專利名稱：Ⅰ型人膠原蛋白和表皮生長因子雙表達(dá)載體及其表達(dá)純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到同時表達(dá)兩種蛋白的重組載體。
背景技術(shù)：
膠原蛋白(collagen)是廣泛分布于動物結(jié)締組織的一組蛋白質(zhì)家族,也是體內(nèi)含量最多的一種蛋白質(zhì)，約占蛋白質(zhì)總量的25% 33%，其對維護(hù)細(xì)胞、組織、器官的正常生理功能和損傷修復(fù)有重要作用。膠原蛋白作為天然的生物資源，具有合成高分子材料無法比擬的生物相容性和生物可降解性，可廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥、化妝品等工業(yè)中。目前，膠原蛋白已經(jīng)成功地在多種宿主細(xì)胞中得到表達(dá)，包括哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、酵母、大腸桿菌、轉(zhuǎn)基因煙草、小鼠和蠶等，尤其在畢赤酵母中膠原蛋白有極高的分泌表達(dá)特性，最高達(dá)14. 8g/L。 本公司2011年研究表明I型與III型膠原蛋白在畢赤酵母中融合表達(dá)，表達(dá)量達(dá)10g/L以上，并成功申報(bào)專利，專利申請?zhí)枮?01010527766. 7。表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)是在1962年由Cohen從小鼠頜下腺分離得到，人表皮生長因子又稱抑胃素，是存在于人體內(nèi)的一種具有廣泛的生物學(xué)功能的多肽生長因子，且具有難透析、耐熱、不被胰蛋白酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶消化的理化特性。表皮生長因子是由53個氨基酸組成的單鏈多肽，活性中心位于48-53個氨基酸殘基之間，一級結(jié)構(gòu)不含丙氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸，二級結(jié)構(gòu)排列緊秘，穩(wěn)定性強(qiáng)，相對分子量為604 a，等電點(diǎn)PI為4. 6，含3個鏈內(nèi)二硫鍵，二硫鍵為其生物活性所必需。表皮生長因子具有促有絲分裂和非促有絲分裂二重活性，能刺激外胚層、中胚層和內(nèi)胚層細(xì)胞增殖和分化，促進(jìn)組織生長、發(fā)育和成熟。表皮細(xì)胞上有豐富的表皮生長因子受體(EGFR)，表皮生長因子與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合后，通過受體的自磷酸化，激活蛋白G和磷酸脂酶C等一系列生化反應(yīng)，改變細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度，從而向核內(nèi)傳遞增殖信號，誘導(dǎo)核內(nèi)基因表達(dá)加強(qiáng)，促進(jìn)糖酵解及蛋白質(zhì)、RNA和DNA的合成，從而促使細(xì)胞分裂和增殖。實(shí)驗(yàn)研究表明，外源性表皮生長因子對多種組織來源的上皮及表皮細(xì)胞有較強(qiáng)的促有絲分裂活性。表皮生長因子能刺激角膜上皮和內(nèi)皮增殖，促進(jìn)角膜內(nèi)皮細(xì)胞遷移、滴眼給藥可明顯加快角膜創(chuàng)傷的愈合。表皮生長因子也能刺激皮膚表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等的增殖，促進(jìn)各種皮膚創(chuàng)傷的愈合和修復(fù)，加速移植皮膚的生長和愈合。表皮生長因子還能抑制胃酸分泌，促進(jìn)胃、十二指腸潰瘍的愈合，防治胃潰瘍及胃酸分泌過多癥。隨著對表皮生長因子研究的不斷深入和在臨床上應(yīng)用的日益廣泛，市場對表皮生長因子的需求量越來越高，目前，最適合大規(guī)模生產(chǎn)表皮生長因子的方法是利用基因重組技術(shù)轉(zhuǎn)化大腸桿菌、酵母等，但由于生產(chǎn)困難及產(chǎn)量較低使表皮生長因子的價格居高不下，1992年，中科院上海生化所構(gòu)建E. coli堿性磷酸酶啟動子及信號肽序列表皮生長因子基因的pAE-8質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化該酶缺失的E. coli變異株K539，得表達(dá)菌株EEB，表皮生長因子產(chǎn)量I. 5mg/L ; 1993年，人們利用OmpA構(gòu)建出了 pETacECF質(zhì)粒，使表皮生長因子分泌至胞外，最高產(chǎn)量可達(dá)300mg/L和391mg/L。