專利名稱：擬南芥轉(zhuǎn)錄因子Dof1基因的原核表達載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及ー種轉(zhuǎn)錄因子基因此/7的原核表達載體m^a-Dofl及其在制備Dofl重組蛋白中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
Dof轉(zhuǎn)錄因子是植物特異性轉(zhuǎn)錄因子，從第一個Dof蛋白的cDNA序列在玉米中獲得以來(Yanagisawa S，Izui K. 1993，J Biol Chem, 268:16028-16036)，許多單子葉和雙子葉植物中的Dof蛋白基因被分離，如擬南芥、煙草、南瓜、馬鈴薯、大麥、小麥、水稻等(Yanagisawa S. 2002, Trends Plant Sci, 12:555-560)。研究表明，Dof轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育過程中參與多種生物學(xué)過程，其中包括參與光應(yīng)答和碳氮代謝、種子發(fā)育和萌發(fā)、植物激素應(yīng)答、微管系統(tǒng)發(fā)育等多個途徑。研究發(fā)現(xiàn)，玉米Dof I 在擬南芥(Yanagisawa S，Sheen J. Plant Cell, 1998,10:75-89)和馬鈴薯中(Yanagisawa S, Izui K. J Biol Chem, 1993，268:16028-16036;Kumar R, Taware R. Mol Biol Rep, 2009，DOI 10.1007/s 11033- 008-9436-8)過量表達可促進與碳骨架合成有關(guān)酶表達的增加，進而參與光應(yīng)答基因的表達調(diào)控。此外，玉米Dof家族的一類蛋白-PBF( Prolamin box Binding Factor)還可作為儲存蛋白基因的反式作用因子，對種子儲藏蛋白基因的轉(zhuǎn)錄進行調(diào)控(Mena M, et al. Plant J, 1998, 16:53-62)。小麥中的Dof基因在調(diào)控光應(yīng)答基因方面起了重要作用，主要涉及ー些與光合以及鹿糖運輸有關(guān)的基因(Tanaka MY, Takahata Y，Nakayama H，et al. Planta, 2009,DOI 10. 1007/s00425- 009-0979-2)。松樹的PpDof5轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控樹木發(fā)育過程中氨同化必需的 GS 基因的表達(Rueda-Lopez M, Crespillo R, Canovas FM, et al. PlantJ, 2008, 56(1):73-85)。紅薯的Dof蛋白基因通過負調(diào)控ー個液泡反轉(zhuǎn)錄酶基因
的表達進而影響塊根的碳代謝水平(Isabel-LaMoneda I, DIaz I, Martinez M,et al. Plant J, 2003, 33:329-340)。水稻的Dof轉(zhuǎn)錄因子家族包括30個Dof基因，其中已知 Dof3 的 DNA 結(jié)合域可與 GARE (Gibberellic Acid Response Element)結(jié)合，參與赤霉素調(diào)控谷粒萌發(fā)中糊粉層水解酶基因的表達(Park DH, Lim PO, Kim JS, et al. PlantJ, 2003, 34:161 171),OsDof可能還參與病菌引起的抗氧化過程(Mou ZL, Fan WH, DongXN, Cell, 2003, 113: 935-944)并與光周期開花調(diào)控有關(guān)(Li DJ, Yang CH, Li XB, etal. Planta, 2009， 229: 1159 1169)。