專利名稱：一種胰島素前體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種胰島素前體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的方法，屬基因工程和分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供一種在不使用化學(xué)誘導(dǎo)物和不添加任何抗生素的條件下，得到高效、可靠的體內(nèi)轉(zhuǎn)化表達(dá)，并可進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)制備長效胰島素融合蛋白的方法。
背景技術(shù)：
糖尿病是一種常見的內(nèi)分泌代謝疾病。近年來，糖尿病正以前所未有之勢席卷全球。在中國，隨著人民生活水平提高和生活方式的改變，糖尿病患病率正快速升高，并呈現(xiàn)發(fā)病年輕化的趨勢。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國已經(jīng)確診的糖尿病患者人數(shù)高達(dá)9240萬人，成為世界上糖尿病患者最多的國家。嚴(yán)重危害人民健康。糖尿病的急慢性并發(fā)癥，尤其是慢性并發(fā)癥，致殘、致死率高，嚴(yán)重影響患者的身心健康，并給個(gè)人、家庭和社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)。在糖尿病治療中，胰島素對(duì)控制血糖達(dá)標(biāo)、預(yù)防并發(fā)癥具有不可替代的作用，也是目前最為有效的糖尿病治療手段之一。近年來，隨著胰島素技術(shù)的發(fā)展，開發(fā)出了胰島素類似物。其中一種長效胰島素類似物-甘精胰島素，正在被越來越多的醫(yī)生和患者接受和使用。重組甘精胰島素是利用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的生物合成人胰島素類似物。它是在人胰島素B鏈羧基末端增加了兩個(gè)精氨酸，同時(shí)也把A鏈羧基末端A21位置的天冬酰胺替換成甘氨酸，皮下注射后，因酸性溶液被中和而形成的微小沉淀可持續(xù)緩慢釋放重組甘精胰島素，繼之吸收入血液也慢，從而產(chǎn)生長達(dá)24小時(shí)平穩(wěn)無峰值的可預(yù)見的血藥濃度。因此，每天定時(shí)皮下注射一次，即可滿足人體對(duì)基礎(chǔ)胰島素的需要?？傊?，在持續(xù)改善血糖控制的情況下，重組甘精胰島素可降低低血糖癥發(fā)生率，提高患者生活質(zhì)量，同時(shí)不增加治療費(fèi)用。在重組胰島素上，目前為兩種表達(dá)系統(tǒng)，一為大腸桿菌包涵體表達(dá)系統(tǒng)，主要為禮來公司和賽諾菲安萬特公司應(yīng)用，代表性的胰島素產(chǎn)品是重組人胰島素、賴脯胰島素以及甘精胰島素，這種技術(shù)較為成熟，開發(fā)較早。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)最突出的優(yōu)點(diǎn)是工藝簡單、產(chǎn)量高、周期短、生產(chǎn)成本低。然而，許多蛋白質(zhì)在翻譯后，需經(jīng)過翻譯后的修飾加工。對(duì)包涵體變復(fù)性以及對(duì)胰酶和羧肽酶B進(jìn)行酶切，然后通過離子交換層析和反相層析進(jìn)行精純。另一種為酵母表達(dá)系統(tǒng)，主要為丹麥諾和諾德公司所采用，使用具有翻譯后修飾的釀酒酵母作為表達(dá)系統(tǒng)，省去了包涵體變復(fù)性的繁瑣及高消耗操作步驟，代表性的產(chǎn)品是重組人胰島素、門冬胰島素以及地特胰島素。我們?cè)趯?duì)基因重組長效人胰島素類似物的研究工作中采用了大腸桿菌包涵體表達(dá)系統(tǒng)。大腸桿菌是研究最成熟的基因工程表達(dá)系統(tǒng)，當(dāng)前已商業(yè)化的基因工程產(chǎn)品大多是通過大腸桿菌表達(dá)。基因重組長效人胰島素類似物的生產(chǎn)制備首先需要人工構(gòu)建合成甘精胰島素的表達(dá)載體，為胰島素類似物的批量生產(chǎn)提供基礎(chǔ)。而本發(fā)明關(guān)鍵目的就是將基因工程胰島素前體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到高表達(dá)大腸桿菌。