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的一個技術(shù)問題在于克服上述基因重組人表皮生長因子表達(dá)量低的缺點(diǎn)，提供一種I型人膠原蛋白和表皮生長因子雙表達(dá)載體。本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題在于提供一種簡單、有效的I型人膠原蛋白和表皮生長因子雙表達(dá)載體的構(gòu)建方法。解決上述技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是該I型人膠原蛋白和表皮生長因子雙表達(dá)載體插入的外源序列氮端為I型人膠原蛋白的600個氨基酸，碳端為表皮生長因子的53個氨基酸，在I型人膠原蛋白上游添加PPIC9K載體自身a信號肽切割位點(diǎn)和用于連接載體的亮氨酸和谷氨酸，在表皮生長因子上游添加PPIC9K載體自身a信號肽切割位點(diǎn)和用于連接I型人膠原蛋白的谷氨酸和苯丙氨酸，該I型人膠原蛋白和表皮生長因子雙表達(dá)載體的氨基酸序列如下I LEKREAGVAG PKGPAGERGS PGPAGPKGSP GEAGRPGEAG LPGAKGLTGS PGSPGPDGKT61 GPPGPAGQDG RPGPPGPPGA RGQAGVMGFP GPKGAAGEPG KAGERGVPGP PGAVGPAGKD121 GEAGAQGPPG PAGPAGERGE QGPAGSPGFQ GLPGPAGPPG EAGKPGEQGV P⑶LGAPGPS181 GARGERGFPG ERGVQGPPGP AGPRGANGAP GNDGAKGDAG APGAPGSQGA PGLQGMPGER241 GAAGLPGPKG DRGDAGPKGA DGSPGKDGVR GLTGPIGPPG PAGAP⑶KGE SGPSGPAGPT301 GARGAP⑶RG EPGPPGPAGF AGPPGADGQP GAKGEPGDAG AKGDAGPPGP AGPAGPPGPI361 GNVGAPGAKG ARGSAGPPGA TGFPGAAGRV GPPGPSGNAG PPGPPGPAGK EGGKGPRGET421 GPAGRPGEVG PPGPPGPAGE KGSPGADGPA GAPGTPGPQG IAGQRGVVGL PGQRGERGFP481 GLPGPSGEPG KQGPSGASGE RGPPGPMGPP GLAGPPGESG REGAPGAEGS PGRDGSPGAK541 ⑶RGETGPAG PPGAPGAPGA PGPVGPAGKS ⑶RGETGPAG PAGPVGPVGA RGPAGPQGPR601 GDKGETEFKR EANSDSECPL SHDGYCLHDG VCMYIEALDK YACNCVVGYI GERCQYRDLK661 WffELR本發(fā)明的pPIC9K載體自身a信號肽切割位點(diǎn)氨基酸序列為LyS-Arg-Glu_Ala。本發(fā)明的表皮生長因子的核苷酸序列為I AATTCTGATT CTGAATGTCC TTTGTCCCAC GATGGTTACT GCTTGCATGA TGGTGTCTGC61 ATGTATATTG AAGCATTGGA TAAGTATGCT TGTAACTGTG TTGTTGGCTA CATCGGTGAG121 AGATGTCAGT ACAGAGACTT GAAGTGGTGG GAATTGAGAT AA上述的I型人膠原蛋白和表皮生長因子雙表達(dá)載體的表達(dá)純化方法由下述步驟組成I、基因的獲得從離體的人胎盤中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，設(shè)計(jì)I型人膠原蛋白(COLl)基因PCR擴(kuò)增引物，引入限制性酶切位點(diǎn)Xho I ,EcoR I和pPIC9K載體自身a信號肽切割位點(diǎn)序列AAACGAGAAGCT，引物序列為F: CGCTCGAGAAACGAGAAGCTGGTGTTGCTGGTCCCA、
R: CGGAATTCTGTCTCACCCTTGTCACCACG采用PCR方法擴(kuò)增獲得I型人膠原蛋白基因。