研究證明擬南芥Dof轉(zhuǎn)錄因子家族包括36個基因(Li javetzky D, CarboneroP，Vicente-Carbajosa J. BMC Evol Biol, 2003, 3:17), Yanagisawa 等研究發(fā)現(xiàn)玉米Dofl在擬南芥中過量表達可促進與碳骨架合成有關(guān)酶表達的增加，擬南芥的PEPC和丙酮酸激酶(PK)基因的表達均被激活，并且PEPC和PK的酶活性顯著增加。伴隨著葡萄糖含量的減少，ー些游離氨基酸，特別是谷氨酸含量提高，并且轉(zhuǎn)Dofl基因的擬南芥植株中氮含量提高30%，在低氮條件下擬南芥生長也有所改善。擬南芥COGl基因編碼ー個Dof轉(zhuǎn)錄因子，在光敏色素信號轉(zhuǎn)到過程中作為PhyA和phyB信號途徑的負調(diào)控子發(fā)揮作用，過量表達COGl降低了轉(zhuǎn)基因擬南芥植株對紅光和遠紅光的敏感性(Ward JM et al. Plant Cell,2005，17:475-485)。Dof轉(zhuǎn)錄因子0BP3也參與調(diào)控擬南芥光敏色素和隱花色素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(Iwamoto M, Higo K，Takano M. Plant Cell Environ, 2009, 32(5): 592-603)。Kang HG 等發(fā)現(xiàn) Dof 蛋白會對生長素(Kang HG, et al. Proc Natl Acad Sci USA, 1997,94: 7685-7690)和水楊酸(Kang HG. Plant J, 2000, 21:329-339)產(chǎn)生應(yīng)答。此外，Dof轉(zhuǎn)錄因子也參與植物的微管組織形成(Pineau C，et al. Plant J, 2005, 44: 271-289;Konishi, et al. Plant and Cell Physiol, 2007, 48: S197—S197; Yong Guo, et al.The Plant Cell, 2009，21: 3518 - 3534)、種子萌發(fā)(Gualberti G, Papi M, BellucciL, et al. Plant Cell, 2002, 14: 1253 263)以及植物開花過程(Fabio Fornara, etal. Developmental Cell, 2009,17: 75 - 86)。
由于Dof蛋白有多種特性，因此加強了人們對于Dof蛋白的深入研究，利用這個轉(zhuǎn)錄因子的過量表達可用于改善農(nóng)作物代謝的遺傳操作。Dofl蛋白特異性抗體是檢測植物中Dofl蛋白表達水平的有效工具。目前尚未有含有擬南芥轉(zhuǎn)錄因子Dofl基因原核表達及制備Dofl抗體的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種擬南芥轉(zhuǎn)錄因子Dofl的原核表達載體(pET32a-ito/7 )，該載體含有17啟動子和終止子，細菌核糖體結(jié)合位點和以及ー個由6個氨基酸組成的組氨酸標簽His-Tag和Dofl基因cDNA全長序列。本發(fā)明中Dofl基因上游有17啟動子和細菌核糖體結(jié)合位點RBS，T7啟動子的下游有可被IPTG誘導(dǎo)的操作子序列，緊靠ガ0/7基因的起始密碼子上游有ー個由6個氨基酸組成的組氨酸標簽His-Tag。本發(fā)明載體中的ル/7基因來源于擬南芥thaliana,生態(tài)型Col)的cDNA，在GenBank中的登錄號為NM_104048. 3。本發(fā)明另一目的是將擬南芥基因特異cDNA片段的原核表達載體應(yīng)用在制備Dofl重組蛋白和特異肽段中。利用本發(fā)明提供的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌(BL21)，可實現(xiàn)Dofl蛋白的高水平表達，回收分泌到細胞質(zhì)中的Dofl蛋白，可用于Dofl特異抗體的制備。為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案
I、Dofl基因的cDNA片段的擴增
