加入10μ L裂解液(7Μ脲，2Μ硫脲，4% CHAPS，1% CA，0. 3%蛋白酶抑制劑，50U/mL DNase I)的比例加入裂解液，4°C攪拌抽提15min后加入14mM的DTT ;4°C再攪拌20min，然后35，OOOg離心lOmin，上清即為蛋白抽提液。將蛋白提取液進(jìn)行等電聚焦后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳緩沖液用Tris-Glycine-SDS緩沖液，溫度設(shè)為17°C;先用2. 5W/膠預(yù)電泳30min后，再用5W/膠電泳至溴酚藍(lán)到玻璃板下緣為止。電泳結(jié)束后，取下凝膠進(jìn)行銀染。分析在侵染后蛋白點(diǎn)的豐度與對照相比超過3倍的蛋白點(diǎn)(圖I)，取一個(gè)分子量為15. 56千道爾頓，等電點(diǎn)為7. 14的蛋白點(diǎn)即為TaJRL2蛋白。實(shí)施例2 :編碼TaJRL2蛋白的cDNA序列的獲得。 對實(shí)施例I得到的蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析獲得其氨基酸組成信息，根據(jù)對應(yīng)肽片段的EST用來搜索小麥EST數(shù)據(jù)庫，得到了 3條EST序列CK216494. 1，CJ596679. I和BM135703. I，將上述3條EST序列進(jìn)行拼接，然后用MacVector軟件設(shè)計(jì)弓I物Pl，Pl引物對如下Pl-F :5’ -ATGAAGATGGGCCCGTATGGC-3’ (SEQ ID NO. 3) ；P I-R :5’-TCAAACCCCAAGTTTGTAGGC-3’ (SEQID NO. 4)。以抗病種質(zhì)望水白的穗部cDNA作為模板，用英俊公司的Trizol試劑盒提取小麥穗部的總RNA,采用Promega公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成單鏈CDNA0用引物Pl進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為25^，包括5叩模板，Pl-F和Pl-R引物各5pmol，dATP，dTTP, dCTP 和 dGTP 各 5nmol，37. 3nmol MgCl2，0. 5 單位的 DNA 聚合酶，Ix PCR緩沖液。擴(kuò)增的程序是94°C變性3分鐘；30個(gè)循環(huán)，94°C變性20秒，51°C退火30秒，72 °C延伸I分鐘；最后72°C延伸5分鐘。通過PCR擴(kuò)增，獲得了包含開放讀碼框的447bp的核苷酸序列(圖2)，測序顯示PCR產(chǎn)物如SEQ ID NO : I所示，命名為TaJRL2基因，該序列編碼148個(gè)氨基酸，如SEQ IDNO 2所示，等電點(diǎn)為7. 14，含有I個(gè)jacalin結(jié)構(gòu)域，為AA11-AA146，鈣蛋白命名為TaJRL2。 實(shí)施例3 -M TaJRL2基因小麥的赤霉菌抗性得到提高。以抗病種質(zhì)望水白的穗部cDNA作為模板，利用引物P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，P2引物對如下P2-F :5’-ATCGTCTAGAGGCGATGAAGATGGGC-3’ (SEQ ID NO. 5) ；P2-R :5’-GTACGGATCCAACCCCAAGTTTGTAG-3’(SEQ ID NO. 6)。將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物(圖3)用限制性內(nèi)切酶XbaI及BamHI進(jìn)行雙酶切后，與經(jīng)過同樣限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切的PBI121表達(dá)載體進(jìn)行連接，酶切驗(yàn)證，獲得由CaMV35S啟動(dòng)子啟動(dòng)的TaJRL2超量表達(dá)的質(zhì)粒載體。構(gòu)建好的載體通過熱擊法轉(zhuǎn)化到DH5 α大腸桿菌菌株中，通過含有50 μ g/mL的卡那霉素的LB培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，獲得陽性克隆。參照1993年Weeks發(fā)表在Plant Physiol第102期1077-1084頁上的文章中的材料與方法，以幼胚短暫培養(yǎng)產(chǎn)生的可以較高頻率再生出可育植株的愈傷組織為受體，采用基因槍法將CaMV35S啟動(dòng)子控制下的TaJRL2基因?qū)胄←湥瑢⒒驑屴D(zhuǎn)化后的愈傷放置于含有30mg/L G418的1/2MS培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，剪取獲得的再生苗葉片，提取DNA進(jìn)行PCR檢測(圖4)葉片GUS染色檢測(圖5)，獲得TaJRL2超量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小麥。將TO代轉(zhuǎn)基因小麥葉片和非轉(zhuǎn)基因葉片同時(shí)接種赤霉菌，3天后進(jìn)行赤霉病抗性鑒定，所用赤霉菌為江蘇省內(nèi)感染小麥的強(qiáng)赤霉菌(F4，F(xiàn)15，F(xiàn)17，F(xiàn)34)菌株的混合物。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株對赤霉菌的抗性增強(qiáng)，葉片上赤霉菌菌絲生長變慢(圖6)。
權(quán)利要求
1.一種小麥凝集素類蛋白TaJRL2，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
2.編碼權(quán)利要求I所述的小麥凝集素類蛋白TaJRL2的基因TaJRL2。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因TaJRL2，其特征在于所述的基因TaJRL2具有下列核苷酸序列之一 . 1)SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列； .2)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與SEQID N01限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
4.含有權(quán)利要求2所述基因TaJRL2的重組表達(dá)載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體是在PBI121載體的XbaI及BamHI位點(diǎn)之間插入權(quán)利要求2所述基因TaJRL2得到的重組質(zhì)粒。
6.含有權(quán)利要求2所述基因TaJRL2的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
7.權(quán)利要求2所述的基因TaJRL2在提高小麥對赤霉病抗性中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求4所述的含有基因TaJRL2的重組表達(dá)載體在提高小麥對赤霉病抗性中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種小麥凝集素類蛋白TaJRL2及其編碼基因與應(yīng)用。小麥凝集素類蛋白TaJRL2，具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，其編碼基因序列如SEQ ID NO1所示。通過基因工程的方法將編碼小麥凝集素類蛋白TaJRL2的基因TaJRL2轉(zhuǎn)入小麥中，可以提高小麥對赤霉病的抗性。由于該基因是糧食作物小麥本身存在的內(nèi)源基因，因此，該基因的超量表達(dá)不會影響植物的食品安全性，可廣泛應(yīng)用于各種植物的抗病育種過程。
文檔編號C07K14/42GK102617721SQ20121008282
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月26日
發(fā)明者徐文琦, 賈海燕, 陳燕, 馬正強(qiáng) 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)