我們?cè)谘邪l(fā)過程可發(fā)現(xiàn)了一種不需用任何抗生素且可進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)的表達(dá)方法。依據(jù)天然人胰島素的氨基酸序列，合成優(yōu)化了基因D N A片段，通過PCR擴(kuò)增，分別將產(chǎn)物和質(zhì)粒經(jīng)雙酶切處理后連接，形成胰島素表達(dá)的載體質(zhì)粒母體。再通過基因工程，將人胰島素基因A、B鏈的人工合成基因分別組合到大腸桿菌的不同質(zhì)粒上，然后移至菌體內(nèi)，進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)，從而使帶有A、B鏈基因的工程菌株分別產(chǎn)生人胰島素A、B鏈，再用人工的方法，在體外通過二硫鍵使這兩條鏈連接成有活性的人胰島素?；蚬こ倘艘葝u素的一級(jí)結(jié)構(gòu)
基因工程正常(中間)人胰島素的結(jié)構(gòu)如圖I所示，基因工程長效胰島素的結(jié)構(gòu)如圖2所示。
基因工程長效胰島素前體基因序列
TTC GTC AAT CAG CAC CTT TGT GGT TCT CAC CTC GTT GM GCT TTG TAC CTT GTT TGCGGT GM CGT GGT TTC TTC TAC ACT CCT AAG ACT CGT CGT GAA GCT GAA GAC CTC CAG GTTGGT CAG GTT GM CTC GGT GGT GGT CCT GGT GCT GGT TCT CTT CAA CCT CTT GCT CTT GAAGGT TCT CTT CAG AAG CGT GGC ATC GTT GAA CAG TGT TGC ACA TCT ATC TGC TCT CTTTAC CAG CTT GAG AAC TAC TGT GGT TAA TAA

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種胰島素前體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化方法，在初步構(gòu)建好胰島素的表達(dá)載體后，進(jìn)一步將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌的有效的方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種胰島素前體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化方法，具體步驟為
A :將含有基因工程甘精胰島素前體的表達(dá)載體質(zhì)粒的大腸桿菌單克隆菌落接入胰酶大豆肉湯中，在搖床中培養(yǎng) ，培養(yǎng)的溫度為25-40° C，轉(zhuǎn)速200-300RPM，培養(yǎng)15-30小時(shí)后，通過離心的方法收集菌體；
B :將第一步離心收集的菌體溶解到10-20 mM Tris緩沖液，超聲細(xì)菌裂解，然后將裂解物在4° C、離心力為6000g的條件下離心30-45分鐘，之后收集甘精胰島素融合蛋白包涵體，將其所收集的甘精胰島素融合蛋白包涵體溶解到含6-8 M脲素的10-20 mM Tris緩沖液中，然后向溶液中加入金屬親合樹酯，攪拌混勻，使其結(jié)合甘精胰島素融合蛋白，最后通過離心的方法收集金屬親合樹酯；
C :將第二步離心收集的金屬親合樹酯，用6-8 M脲素的10-20mM Tris緩沖液沖洗金屬親合樹酯數(shù)次，以去除雜質(zhì)，最后用含有100-200 mM咪唑和6_8 M脲素的10-20 mMTris緩沖液將結(jié)合的甘精胰島素融合蛋白洗脫，分別取樣進(jìn)行蛋白電泳檢測胰島素融合蛋白的合成。本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)在于此方法中使用的緩沖液的pH值為8-10，