重新設(shè)計(jì)并合成表皮生長因子核苷酸序列，添加限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)EcoR I、Not I和pPIC9K載體自身a信號肽切割位點(diǎn)序列AAACGAGAAGCT，表皮生長因子(EGF)核苷酸序列如下I GAATTCAAAC GAGAAGCTAA TTCTGATTCT GAATGTCCTT TGTCCCACGA TGGTTACTGC61 TTGCATGATG GTGTCTGCAT GTATATTGAA GCATTGGATA AGTATGCTTG TAACTGTGTT121 GTTGGCTACA TCGGTGAGAG ATGTCAGTAC AGAGACTTGA AGTGGTGGGA ATTGAGATAA181 GCGGCCGC2、載體pPIC9K與I型人膠原蛋白、表皮生長因子的連接對pPIC9K及I型人膠原蛋白進(jìn)行Xho I和EcoR I雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，用DNA 連接酶連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提取質(zhì)粒，命名為PPIC9K-C0L1 ;對pPIC9K-C0Ll質(zhì)粒與表皮生長因子分別進(jìn)行EcoR I及Not I雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，用DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提取質(zhì)粒，命名為pPIC9K-C0Ll-EGF。pPIC9K載體購置于Invitrogen公司。該重組DNA序列如下I CTCGAGMAC GAGAAGCTGG TGTTGCTGGT CCCAAGGGTC CCGCTGGTGA ACGTGGTTCT61 CCTGGCCCTG CTGGCCCCAA AGGATCTCCT GGTGMGCTG GTCGTCCCGG TGAAGCTGGT121 CTGCCTGGTG CCAAGGGTCT GACTGGAAGC CCTGGCAGCC CTGGTCCTGA TGGCAAMCT181 GGCCCCCCTG GTCCCGCCGG TCAAGATGGT CGCCCCGGAC CCCCAGGCCC ACCTGGTGCC241 CGTGGTCAGG CTGGTGTGAT GGGATTCCCT GGACCTAAAG GTGCTGCTGG AGAGCCCGGC301 AAGGCTGGAG AGCGAGGTGT TCCCGGACCC CCTGGCGCTG TCGGTCCTGC TGGCAAAGAT361 GGAGAGGCTG GAGCTCAGGG ACCCCCTGGC CCTGCTGGTC CCGCTGGCGA GAGAGGTGM421 CMGGCCCTG CTGGCTCCCC CGGATTCCAG GGTCTCCCTG GTCCTGCTGG TCCTCCAGGT481 GMGCAGGCA MCCTGGTGA ACAGGGTGTT CCTGGAGACC TTGGCGCCCC TGGCCCCTCT541 GGAGCAAGAG GCGAGAGAGG TTTCCCTGGC GAGCGTGGTG TGCAAGGTCC CCCTGGTCCT601 GCTGGTCCCC GAGGGGCCAA CGGTGCTCCC GGCAACGATG GTGCTAAGGG TGATGCTGGT661 GCCCCTGGAG CTCCCGGTAG CCAGGGCGCC CCTGGCCTTC AGGGMTGCC TGGTGAACGT721 GGTGCAGCTG GTCTTCCAGG GCCTAAGGGT GACAGAGGTG ATGCTGGTCC CAAAGGTGCT781 GATGGCTCTC CTGGCAMGA TGGCGTCCGT GGTCTGACTG GCCCCATTGG TCCTCCTGGC841 CCTGCTGGTG CCCCTGGTGA CAAGGGTGAA AGTGGTCCCA GCGGCCCTGC TGGTCCCACT901 GGAGCTCGTG GTGCCCCCGG AGACCGTGGT GAGCCTGGTC CCCCCGGCCC TGCTGGCTTT961 GCTGGCCCCC CTGGTGCTGA CGGCCMCCT GGTGCTAAAG