專利名稱：具有靶向抗血栓活性的rgdfyigsr、制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有靶向抗血栓活性的多肽RGDFYIGSR。本發(fā)明還涉及它的制備方法以及它作為抗血栓劑的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
細(xì)胞黏附在細(xì)胞黏附性疾病(癌轉(zhuǎn)移、血栓形成、化學(xué)致炎和骨質(zhì)疏松)的發(fā)展過(guò)程中起關(guān)鍵作用。調(diào)節(jié)性糖蛋白例如昆布氨酸、纖維蛋白原、RGD肽、YIGSR和YIGSK等都可以參與細(xì)胞黏附過(guò)程。它們與整合素受體有很強(qiáng)的結(jié)合能力。例如在血小板聚集過(guò)程中，RGDF與活化的血小板表面受體GP Ilb/IIIa結(jié)合起至關(guān)重要的作用。RGDF與活化的血小 板表面受體GP Ilb/IIIa的特異性結(jié)合，賦予了 RGDF—種重要性質(zhì)，即含RGDF可以向血小 板活化的部位富集。在這樣一個(gè)前提下，把RGDF與抗細(xì)胞黏附的YIGSR綴合，便可以獲得靶向抗細(xì)胞黏附多肽。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是對(duì)RGDF與HGSR進(jìn)行綴合，制備得到具有靶向抗血栓活性的多肽。本發(fā)明的目的之二是提供一種制備抗血栓活性的RGDFYIGSR的方法。該方法包括I.采用液相合成方法，通過(guò)逐步接肽分別合成RGDF和YIGSR的保護(hù)中間體；2.脫去RGDF保護(hù)中間體的C端保護(hù)基；3.脫去HGSR保護(hù)中間體的N端保護(hù)基；4.把C端游離的RGDF保護(hù)中間體和N端游離的HGSR保護(hù)中間體綴合，再脫去保護(hù)基得到RGDFYIGSR。其中，所述的N端保護(hù)基是對(duì)多肽的N端進(jìn)行保護(hù)時(shí)所常用的保護(hù)基團(tuán)，例如可以是叔丁氧羰基(Boc);所述的C端保護(hù)基是對(duì)多肽的C端進(jìn)行保護(hù)時(shí)所常用的保護(hù)基團(tuán)，例如可以是芐氧基(OBzl)，甲氧基(OMe)等。以上所述的液相合成中間體并加以保護(hù)的方法是本領(lǐng)域的常規(guī)并公知的技術(shù)。動(dòng)物模型試驗(yàn)證明，本發(fā)明的RGDFYIGSR具有較強(qiáng)的抗血栓活性。為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實(shí)施例。這些實(shí)施例完全是例證性的，它們僅用來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。本發(fā)明中所出現(xiàn)的縮略語(yǔ)的說(shuō)明THF四氫呋喃DCC二環(huán)己基酰亞胺
DCU二環(huán)己基脲OBzl芐氧基Boc叔丁氧羰基OMe甲氧基HOBtN-羥基苯并三唑NMMN-甲基嗎啉
具體實(shí)施方式
實(shí)施例I HCl · Tyr-Ile-Gly-Ser (Bzl)-Arg(NO2)-OMe 的制備I) Boc-Ser (Bzl) -Arg (NO2) -OMe 的制備將O. 59g(2. Ommol)Boc-Ser (Bzl)溶解在 6ml 無(wú)水 THF 中，O °C 下加入O. 27g(2. Ommol) N-羥基苯并三唑(HOBt)和 O. 45g(2. 2mmol) 二環(huán)己基羰二亞胺(DCC)。攪拌10分鐘后加入O. 539g(2. OmmoDHCl · Arg(NO2)-OMe的無(wú)水THF溶液。反應(yīng)混合物用N-甲基嗎啉(NMM)調(diào)節(jié)pH 8-9，(TC攪拌24小時(shí)。