從GenBank中查找擬南芥色素調(diào)控蛋白基因的編碼區(qū)基因序列，并設(shè)計序列如下的一對引物
Dofl5 :5’ -CACCATGGATCTGACGTCAGC-3，，劃線處為酶切位點Afcol，
Dofl3 :5’ -GTCGACTCAATTCTTCTCCATTCTGTTC-3，,劃線處為酶切位點 SalI,
對擬南芥(Arabidopsis thaliana, ecotype, Columbia)的總 RNA 進行 RT-PCR,得到Dofl的編碼區(qū)全長。2、原核表達載體pET32a_ito/7的構(gòu)建
(I)回收并純化ガ0/7的編碼區(qū)基因片段，并將其連接到pMDlS-T載體上，采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過PCR檢測和酶切檢測獲得重組載體pMD18-ito/l。
(2)使用AfcoI和Sal\對質(zhì)粒pMD18_ito/l和pET32a進行雙酶切分別獲得ガo/7基因和pET32a載體片段，電泳后分別進行回收，然后連接、轉(zhuǎn)化，獲得重組質(zhì)粒pET32a-ito/7。3,Dofl基因的重組蛋白誘導(dǎo)條件的優(yōu)化
原核表達載體pET32a-ito/7用熱刺激法導(dǎo)入大腸桿菌蛋白表達專用受體菌株BL21中，獲得轉(zhuǎn)化子菌落，用IPTG進行誘導(dǎo)表達重組蛋白，并對表達時間、IPTG濃度和溫度條件進行優(yōu)化，確定重組蛋白的最優(yōu)表達條件。實驗結(jié)果顯示該蛋白的最優(yōu)表達條件為為ImMIPTG 于 28°C誘導(dǎo) 6h。本發(fā)明的技術(shù)優(yōu)點及效果
從植物體中已鑒定出一系列Dof轉(zhuǎn)錄因子基因，參與調(diào)控植物多個生理生化過程中相關(guān)基因的表達，對其進行遺傳操作可改善農(nóng)作物的品質(zhì)和抗性。本發(fā)明以擬南芥cDNA為模板，克隆出ガ0/7轉(zhuǎn)錄因子基因全長，構(gòu)建其原核表達載體pET32a-ito/7，該載體含有17啟動 子，細菌核糖體結(jié)合位點和一個組氨酸標簽，利用該載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21可實現(xiàn)Dofl蛋白的高水平表達，回收分泌到細胞質(zhì)中的Dofl蛋白，制備的抗血清，一方面可用于植物體內(nèi)Dofl表達水平的檢測，為后期通過遺傳操作研究Dofl蛋白的生理功能和分子功能的研究奠定基礎(chǔ)；另一方面為其他的轉(zhuǎn)錄因子表達水平的檢測提供了一種技術(shù)手段。本方法首次公開了擬南芥轉(zhuǎn)錄因子基因原核表達及制備Dofl蛋白抗體。


圖I是本發(fā)明中擬南芥總RNA的電泳檢測示意圖，其中1-2泳道均為所提擬南芥總 RNA。圖2是本發(fā)明中此/7基因的TA克隆策略示意圖。圖3是本發(fā)明Dofl基因的擴增和TA克隆電泳檢測示意圖，其中A是以擬南芥RNA為底物反轉(zhuǎn)錄成cDNA進行RT-PCR，M A mk/Hindlll ;1_3 -.Dofl的RT-PCR擴增產(chǎn)物；B是重組質(zhì)粒pMD18-ito/7的電泳檢測，M :正對照(分子量為3. 3 kb的質(zhì)粒)；1_2 :重組質(zhì)粒pMDl8-Dofl ；C是重組質(zhì)粒pMD18-ito/7的PCR檢測，M DL2000 ；1 :正對照(以擬南芥cDNA為模板的PCR產(chǎn)物)；2-3 以pMD18-ito/7質(zhì)粒為模板用Dof 15和Dof 13引物擴增的PCR產(chǎn)物；D是重組質(zhì)粒pMD18-ito/7的酶切檢測，M DL2000 ；1~2 =AfcoI和Sall雙酶切產(chǎn)物。圖4是本發(fā)明原核表達載體pET32a_ito/7的構(gòu)建策略示意圖。