GCGAACCTGG TGATGCTGGT1021 GCTAAAGGCG ATGCTGGTCC CCCTGGCCCT GCCGGACCCG CTGGACCCCC TGGCCCCATT1081 GGTAATGTTG GTGCTCCTGG AGCCAAAGGT GCTCGCGGCA GCGCTGGTCC CCCTGGTGCT1141 ACTGGTTTCC CTGGTGCTGC TGGCCGAGTC GGTCCTCCTG GCCCCTCTGG AAATGCTGGA1201 CCCCCTGGCC CTCCTGGTCC TGCTGGCAAA GAAGGCGGCA AAGGTCCCCG TGGTGAGACT1261 GGCCCTGCTG GACGTCCTGG TGAAGTTGGT CCCCCTGGTC CCCCTGGCCC TGCTGGCGAG1321 AMGGATCCC CTGGTGCTGA TGGTCCTGCT GGTGCTCCTG GTACTCCCGG GCCTCAAGGT1381 ATTGCTGGAC AGCGTGGTGT GGTCGGCCTG CCTGGTCAGA GAGGAGAGAG AGGCTTCCCT1441 GGTCTTCCTG GCCCCTCTGG TGAACCTGGC AAACMGGTC CCTCTGGAGC AAGTGGTGM1501 CGTGGTCCCC CTGGTCCCAT GGGCCCCCCT GGATTGGCTG GACCCCCTGG TGAATCTGGA
1561 CGTGAGGGGG CTCCTGGTGC CGAAGGTTCC CCTGGACGAG ACGGTTCTCC TGGCGCCAAG1621 GGTGACCGTG GTGAGACCGG CCCCGCTGGA CCCCCTGGTG CTCCTGGTGC TCCTGGTGCC1681 CCTGGCCCCG TTGGCCCTGC TGGCAAGAGT GGTGATCGTG GTGAGACTGG TCCTGCTGGT1741 CCCGCCGGTC CTGTCGGCCC TGTTGGCGCC CGTGGCCCCG CCGGACCCCA AGGCCCCCGT1801 GGTGACMGG GTGAGACAGA ATTCAMCGA GAAGCTAATT CTGATTCTGA ATGTCCTTTG1861 TCCCACGATG GTTACTGCTT GCATGATGGT GTCTGCATGT ATATTGAAGC ATTGGATAAG1921 TATGCTTGTA ACTGTGTTGT TGGCTACATC GGTGAGAGAT GTCAGTACAG AGACTTGAAG1981 TGGTGGGAAT TGAGATAAGC GGCCGC3、畢赤酵母電轉(zhuǎn)化將10 ii g經(jīng)Sal I內(nèi)切酶線性化的PPIC9K-C0L1-EGF質(zhì)粒，與80 ii L畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞混勻，轉(zhuǎn)至0. 2cm冰預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中，電擊4 10毫秒，加入ImL冰預(yù)冷的lmol/L的山梨醇溶液將菌體混勻，涂布MD培養(yǎng)基平板，30 1倒置培養(yǎng)2 3天，在MD培養(yǎng)基平板上長出菌落。畢赤酵母GS115購買于西安依科西安依科生物技術(shù)有限公司。4、多拷貝插入重組子的篩選將MD培養(yǎng)基平板上長出的菌落用無菌牙簽對應(yīng)接種到G418濃度分別為0. 5g/L、lg/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L的YPD平板上，30°C培養(yǎng)，篩選獲得轉(zhuǎn)化子，G418購買于西安依科生物技術(shù)有限公司。5、I型人膠原蛋白和表皮生長因子的發(fā)酵表達(dá)將篩選到的轉(zhuǎn)化子接種于400ml BMGY培養(yǎng)基中，30 1振蕩培養(yǎng)24小時，作為一級種子轉(zhuǎn)接于裝有4L FBS培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，溫度設(shè)定為30 °C，pH值為5.0，培養(yǎng)16 20小時，作為二級種子轉(zhuǎn)接入裝有FBS培養(yǎng)基的150L大罐發(fā)酵，生長溫度30°C，誘導(dǎo)溫度29°C，pH值為5. 