停止反應(yīng)，過(guò)濾除去沉淀出的二環(huán)己基脲(DCU)。濾液減壓濃縮，殘留物溶于乙酸乙酯中，得到的溶液依次用飽和NaHCO3水溶液、5%KHSO4水溶液和飽和NaCl水溶液洗。乙酸乙酯層用無(wú)水NaSO4干燥3小時(shí)。濾除NaSO4,濾液減壓濃縮除去乙酸乙酯。殘留物用柱層析分離(CHCl3 CH3OH, 30 I)，得到O. 969g(95% )目標(biāo)化合物。ESI-MS (m/z) 511 [M+H] +。2)HCl · Ser (Bzl)-Arg(NO2)-OMe 的制備將O. 969g(I. Qmmol)Boc-Ser (Bzl) -Arg(NO2) -OMe 溶解在 15ml 氯化氫-乙酸乙酯溶液(6mol/l)中，室溫?cái)嚢?小時(shí)，TLC檢測(cè)原料點(diǎn)消失，減壓抽去乙酸乙酯，反復(fù)加少量乙醚進(jìn)行減壓抽氣以除去產(chǎn)品中的酸氣。最后加少量乙醚將產(chǎn)品研磨成固體粉末，直接用于下一步反應(yīng)。ESI-MS (m/z) 411 [M+H] +。3) Boc-Ile-Gly-OMe 的制備將O. 498g(2. Ommol)Boc-Ile · H2O 溶解在 5mL 無(wú)水 THF 中，O °C 下力卩入O. 27g(2. OmmoDHOBt 和 O. 45g(2. 18mmol)DCC。攪拌 10 分鐘后加入 O. 251g(2. Ommol)HCl -Gly-OMe的無(wú)水THF溶液。反應(yīng)混合物用NMM調(diào)節(jié)pH 8_9，0°C攪拌24小時(shí)。停止反應(yīng)，過(guò)濾除去沉淀出的DCU。濾液減壓濃縮，殘留物溶于乙酸乙酯中，得到的溶液依次用飽和NaHCO3水溶液、5% KHSO4水溶液和飽和NaCl水溶液洗。乙酸乙酯層用無(wú)水NaSO4干燥3小時(shí)。濾除NaSO4，濾液減壓濃縮除去乙酸乙酯。殘留物用柱層析分離(CHCl3 CH3OH,60 I)。得到 O. 567g(94% )目標(biāo)化合物。ESI-MS (m/z) 303 [M+H]+。4) HCl · Ile-GlyOMe 的制備將O. 567g(l. 87mmol)Boc-Ile-Gly-OMe 溶解在 15ml 氯化氫 _ 乙酸乙酯溶液(6mo I/1)中，室溫?cái)嚢?小時(shí)，TLC檢測(cè)原料點(diǎn)消失，減壓抽去乙酸乙酯，反復(fù)加少量乙醚進(jìn)行減壓抽氣以除去產(chǎn)品中的酸氣。最后加少量乙醚將產(chǎn)品研磨成固體粉末，直接用于下一步反應(yīng)。ESI-MS (m/z) 203 [M+H]+。5) Boc-Tyr-Ile-Gly-OMe 的制備將O. 525g(l. 87mmol)Boc-Tyr 溶解在 5ml 無(wú)水 THF 中，0°C下加入 O. 27g(2. Ommol)HOBt 和 O. 45g(2. 18mmol)DCC0 攪拌 10 分鐘后，加入 O. 377g (I. 87mmol)HCl ·IIe-Gly-OMe的無(wú)水THF溶液。反應(yīng)混合物用NMM調(diào)節(jié)pH 8_9，(TC攪拌24小時(shí)。停止反應(yīng)，過(guò)濾除去沉淀出的DCU。濾液減壓濃縮，殘留物溶于乙酸乙酯中，得到的溶液依次用飽和NaHCO3水溶液、5% KHSO4水溶液和飽和NaCl水溶液洗。乙酸乙酯層用無(wú)水NaSO4干燥3小時(shí)。濾除NaSO4，濾液減壓濃縮除去乙酸乙酯。殘留物用柱層析分離(CHCl3 CH3OH,60 I)。得到O. 808g(93% )目標(biāo)化合物。ESI-MS (m/z) 466 [M+H] +。6)Boc-Tyr-Ile-Gly 的制備將O. 