圖5是本發(fā)明pMD18_ito/7與pET_32a質(zhì)粒使用AfcoI和Sal\酶切結(jié)果電泳檢測示意圖，其中 M Trans 2K plus ;1_3 :pMD18_ito/7 質(zhì)粒酶切結(jié)果；4_5 :pMD18_ito/7 質(zhì)粒對照；6-8 pET-32a質(zhì)粒酶切結(jié)果；9 :pET_32a質(zhì)粒對照。圖6是本發(fā)明pMD18_ito/7與pET_32a質(zhì)粒使用AfcoI和Sall酶切后膠回收結(jié)果電泳檢測圖，其中M :Trans 2K plus ；1 :回收到的此/7片段；2 :回收到的pET_32a片段。圖I是本發(fā)明pET32a_ito/7質(zhì)粒的電泳檢測示意圖，其中1_5 pET32a_ito/7質(zhì)粒。6: pET-32a質(zhì)粒對照。圖8是本發(fā)明pET32a_ito/7的PCR檢測電泳圖(引物使用Dofl5和Dofl3)，其中M =Marker ；1~2 :負對照(分別以ddH20和pET32a質(zhì)粒為模板擴增的PCR產(chǎn)物)；3~7 以pET32a-ito/7質(zhì)粒為模板的PCR擴增產(chǎn)物電泳檢測圖；8 :正對照(以pMD18_ito/7質(zhì)粒為模板擴增的PCR產(chǎn)物)。
圖9是本發(fā)明pET32a_ito/7的酶切電泳檢測圖，其中M =Trans 2K plus ；1 :使用AfcoI和5 /1的雙酶切產(chǎn)物。圖10是本發(fā)明BL21的菌液PCR檢測電泳圖(引物使用Dof 15和Dof 13)，其中M :Trans 2K plus ；1 :正對照(使用pMD18_ito/7質(zhì)粒為模板擴增的PCR產(chǎn)物)；2_3 :使用轉(zhuǎn)入m^a-Dofl的BL21菌液為模板擴增的PCR產(chǎn)物；4_5 :負對照(使用轉(zhuǎn)入pET_32a的BL21菌液為模板擴增的PCR產(chǎn)物)；6 :負對照(使用pET-32a質(zhì)粒為模板擴增得PCR產(chǎn)物)。圖11是本發(fā)明總蛋白SDS-PAG電泳檢測圖，其中M =Protein Marker-0431 ；1 :轉(zhuǎn)pET32a-ito/7 的 BL21 (未カロ IPTG 誘導(dǎo))；2 :轉(zhuǎn) pET_32a 的 BL21 (未カロ IPTG 誘導(dǎo));3_5 :轉(zhuǎn)pET32a-ito/7 的 BL21 (37 °C, I mM IPTG 分別誘導(dǎo) 2，4，6 h) ;6 :轉(zhuǎn) pET_32a 的 BL21 (37°C，1 mM IPTG 誘導(dǎo) 4h) ;7-9 :轉(zhuǎn) pET32a-ito/7 的 BL21 (28 °C,1 mM IPTG 分別誘導(dǎo) 2，4，6h) ;6 :轉(zhuǎn) pET-32a 的 BL21 (28 °C,1 mM IPTG 誘導(dǎo) 4h)。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進ー步詳細說明，但本發(fā)明保護范圍不局限于所述內(nèi)容。本實施例中采用的試劑主要為分子生物學(xué)實驗試劑、各種限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、dNTP等，各種限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、dNTP為日本寶生物工程有限公司(大連)產(chǎn)品，質(zhì)粒提取試劑盒購自博大泰克生物技術(shù)有限公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純，儀器均為分子生物學(xué)以及基因工程實驗室常用儀器。所用引物序列均在上海生工合成，本發(fā)明實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。實施例I :擬南芥總RNA的制備與檢測