5，溶氧控制在20% 30%，流加質(zhì)量濃度為75%的含12 mL/L PTMl微量元素的甲醇水溶液，F(xiàn)BS培養(yǎng)基與質(zhì)量濃度為75%的含12 mL/L PTMl微量元素的甲醇水溶液的體積比為1:0. 25，誘導(dǎo)發(fā)酵36 42小時。在發(fā)酵分泌表達(dá)出胞外的過程中，切割a信號肽切割位點(diǎn)，切割出I型人膠原蛋白、表皮生長因子兩種蛋白。6、I型人膠原蛋白和表皮生長因子的純化發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液離心分離，取上清液，用孔徑為0. I 中空纖維微濾系統(tǒng)進(jìn)行微濾，收集濾過液，用分子量為1000D的卷式超濾膜超濾，收集濃縮液，獲得表皮生長因子與I型人膠原蛋白混合濃縮液，用分子篩層析分離，分別收集表皮生長因子與I型人膠原蛋白，獲得表皮生長因子粗蛋白液及I型人膠原蛋白粗蛋白液；表皮生長因子粗蛋白液用陰離子交換層析，獲得表皮生長因子；I型人膠原蛋白粗蛋白液，用陽離子交換層析，獲得I型人膠原蛋白。6、I型人膠原蛋白和表皮生長因子進(jìn)行檢測鑒定將發(fā)酵液上清及純化后的I型人膠原蛋白和表皮生長因子使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測方法進(jìn)行檢測，用Western Blot蛋白免疫印跡法進(jìn)行鑒定。本發(fā)明的技術(shù)優(yōu)點(diǎn) I、本發(fā)明采用I型人膠原蛋白在畢赤酵母中的高表達(dá)特性，引導(dǎo)表皮生長因子產(chǎn)生高表達(dá)，同時引入PPIC9K載體自身a信號肽切割位點(diǎn)，在分泌表達(dá)過程中切割獲得兩種單體蛋白，建產(chǎn)一種外源蛋白與膠原蛋白畢赤酵母雙表達(dá)體系，豐富和增強(qiáng)人類通過基因工程技術(shù)表達(dá)、純化重組目標(biāo)產(chǎn)物的手段和能力。2、本發(fā)明采用的宿主菌是畢赤酵母，畢赤酵母為單細(xì)胞真核生物，生長快，易于分子遺傳操作，同時畢赤酵母的醇氧化酶基因的啟動子具有強(qiáng)誘導(dǎo)性和強(qiáng)啟動性，適于外源基因的高水平表達(dá)。


圖I是實(shí)施例I中重組雙表達(dá)載體PPIC9K-C0L1-EGF的質(zhì)粒圖譜；圖2是實(shí)施例中I型人膠原蛋白基因的PCR產(chǎn)物電泳圖；圖3是實(shí)施例中pPIC9K-C0Ll-EGF質(zhì)粒雙酶切鑒定電泳圖； 圖4是實(shí)施例中雙表達(dá)融合蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳5是實(shí)施例中I型人膠原蛋白的Western Blot鑒定6是實(shí)施例中表皮生長因子的Western Blot鑒定圖
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。實(shí)施例I本實(shí)施例的I型人膠原蛋白和表皮生長因子雙表達(dá)載體插入外源序列的氮端為I型人膠原蛋白的600個氨基酸，碳端為表皮生長因子的53個氨基酸，該表皮生長因子的核苷酸序列如下I AATTCTGATT CTGAATGTCC TTTGTCCCAC GATGGTTACT GCTTGCATGA TGGTGTCTGC61 ATGTATATTG AAGCATTGGA TAAGTATGCT TGTAACTGTG TTGTTGGCTA CATCGGTGAG121 AGATGTCAGT ACAGAGACTT GAAGTGGTGG GAATTGAGAT AA在I型人膠原蛋白上游添加氨基酸序列為Lys-Arg-Glu-Ala以及用于連接載體的亮氨酸和谷氨酸，在表皮生長因子上游添加氨基酸序列為Lys-Arg-Glu-Ala以及用于連接I型人膠原蛋白的谷氨酸和苯丙氨酸，該I型人膠原蛋白-表皮生長因子的氨基酸序列如下I LEKREAGVAG PKGPAGERGS PGPAGPKGSP GEAGRPGEAG LPGAKGLTGS PGSPGPDGKT61 GPPGPAGQDG RPGPPGPPGA RGQAGVMGFP GPKGAAGEPG KAGERGVPGP PGAVGPAGKD121 GEAGAQGPPG PAGPAGERGE QGPAGSPGFQ GLPGPAGPPG EAGKPGEQGV P⑶LGAPGPS181 