808g(I. 87mmol)Boc-Tyr-Ile-Gly-OMe 溶解在 IOml 甲醇中，O °C 下加入的NaOH(l. 5mol/l)水溶液，調(diào)節(jié)pH值到11，攪拌反應(yīng)O. 5h，TLC檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束。加飽和KHSO4調(diào)節(jié)PH值到6 7，濾除析出的鹽，濾液減壓蒸餾除去全部甲醇，殘留水溶液繼續(xù)用1(肥04調(diào)節(jié)PH值到2，用乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯層合并，用飽和NaCl萃洗三次，無(wú)水NaS04干燥3小時(shí)，過(guò)濾，濾液減壓濃縮除去乙酸乙酯，得到O. 834g(99% )目標(biāo)化合物。ESI-MS(m/z)452[M+H]+。 7)Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser (Bzl)-Arg(NO2)-OMe 的制備將O. 857g(l. 9mmol)Boc-Tyr-Ile-Gly 溶解在 5ml 無(wú)水 THF 中，O °C 下加入O. 257g(l. 9mmol)H0Bt 和 O. 45g(2. 18mmol)DCC。攪拌 10 分鐘后，加入 O. 848g(l. 9mmol)HCl · Ser-Arg (NO2) -OMe的無(wú)水THF溶液。反應(yīng)混合物用NMM調(diào)節(jié)pH 8-9，O V攪拌24小時(shí)。停止反應(yīng)，過(guò)濾除去沉淀出的DCU。濾液減壓濃縮，殘留物溶于乙酸乙酯中，得到的溶液依次用飽和NaHCO3水溶液、5% KHSO4水溶液和飽和NaCl水溶液洗。乙酸乙酯層用無(wú)水NaSO4干燥3小時(shí)。濾除NaSO4，濾液減壓濃縮除去乙酸乙酯。殘留物用柱層析分離(CHCl3 CH3OH,30 I)。得到 1.44g(90%)目標(biāo)化合物。ESI-MS (m/z) 844 [M+H]+。8)HCl · Tyr-Ile-Gly-Ser (Bzl)-Arg(NO2)-OMe 的制備將I. 44g(I. 70mmol)Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser (Bzl)-Arg(NO2)-OMe 溶解在 20ml 氯化氫-乙酸乙酯溶液(6mol/l)中，室溫?cái)嚢?小時(shí)，TLC檢測(cè)原料點(diǎn)消失，減壓抽去乙酸乙酯，反復(fù)加少量乙醚進(jìn)行減壓抽氣以除去產(chǎn)品中的酸氣。最后加少量乙醚將產(chǎn)品研磨成固體粉末，直接用于下一步反應(yīng)。ESI-MS (m/z) 743 [M+H]+。實(shí)施例2 Boc-Arg (Tos)-Gly-Asp (OMe)-Phe 的制備I) Boc-Asp (OMe)-Phe-OBzl 的制備將O. 494g(2. Ommol)Boc-Asp (OMe)溶解在 5ml 無(wú)水 THF 中，O °C 下加入O. 27g(2. OmmoDHOBt 和 O. 45g(2. 18mmol)DCC。攪拌 10 分鐘后，加入 O. 854g(2. Ommol)Tos · Phe-OBzl的無(wú)水THF溶液。反應(yīng)混合物用NMM調(diào)節(jié)pH 8_9，0°C攪拌24小時(shí)。停止反應(yīng)，過(guò)濾除去沉淀出的DCU。濾液減壓濃縮，殘留物溶于乙酸乙酯中，得到的溶液依次用飽和NaHCO3水溶液、5 % KHSO4水溶液和飽和NaCl水溶液洗。乙酸乙酯層用無(wú)水NaSO4干燥3小時(shí)。濾除NaSO4，濾液減壓濃縮除去乙酸乙酯。殘留物用柱層析分離(CHCl3 CH3OH,30 I)。得到 0.96g(99%)目標(biāo)化合物。