擬南芥總RNA的提取使用TRIzoL Reagent (RNA提取試劑，Invitrogen)試劑,對說明書方法稍做修改后進行。取全株幼嫩擬南芥0. I g,加入I ml的TRIzoL RNA提取液,混勻室溫靜置5 min,加入0.2 ml氯仿,振蕩混勻,4 °C, 12000 rpm/min離心15 min。轉(zhuǎn)移上清液，加入0.5 ml異丙醇,混勻室溫放置10 min后12000rpm/min離心10 min。棄上清,75%的こ醇I ml清洗沉淀,4 °C, 7500 rpm/min離心5 min,真空干燥沉淀,用20 U I焦碳酸ニこ酷(DEPC)處理水溶解RNA，-20 V。取Iul RNA用I. 2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，結(jié)果(圖I)說明提取到的RNA質(zhì)量符合要求。 實施例2 :擬南芥cDNA的合成
用擬南芥總 RNA 為模板，使用 RevertAid -MuLV Reverse Transcriptase Kit (反轉(zhuǎn)錄試劑盒，F(xiàn)ermentas)進行 cDNA 的合成。取植物總 RNA 0. 1-0. 5 u g, Oligo (dT) 50ng,10 mM dNTP mix I u I,用DEPC處理水補足至9 yl，混勻后，短暫離心將其收集于管底，置于65で恒溫干熱加熱器中加熱5 min，冰浴10 min，加入反應(yīng)混合物11 u I (10XRTBuffer 4u 1,25 mM MgCl2 4 u 1,0. I M DTT 2 u I, RNA 酶抑制劑 I y I )，混勻，短暫離心將其收集于管底，25で保溫2 min，加入I RevertAicT-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶，混勻25で保溫20 min，然后42で保溫70 min，冰浴10 min, -20で保存?zhèn)溆?。實施? -.Dofl基因的擴增與TA克隆
Dofl基因的擴增及TA克隆的策略如圖2所示，首選從GenBank中查找此/7的編碼區(qū)序列全長，并設(shè)計ー對引物，序列如下
Dofl5 :5’ -CACCATGGATCTGACGTCAGC-3’,
Dofl3 :5’ -GTCGACTCAATTCTTCTCCATTCTGTTC-3，,
5’端引物Dofl5 ，末端添加AfcoI位點；3’端引物Dof 13，末端添加5^1位點。用Dofl基因上下游特異性引物Dof 15和Dof 13作RT-PCR，在RT-PCR反應(yīng)混合液中加入3 ill的cDNA作為模板，同時加入50ng的特異性引物Dof 15和Dof 13，2. 5 u I dNTP(2. 5 mM，)0. 25ii I 的 Ex taq DNA 聚合酶(5 U/y I)和 2. 5 y I 的 IOXEx taq 酶反應(yīng)緩沖液(日本寶生物)，加雙蒸水使反應(yīng)終體積為25iU。在PCR儀上于94°C加熱2分鐘，然后按照94で、30秒，55で、30秒，72で、45秒的程序進行30個循環(huán)的反應(yīng)，最后在72°C延長反應(yīng)10分鐘的程序進行PCR反應(yīng)擴增得到AT77基因。反應(yīng)完成后，通過瓊脂糖凝膠電泳分萬Dofl的PCR擴增產(chǎn)物(圖3A)，回收并純化此/2編碼區(qū)全長片段(600 bp)，然后用寶生物(TaKaRa)的TA克隆試劑盒將其連接到pMD18_T (大連寶生物公司)載體上，實驗操作按試劑盒的說明書進行，反應(yīng)過夜后用反應(yīng)混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5 a (購自天根生化科技公司)，采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳(圖3B)，選取大小和理論值相符的重組質(zhì)粒pMD18-ito/7做進ー步的PCR檢測，用Dofl基因上下游特異性引物Dofl5和Dof 13作PCR，亞克隆成功的重組質(zhì)粒均能擴增出600 bp左右的此/7基因DNA片段(圖3C)。