GARGERGFPG ERGVQGPPGP AGPRGANGAP GNDGAKGDAG APGAPGSQGA PGLQGMPGER241 GAAGLPGPKG DRGDAGPKGA DGSPGKDGVR GLTGPIGPPG PAGAPGDKGE SGPSGPAGPT301 GARGAPGDRG EPGPPGPAGF AGPPGADGQP GAKGEPGDAG AKGDAGPPGP AGPAGPPGPI361 GNVGAPGAKG ARGSAGPPGA TGFPGAAGRV GPPGPSGNAG PPGPPGPAGK EGGKGPRGET421 GPAGRPGEVG PPGPPGPAGE KGSPGADGPA GAPGTPGPQG IAGQRGVVGL PGQRGERGFP481 GLPGPSGEPG KQGPSGASGE RGPPGPMGPP GLAGPPGESG REGAPGAEGS PGRDGSPGAK541 ⑶RGETGPAG PPGAPGAPGA PGPVGPAGKS ⑶RGETGPAG PAGPVGPVGA RGPAGPQGPR601 GDKGETEFKR EANSDSECPL SHDGYCLHDG VCMYIEALDK YACNCVVGYI GERCQYRDLK661 WffELR上述的I型人膠原蛋白和表皮生長因子雙表達(dá)載體的表達(dá)純化方法由下述步驟組成I、基因的犾得從離體的人胎盤中提取總RNA,米用GeneCopoeiaFirst-Strand cDNA synthesisKit試劑盒按說明書的使用方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,獲得cDNA, GeneCopoeia First-Strand cDNAsynthesis Kit試劑盒由西安依科生物技術(shù)有限公司銷售。設(shè)計(jì)I型人膠原蛋白(COLl)基因PCR擴(kuò)增引物，引入限制性酶切位點(diǎn)Xho I ,EcoR I、pPIC9K載體自身a信號肽切割位點(diǎn)序列AAACGAGAAGCT，引物序列為 F: CGCTCGAGAAACGAGAAGCTGGTGTTGCTGGTCCCAR: CGGAATTCTGTCTCACCCTTGTCACCACG采用PCR方法擴(kuò)增獲得I型人膠原蛋白基因25 ii L反應(yīng)體系中含有13. 3 ii L滅菌的二次蒸餾水、2. 5 ii L IOXPCR buffer, 3. 5 ii L 2 m mol/L dNTP Mix,2. 5u L MgCl2,IuL 10 u mol/L Primer F, I u L 10 u mol/L Primer R, 0. 2 u L 0. 5 U/ u L Taq 酶，I u LcDNA 模板；95 °C 5 分鐘，94 V 30 秒，56°C 30 秒，72 V 60 秒，30 個循環(huán)，72 V 10 分鐘，4 V 10分鐘，利用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，獲得I型人膠原蛋白基因，I型人膠原蛋白的PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖2，基因序列如下I CTCGAGMAC GAGAAGCTGG TGTTGCTGGT CCCAAGGGTC CCGCTGGTGA ACGTGGTTCT61 CCTGGCCCTG CTGGCCCCAA AGGATCTCCT GGTGMGCTG GTCGTCCCGG TGAAGCTGGT121 CTGCCTGGTG CCAAGGGTCT GACTGGAAGC CCTGGCAGCC CTGGTCCTGA TGGCAAAACT181 GGCCCCCCTG GTCCCGCCGG TCAAGATGGT CGCCCCGGAC CCCCAGGCCC ACCTGGTGCC241 CGTGGTCAGG CTGGTGTGAT GGGATTCCCT GGACCTAAAG GTGCTGCTGG AGAGCCCGGC301 AAGGCTGGAG AGCGAGGTGT TCCCGGACCC CCTGGCGCTG TCGGTCCTGC TGGCAAAGAT361 GGAGAGGCTG GAGCTCAGGG ACCCCCTGGC CCTGCTGGTC CCGCTGGCGA GAGAGGTGM421 CMGGCCCTG CTGGCTCCCC CGGATTCCAG GGTCTCCCTG GTCCTGCTGG TCCTCCAGGT481 