ESI-MS (m/z) 485 [M+H]+。2) HCl · Asp (OMe) -Phe-OBzl 的制備將O. 960g (I. 98mmol) Boc-Asp (OMe)-Phe-OBzl 溶解在 IOml 氯化氫-乙酸乙酯溶液(6mol/l)中，室溫?cái)嚢?小時(shí)，TLC檢測(cè)原料點(diǎn)消失，減壓抽去乙酸乙酯，反復(fù)加少量乙醚進(jìn)行減壓抽氣以除去產(chǎn)品中的酸氣。最后加少量乙醚將產(chǎn)品研磨成固體粉末，直接用于下一步反應(yīng)。ESI-MS (m/z) 385 [M+H] +。
3) Boc-Arg (Tos) -Gly-OMe 的制備將O. 856g(2. Ommol)Boc-Arg(Tos)溶解在 5ml 無(wú)水 DMF 中，0 °C 下加入O. 27g(2. OmmoDHOBt 和 O. 45g(2. 18mmol)DCC。攪拌 10 分鐘后，加入 O. 251g(2. Ommol)HCl ·Gly-OMe的無(wú)水DMF溶液。反應(yīng)混合物用NMM調(diào)節(jié)pH 8_9，(TC攪拌24小時(shí)。停止反應(yīng)，過(guò)濾除去沉淀出的DCU。濾液減壓濃縮，殘留物溶于乙酸乙酯中，得到的溶液依次用飽和NaHCO3水溶液、5% KHSO4水溶液和飽和NaCl水溶液洗。乙酸乙酯層用無(wú)水NaSO4干燥3小時(shí)。濾除NaSO4，濾液減壓濃縮除去乙酸乙酯。殘留物用柱層析分離(CHCl3 CH3OH,30 I)。得到 0.96g(96%)目標(biāo)化合物。ESI-MS (m/z) 500 [M+H]+。4) Boc-Arg (Tos)-Gly 的制備將O. 960g(I. 9mmol)Boc-Arg(Tos)-Gly-OMe 溶解在 IOml 甲醇中，O °C 下加入的NaOH水溶液(1.5mol/l)調(diào)節(jié)pH值到11，攪拌反應(yīng)O. 5h，TLC檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束。加飽和KHSO4調(diào)節(jié)PH值到6 7，濾除析出的鹽，濾液減壓蒸餾除去全部甲醇，殘留水溶液繼續(xù)用1(肥04調(diào)節(jié)PH值到2，用乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯層合并，用飽和NaCl萃洗三次，無(wú)水NaSO4干燥3小時(shí)，過(guò)濾，濾液減壓濃縮除去乙酸乙酯，得到0.903g(98% )目標(biāo)化合物。ESI-MS(m/ζ)484[Μ-ΗΓ。5) Boc-Arg (Tos)-Gly-Asp (OMe)-Phe-OBzI 的制備將O. 903g (I. 86mmol) Boc-Arg (Tos) -Gly 溶解在 5ml 無(wú)水 THF 中，0 °C 下加入0. 252g(l. 86mmol)H0Bt 和 0. 428g(2. 08mmol)DCC。攪拌 10 分鐘后，加入 0. 784g(l. 86mmol)HCl *Asp (OMe)-Phe-OBzl的無(wú)水THF溶液。反應(yīng)混合物用NMM調(diào)節(jié)pH 8-9，(TC攪拌24小時(shí)。停止反應(yīng)，過(guò)濾除去沉淀出的DCU。濾液減壓濃縮，殘留物溶于乙酸乙酯中，得到的溶液依次用飽和NaHCO3水溶液、5% KHSO4水溶液和飽和NaCl水溶液洗。乙酸乙酯層用無(wú)水NaSO4干燥3小時(shí)。濾除NaSO4，濾液減壓濃縮除去乙酸乙酯。殘留物用柱層析分離(CHCl3 CH3OH,30 I)。得到 1.47g(93%)目標(biāo)化合物。ESI-MS (m/z) 852 [M+H]+。6) Boc-Arg (Tos)-Gly-Asp (OMe)-Phe 的制備將O. 