根據(jù)陽性重組質(zhì)粒pMD18-ito/7載體兩端的多克隆位點，用AfcoI和Sall雙酶切重組質(zhì)粒，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，連接成功的重組質(zhì)粒pMD18-ito/7產(chǎn)生2條帶，一條為600bp左右的基因DNA插入片段，另一條為2. 7 kb的載體片段(圖3D)，經(jīng)序列分析證明該載體中的插入片段是的編碼區(qū)全長片段。再次確認是連接成功的質(zhì)粒后，重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，挑單個菌落進行液體培養(yǎng)，用試劑盒純化質(zhì)粒pMD18_ito/7。實施例4 :原核表達載體pET32a_ito/7的構(gòu)建
pET32a~Zto/7 的構(gòu)建策略如圖 4 所不，用 AfcoI (Fermentas)和 5 /1 (Fermentas)切開純化的質(zhì)粒載體pET32a (Novagen)和pMD18_ガo/7,通過瓊脂糖凝膠電泳分離已切開的載體和插入片段(圖5)，從凝膠中回收pET32a被切割后產(chǎn)生的載體片段(5. 9kb)及pMD18_ito/7被切割產(chǎn)生的ガo/7基因的DNA片段(600 bp)(圖6)，然后用寶生物(TaKaRa)的連接酶試劑盒連接pET32a片段和Dofl基因的DNA片段產(chǎn)生原核表達pET32a_ito/7。用連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化高效率(IO8)的大腸桿菌感受態(tài)(DH5 a，天根生化科技)，把轉(zhuǎn)化好的大腸桿菌涂于加有氨芐青霉素(Amp，100 u g/ml)的LB平板上，于37°C過夜培養(yǎng)，篩選Amp抗性重組子菌落，從Amp抗性重組子菌落中提取質(zhì)粒(圖7)，以ガ0/7基因上下游引物進行PCR擴增檢測(圖8)，連接成功的質(zhì)粒載體pET32a-ito/7可擴增出大小為600bp飽DofI片段。使用AfcoI和5^1進行酶切重組質(zhì)粒進行檢測，連接成功的質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠電泳圖上產(chǎn)生的條帶與預(yù)期結(jié)果相符(圖9)。通過測序后再次確認是連接成功的質(zhì)粒后，重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，挑單個菌落以液體LB進行培養(yǎng)，用試劑盒純化質(zhì)粒pET32a_ito/7。實施例5 m^a-Dofl的原核表達
選取確認正確的pET32a-ito/7質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，具體步驟為將2 ul純化質(zhì)粒加入感受態(tài)大腸桿菌BL21 100 ill中，冰浴20 min后，42°C熱刺激45 S，冰浴10 min ;カロA 900 u I SOC液體培養(yǎng)基，37°C、200 rpm搖床培養(yǎng)60 min ； 10000 rpm離心Imin ;在超凈臺上吸去上清，剩約100 時，用槍吸打混勻，轉(zhuǎn)入帶有Amp抗性的LB平板上，用無菌三角玻璃棒涂布均勻；37°C過夜培養(yǎng)；挑取單克隆，接種于添加Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，180 rpm搖床過夜培養(yǎng)。以ガo/7基因上下游引物進行菌落PCR擴增檢測，轉(zhuǎn)化成功的陽性克隆可發(fā)現(xiàn)600bp的Dofl條帶(圖10)。挑取確定轉(zhuǎn)化成功的含有pET32a_ito/7的BL21大腸桿菌菌株接種于含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37で過夜培養(yǎng)后，取500 ill菌液于盛有50 ml液體LB培養(yǎng)基中，37で、180 rpm搖床培養(yǎng)2 h左右，測定菌液OD值到0. 6-0. 8。