本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)在于步驟B中的金屬親合樹酯為鈷離子或鎳離子親合樹酯。本發(fā)明首先以含胰島素前體的表達(dá)載體為初始靶標(biāo)，通過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌；然后在大腸桿菌中大量高效克隆，從而能夠得到大量重組胰島素。綜合以上就可以篩選到可靠的高表達(dá)的含胰島素前體的物質(zhì)。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)、生產(chǎn)過程可不需用任何抗生素將含有表達(dá)載體質(zhì)粒的細(xì)菌分為兩份接種到胰酶大豆肉湯搖床培養(yǎng)，一份加入含50μ8/πι1卡那霉素，而另一份不加任何抗生素。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不使用抗生素的條件下重組融合蛋白的表達(dá)量與使用抗生素的培養(yǎng)幾乎沒有多大差別。這表明此表達(dá)系統(tǒng)在大腸桿菌體內(nèi)非常穩(wěn)定，有利于生產(chǎn)工藝的簡化； (2)、表達(dá)載體穩(wěn)定，可進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)將攜帶甘精胰島素基因質(zhì)粒大腸桿菌無抗生素培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)2天，質(zhì)粒幾乎無丟失，連續(xù)培養(yǎng)4天，含有質(zhì)粒的細(xì)菌量仍占60%以上。重組蛋白的表達(dá)量與含有質(zhì)粒的細(xì)菌量成正比；
(3)、不需用化學(xué)誘導(dǎo)物；將含有表達(dá)載體質(zhì)粒的細(xì)菌接種到胰酶大豆肉湯搖床分為兩份培養(yǎng)，一份加入ImMIPTG誘導(dǎo)物，而另一份不加誘導(dǎo)物。取樣進(jìn)行蛋白電泳檢測胰島素融合蛋白的合成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沒有加誘導(dǎo)物的培養(yǎng)照常能合成大量的胰島素融合蛋白。盡管加誘導(dǎo)物的培養(yǎng)胰島素融合蛋白合成量占細(xì)菌總蛋白的百分比稍多于未使用誘導(dǎo)物的培養(yǎng)，但由于誘導(dǎo)物的使用大大的抑制了細(xì)菌的生長，其單位體積培養(yǎng)液胰島素融合蛋白合成量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于未使用誘導(dǎo)物的培養(yǎng)。這一特點(diǎn)不僅有可能簡化生產(chǎn)工藝，而且可以不需要昂貴的化學(xué)誘導(dǎo)物，從而可提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本。
具體實(shí)施例方式為了加深對(duì)本發(fā)明的理解，下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，該實(shí)施例僅用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。實(shí)施例I :
一種胰島素前體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化方法，具體步驟為
A :將含有基因工程甘精胰島素前體的表達(dá)載體質(zhì)粒的大腸桿菌單克隆菌落接入胰酶大豆肉湯中，在搖床中培養(yǎng)，培養(yǎng)的溫度為25-40°C，轉(zhuǎn)速200-300RPM，培養(yǎng)15-30小時(shí)后，通過離心的方法收集菌體；
B :將第一步離心收集的菌體溶解到10-20 mM Tris緩沖液，超聲細(xì)菌裂解，然后將裂解物在4° C、離心力為6000g的條件下離心30-45分鐘，之后收集甘精胰島素融合蛋白包涵體，將其所收集的甘精胰島素融合蛋白包涵體溶解到含6-8 M脲素的10-20 mM Tris緩沖液中，然后向溶液中加入金屬親合樹酯，金屬親合樹酯為鈷離子或鎳離子親合樹酯，攪拌混勻，使其結(jié)合甘精胰島素融合蛋白，最后通過離心的方法收集金屬親合樹酯；