852g (I. Ommol) Boc-Arg (Tos) -Gly-Asp (OMe) -Phe-OBzl 溶解在 IOml 甲醇中，(TC下加入NaOH水溶液(I. 5mol/l)調(diào)節(jié)pH值到11，攪拌反應(yīng)O. 5h，TLC檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束。加飽和KHSO4調(diào)節(jié)pH值到6 7，濾除析出的鹽，濾液減壓蒸餾除去全部甲醇，殘留水溶液繼續(xù)用KHSO4調(diào)節(jié)pH值到2，用乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯層合并，用飽和NaCl萃洗三次，無(wú)水NaSO4干燥3小時(shí)，過(guò)濾，濾液減壓濃縮除去乙酸乙酯，得到O. 731g(96% )目標(biāo)化合物。ESI-MS (ι /ζ)760[Μ-ΗΓ。實(shí)施例3 RGDFYIGSK的制備將200mg(0. 123mmol) Boc-Arg (Tos)-Gly-Asp (OMe)-Phe-Tyr-Ile-Gly-Ser (Bzl)-Lys(Z)-OBzl溶于4mL三氟醋酸中，加入ImL三氟甲磺酸和ImL苯甲醚，(TC下攪拌反應(yīng)I小時(shí)，減壓抽氣5分鐘，一次性加入IOOmL乙醚，析出的產(chǎn)品固體粉末使用S^hadex G 10進(jìn)行提純，得到產(chǎn)品 114mg (89% ). 1HNMR (BHSC-300, CDCl3-d3) δ = 11. O (s，2Η)，7· 80 (d，J = 5. 0Ηζ,8Η),7. 21(d, J = 7·0Ηζ，2Η)，7· 12(m,2H) ,7. 08 (t, J = 7. ΟΗζ, 1Η) ,6. 95 (d, J=7. 0Ηζ,2Η) ,6. 68 (d, J = 7. ΟΗζ, 2Η)，5· 7 (s, 1Η)，5· 0(s, 1Η) ,4. 92 ( q, J = 6. 0Ηζ,2Η)，4. 86 (q, J = 6. ΟΗζ, 1Η)，4· 62 (s，1Η)，4· 50 (t, J = 6. 0Ηζ，2Η)，4· 09 (d, J = 6. 0Ηζ，4Η)，
4.03 (d, J = 7. 0Ηζ，2Η)，3· 56 (m, 1Η), 3. 05 (d, J = 6. 0Ηζ，4Η)，2· 73 (t, J = 6. 0Ηζ，2Η)，2.65 (q, J = 6· 0Hz，4H)，2· 5(m，1H)，2· 0(s，8H)，I. 79(q，J = 7· OHz，4H)，I. 55 (m，4H)，0. 8-1. 3 (m, J = 8. OHz，I OH)。ESI-MS (m/z) 1042 [M+H] +。元素分析 C47H71N13O14 理論值 C54. 17，H 6. 87，N 17. 47.實(shí)測(cè)值 C 60. 80，H 6. 67，N 11. 38。試驗(yàn)例I RGDFYIGSR的抗血栓活性試驗(yàn)I)大鼠手術(shù)與器械SD大鼠(雄性，220 230g)按1200mg .kg—1劑量腹腔注射烏拉坦溶液進(jìn)行麻醉。麻醉大鼠仰臥位固定，分離右頸總動(dòng)脈，于近心端夾動(dòng)脈夾，近心端和遠(yuǎn)心端分別穿入手術(shù)線，將遠(yuǎn)心端的手術(shù)線于皮毛用止血鉗夾緊，準(zhǔn)備在遠(yuǎn)心端插管。2)插管
插管為硅烷化過(guò)的聚乙烯膠管，分三段，中段為聚乙烯膠管，長(zhǎng)60. 0mm，內(nèi)徑