之后，取出2 ml菌液后，將剩余菌液中添加IPTG (使用終濃度為I mM)誘導(dǎo)，分別于37°C和28°C條件下，180 rpm搖床培養(yǎng)，每隔兩小時取一次樣品，使得樣品分別為ImM IPTG誘導(dǎo)2，4，6 h。將取得的菌液4°C，12000 rpm 離心 2 min,棄上清后，使用 I ml Washing Buffer (10% 甘油，100 mM Tris-HCl(pH7. 4))清洗2次，加入100 ul ddH20，超聲破碎至溶液澄清，4で，12000 rpm離心2 min后加入25 ul 5XLoading Buffer,沸水浴中煮沸10 min, -20 °C保存用于蛋白分析。實施例6 :原核表達載體pET32a_ito/7的SDS-PAGE電泳檢測
分別分離膠(8 ml ddH20 ；10 ml Solution A :30% 丙烯酰胺儲存液；5. 3 ml SolutionB 1. 5 M Tris (pH8. 8),0. 4% SDS ；0. 25 ml 10% 過硫酸銨；0. 013 ml TEMED 溶液)和濃縮膠(6. 3 ml ddH20 ；1. 6 ml Solution A :30% 丙烯酸胺儲存液；2. I ml Solution C :0. 5 MTris(pH6. 8),0. 4% SDS ；0. 13 ml 10% 過硫酸銨；0. 018 ml TEMED 溶液)，每種樣品取 10 ul上樣，電壓100 V，電流70-90 mA，電泳結(jié)束后，取出分離膠，加入染色液(0.25g考馬斯亮藍溶解于90ml甲醇水(1:1)和IOmL冰醋酸溶液中過濾出去顆粒物質(zhì))染色30min,之后使用脫色液(90%甲醇,2%冰醋酸)脫色60 min,去除染色液,加入蒸懼水,搖床45 rpm脫色至條帶清晰?？梢娪蠨ofl的特異性條帶出現(xiàn)，而未加IPTG誘導(dǎo)的pET32a-ito/7菌液，以及添 加了 IPTG培養(yǎng)的由pET32a空載體轉(zhuǎn)化的BL21菌液中沒有此條帶產(chǎn)生(圖11)，當用I mMIPTG誘導(dǎo)6小時后Dofl蛋白表達量最高。
權(quán)利要求
1.擬南芥ガo/7基因特異cDNA片段的原核表達載體，其特征在于含有17啟動子和終止子，細菌核糖體結(jié)合位點、ー個由6個氨基酸組成的組氨酸標簽和ガ0/7特異cDNA片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的擬南芥基因特異cDNA片段的原核表達載體，其特征在于-.Dofl基因的上游有17啟動子和細菌核糖體結(jié)合位點RBS，17啟動子的下游有可被IPTG誘導(dǎo)的操作子序列，緊靠ガ0/7基因片段的起始密碼子上游是ー個由6個氨基酸組成的組氨酸標簽序列His-Tag。
3.根據(jù)權(quán)利要求I的擬南芥此/7基因特異cDNA片段的原核表達載體，其特征在于轉(zhuǎn)錄因子基因ガo/7的cDNA來源于擬南芥，其在GenBank登錄號為NM_104048. 3。
4.權(quán)利要求I的擬南芥ガ0/7基因特異cDNA片段的原核表達載體在制備Dofl重組蛋白和特異肽段中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高效表達轉(zhuǎn)錄因子的原核表達載體pET32a-Dof1。該載體是含有擬南芥轉(zhuǎn)錄因子基因(Dof1)的原核表達專用載體。本發(fā)明使用RT-PCR的方法從模式植物擬南芥中克隆出Dof1基因，用T7啟動子控制它在大腸桿菌中表達，在IPTG誘導(dǎo)乳糖操縱子時在EcoliBL21中過量表達，表達的重組蛋白質(zhì)分泌到細胞質(zhì)中，不形成包涵體，分離得到的重組蛋白質(zhì)，可作為抗原用于Dof1抗體制備。
文檔編號C07K14/415GK102643851SQ20121012772
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月27日
發(fā)明者李昆志, 潘麗峰, 王藝霖, 陳麗梅 申請人:昆明理工大學(xué)