C :將第二步離心收集的金屬親合樹酯，用6-8 M脲素的10-20mM Tris緩沖液沖洗金屬親合樹酯數(shù)次，以去除雜質(zhì)，最后用含有100-200 mM咪唑和6_8 M脲素的10-20 mMTris緩沖液將結(jié)合的甘精胰島素融合蛋白洗脫，分別取樣進(jìn)行蛋白電泳檢測胰島素融合蛋白的合成。其中，本發(fā)明中使用的緩沖液的pH值為8-10，本發(fā)明提供了一種胰島素前體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化方法，將含有基因工程甘精胰島素前體的表達(dá)載體質(zhì)粒的大腸桿菌單克隆菌落接入胰酶大豆肉湯中培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)，然后離心收集菌體；收集的菌體溶解，裂解細(xì)菌，離心收集甘精胰島素融合蛋白包含體，將包含體溶解，然后加入金屬親合樹酯，攪拌混勻，離心收集金屬親合樹酯；收集的金屬親合樹酯Tris緩沖液沖洗數(shù)次，去除雜質(zhì),用含有咪唑和脲素的Tris緩沖液將結(jié)合的甘精胰島素融合蛋白洗脫；取樣品進(jìn)行蛋白電泳檢測，驗(yàn)證該蛋白即為所需蛋白。本發(fā)明采用體外培養(yǎng)方式、不含抗生素、不用化學(xué)誘導(dǎo)物、穩(wěn)定性好、表達(dá)量高、應(yīng)用前景廣。
權(quán)利要求
1.一種胰島素前體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化方法，其特征在于具體步驟為 A :將含有基因工程甘精胰島素前體的表達(dá)載體質(zhì)粒的大腸桿菌單克隆菌落接入胰酶大豆肉湯中，在搖床中培養(yǎng)，培養(yǎng)的溫度為25-40°C，轉(zhuǎn)速200-300RPM，培養(yǎng)15-30小時(shí)后，通過離心的方法收集菌體； B :將第一步離心收集的菌體溶解到10-20 mM Tris緩沖液，超聲細(xì)菌裂解，然后將裂解物在4° C、離心力為6000g的條件下離心30-45分鐘，之后收集甘精胰島素融合蛋白包涵體，將其所收集的甘精胰島素融合蛋白包涵體溶解到含6-8 M脲素的10-20 mM Tris緩沖液中，然后向溶液中加入金屬親合樹酯，攪拌混勻，使其結(jié)合甘精胰島素融合蛋白，最后通過離心的方法收集金屬親合樹酯； C :將第二步離心收集的金屬親合樹酯，用6-8 M脲素的10-20mM Tris緩沖液沖洗金屬親合樹酯數(shù)次，以去除雜質(zhì)，最后用含有100-200 mM咪唑和6-8 M脲素的10-20 mMTris緩沖液將結(jié)合的甘精胰島素融合蛋白洗脫，分別取樣進(jìn)行蛋白電泳檢測胰島素融合蛋白的合成。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種胰島素前體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化方法，其特征在于此方法中使用的緩沖液的PH值為8-10。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種胰島素前體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述步驟B中的金屬親合樹酯為鈷離子或鎳離子親合樹酯。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種胰島素前體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化方法，步驟為將含有基因工程甘精胰島素前體的表達(dá)載體質(zhì)粒的大腸桿菌單克隆菌落接入胰酶大豆肉湯中培養(yǎng)，離心收集菌體；將菌體溶解到緩沖液中，將細(xì)菌裂解，收集甘精胰島素融合蛋白包含體，再溶解入含脲素的緩沖液中；向溶液中加入鈷離子親合樹酯，攪拌混勻，使其結(jié)合長效胰島素融合蛋白，離心收集金屬親合樹酯；將收集的鈷離子親合樹酯，用脲素的緩沖液沖洗金屬親合樹酯數(shù)次，最后用緩沖液將結(jié)合的長效胰島素融合蛋白洗脫，分別取樣進(jìn)行蛋白電泳檢測胰島素融合蛋白的合成。本發(fā)明具有提高生產(chǎn)效率、降低生產(chǎn)成本的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C07K1/22GK102628070SQ20121010757
公開日2012年8月8日 申請(qǐng)日期2012年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月13日
發(fā)明者周立慶, 季春香, 左聰, 牛洪森 申請(qǐng)人:麥科羅夫(南通)生物制藥有限公司