3.5mm ;兩端為相同的聚乙烯管,管長(zhǎng)100. Omm,內(nèi)徑I. Omm,外徑2. Omm該管的一端拉成尖管(用于插入大鼠頸動(dòng)脈或靜脈)，外徑為I. 0mm。將編好號(hào)的干凈青霉素小瓶中分別裝入6cm長(zhǎng)的黑色手術(shù)線，稱重；然后取出絲線，按照編號(hào)放入準(zhǔn)備好的插管的中段較粗的插管中。打開(kāi)大鼠右側(cè)動(dòng)脈夾，用注射器通過(guò)尖管端將管中注滿肝素生理鹽水溶液(50IU · kg—1)，然后將插管的動(dòng)脈端插入大鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈，將計(jì)算量的肝素緩緩注入大鼠體內(nèi)。3)給藥藥品生理鹽水(3ml · kg—1)、阿斯匹林(劑量為30mg/kg)的生理鹽水溶液、RGDFYIGSR的(劑量為ΙΟμπιοΙ/kg)的生理鹽水溶液。夾閉大鼠右側(cè)頸動(dòng)脈夾，拔下插管靜脈端的注射器，將吸有計(jì)算量的藥品水溶的藥液注射器插入插管的靜脈端，打開(kāi)大鼠右側(cè)頸動(dòng)脈夾，將藥品緩緩?fù)迫氪笫篌w內(nèi)。夾閉右側(cè)頸動(dòng)脈夾，將茶館的靜脈端插入分離好的大鼠左側(cè)頸靜脈，打開(kāi)動(dòng)脈夾，使血液開(kāi)始循環(huán)。并同時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)。此過(guò)程中插管中央的粗管中的絲線上會(huì)因?yàn)檠貉h(huán)而產(chǎn)生血栓。4)血栓稱重計(jì)時(shí)開(kāi)始15分鐘后，剪斷動(dòng)靜脈插管，停止循環(huán)，用眼科鑷小心取出絲線，在濾紙上輕輕蘸掉血滴，放入事先稱重好的青霉素小瓶中，精確稱重并記錄。計(jì)算出血栓的濕重。每個(gè)藥品重復(fù)11次給藥。統(tǒng)計(jì)各組的血栓濕重(X 土 SD)，并做t檢驗(yàn)。5)結(jié)果RGDFYIGSR具有很好的抗栓活性。結(jié)果列入表I。表1RGDFYIGSR在大鼠模型上的抗血栓活性
藥品_血栓濕重(X士 SD mg)
Γ 生理鹽水20.97 ±3.18
IM 斯匹林10.10±3.01a
RGDFYIGSR8.84±3.64aη = 11 ；a.與生理鹽水相比，P < O. OOl0
權(quán)利要求
1.具有靶向抗血栓活性的多肽RGDFYIGSR。
2.一種制備權(quán)利要求I的RGDFYIGSR的方法，包括 (1)采用液相合成方法，通過(guò)逐步接肽分別合成RGDF的保護(hù)中間體和HGSR的保護(hù)中間體； (2)脫去RGDF的保護(hù)中間體的C端保護(hù)基； (3)脫去HGSR的保護(hù)中間體的N端保護(hù)基； (4)把N端游離的YIGSR保護(hù)中間體和C端游離的RGDF保護(hù)中間體綴合得到RGDFYIGSR的保護(hù)中間體； (5)把RGDFYIGSR的保護(hù)中間體脫去保護(hù)基，得到RGDFYIGSR。
3.權(quán)利要求I的RGDFYIGSR在制備抗血栓藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種具有靶向抗血栓活性的多肽RGDFYIGSR，還公開(kāi)了它的制備方法以及它作為抗血栓劑的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。本發(fā)明通過(guò)RGDF與YIGSR綴合，制備得到具有靶向抗血栓活性的多肽。動(dòng)物模型試驗(yàn)證明，RGDFYIGSR具有較強(qiáng)的抗血栓活性。
文檔編號(hào)C07K1/06GK102702314SQ20121010510
公開(kāi)日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2006年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月30日
發(fā)明者彭師奇, 王超, 趙婧華, 趙明 申請(qǐng)人:首都醫(yī)科大學(xué)