GMGCAGGCA MCCTGGTGA ACAGGGTGTT CCTGGAGACC TTGGCGCCCC TGGCCCCTCT541 GGAGCAAGAG GCGAGAGAGG TTTCCCTGGC GAGCGTGGTG TGCAAGGTCC CCCTGGTCCT601 GCTGGTCCCC GAGGGGCCAA CGGTGCTCCC GGCAACGATG GTGCTAAGGG TGATGCTGGT661 GCCCCTGGAG CTCCCGGTAG CCAGGGCGCC CCTGGCCTTC AGGGMTGCC TGGTGAACGT721 GGTGCAGCTG GTCTTCCAGG GCCTAAGGGT GACAGAGGTG ATGCTGGTCC CAAAGGTGCT781 GATGGCTCTC CTGGCAMGA TGGCGTCCGT GGTCTGACTG GCCCCATTGG TCCTCCTGGC841 CCTGCTGGTG CCCCTGGTGA CAAGGGTGAA AGTGGTCCCA GCGGCCCTGC TGGTCCCACT901 GGAGCTCGTG GTGCCCCCGG AGACCGTGGT GAGCCTGGTC CCCCCGGCCC TGCTGGCTTT961 GCTGGCCCCC CTGGTGCTGA CGGCCMCCT GGTGCTAAAG GCGAACCTGG TGATGCTGGT1021 GCTAAAGGCG ATGCTGGTCC CCCTGGCCCT GCCGGACCCG CTGGACCCCC TGGCCCCATT1081 GGTAATGTTG GTGCTCCTGG AGCCAAAGGT GCTCGCGGCA GCGCTGGTCC CCCTGGTGCT1141 ACTGGTTTCC CTGGTGCTGC TGGCCGAGTC GGTCCTCCTG GCCCCTCTGG AAATGCTGGA1201 CCCCCTGGCC CTCCTGGTCC TGCTGGCAAA GAAGGCGGCA AAGGTCCCCG TGGTGAGACT1261 GGCCCTGCTG GACGTCCTGG TGAAGTTGGT CCCCCTGGTC CCCCTGGCCC TGCTGGCGAG1321 AMGGATCCC CTGGTGCTGA TGGTCCTGCT GGTGCTCCTG GTACTCCCGG GCCTCAAGGT1381 ATTGCTGGAC AGCGTGGTGT GGTCGGCCTG CCTGGTCAGA GAGGAGAGAG AGGCTTCCCT
1441 GGTCTTCCTG GCCCCTCTGG TGAACCTGGC AAACMGGTC CCTCTGGAGC AAGTGGTGM1501 CGTGGTCCCC CTGGTCCCAT GGGCCCCCCT GGATTGGCTG GACCCCCTGG TGAATCTGGA1561 CGTGAGGGGG CTCCTGGTGC CGAAGGTTCC CCTGGACGAG ACGGTTCTCC TGGCGCCAAG1621 GGTGACCGTG GTGAGACCGG CCCCGCTGGA CCCCCTGGTG CTCCTGGTGC TCCTGGTGCC1681 CCTGGCCCCG TTGGCCCTGC TGGCAAGAGT GGTGATCGTG GTGAGACTGG TCCTGCTGGT1741 CCCGCCGGTC CTGTCGGCCC TGTTGGCGCC CGTGGCCCCG CCGGACCCCA AGGCCCCCGT1801 GGTGACAAGG GTGAGACAGA ATTC
根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性，重新設(shè)計(jì)表皮生長因子的核苷酸序列，并由生工生物工程(上海)有限公司全基因合成表皮生長因子，同時添加限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)EcoRI及Not I和pPIC9K載體自身a信號肽切割位點(diǎn)序列AAACGAGAAGCT，表皮生長因子(EGF)核苷酸序列如下I GAATTCAAAC GAGAAGCTAA TTCTGATTCT GAATGTCCTT TGTCCCACGA TGGTTACTGC61 TTGCATGATG GTGTCTGCAT GTATATTGAA GCATTGGATA AGTATGCTTG TAACTGTGTT121 GTTGGCTACA TCGGTGAGAG ATGTCAGTAC AGAGACTTGA AGTGGTGGGA ATTGAGATAA181 GCGGCCGC2、載體pPIC9K與I型人膠原蛋白、表皮生長因子的連接對pPIC9K及I型人膠原蛋白進(jìn)行Xho I和EcoR I雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，用DNA連接酶連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提取質(zhì)粒，命名為PPIC9K-C0L1 ;對pPIC9K-C0Ll質(zhì)粒與表皮生長因子分別進(jìn)行EcoR I及Not I雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，用DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提取質(zhì)粒，命名為PPIC9K-C0L1-EGF。(I)載體pPIC9K及I型人膠原蛋白的雙酶切對pPIC9K及I型人膠原蛋白PCR產(chǎn)物用Xho I和EcoR I內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，pPIC9K購置于Invitrogen公司。雙酶切體系如下
一次蒸if水150 p L
IOXburfer20 P L-
pPIC9K(200ng/pL)20 P L,,
Xho I5 P L
EcoR I5 P- L
總體系200 P L
:次蒸餾水MOyi,
r n IOXbuffer20 P L
CO!,! (laOng/P L)30 P L
Xho I5pL
EcoR I5 p L總體系 )0pL
上述試劑加好后，混勻，37°C水浴消化2小時，用DNA純化試劑盒，按產(chǎn)品說明書，從質(zhì)量百分濃度為I. 5%的瓊脂糖凝膠上回收特異性條帶。(2)載體pPIC9K與I型人膠原蛋白的連接利用T4 DNA連接酶對pPIC9K與COLl進(jìn)行連接，反應(yīng)體系如下
權(quán)利要求
1.一種I型人膠原蛋白和表皮生長因子雙表達(dá)載體，其特征在于插入的外源序列氮端為I型人膠原蛋白的600個氨基酸，碳端為表皮生長因子的53個氨基酸，在I型人膠原蛋白上游添加PPIC9K載體自身a信號肽切割位點(diǎn)和用于連接載體的亮氨酸和谷氨酸，在表皮生長因子上游添加PPIC9K載體自身a信號肽切割位點(diǎn)以及用于連接I型人膠原蛋白的谷氨酸和苯丙氨酸，該I型人膠原蛋白-表皮生長因子的氨基酸序列如下 ILEKREAGVAG PKGPAGERGS PGPAGPKGSP GEAGRPGEAG LPGAKGLTGS PGSPGPDGKT 61GPPGPAGQDG RPGPPGPPGA RGQAGVMGFP GPKGAAGEPG KAGERGVPGP PGAVGPAGKD 121 GEAGAQGPPG PAGPAGERGE QGPAGSPGFQ GLPGPAGPPG EAGKPGEQGV PGDLGAPGPS 181 GARGERGFPG ERGVQGPPGP AGPRGANGAP GNDGAKGDAG APGAPGSQGA PGLQGMPGER 241 GAAGLPGPKG DRGDAGPKGA DGSPGKDGVR GLTGPIGPPG PAGAPGDKGE SGPSGPAGPT 301 GARGAPGDRG EPGPPGPAGF AGPPGADGQP GAKGEPGDAG AKGDAGPPGP AGPAGPPGPI 361 GNVGAPGAKG ARGSAGPPGA TGFPGAAGRV GPPGPSGNAG PPGPPGPAGK EGGKGPRGET 421 GPAGRPGEVG PPGPPGPAGE KGSPGADGPA GAPGTPGPQG IAGQRGVVGL PGQRGERGFP 481 GLPG PSGEPG KQGPSGASGE RGPPGPMGPP GLAGPPGESG REGAPGAEGS PGRDGSPGAK 541 ⑶RGETGPAG PPGAPGAPGA PGPVGPAGKS ⑶RGETGPAG PAGPVGPVGA RGPAGPQGPR 601 GDKGETEFKR EANSDSECPL SHDGYCLHDG VCMYIEALDK YACNCVVGYI GERCQYRDLK 661 WffELR
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的I型人膠原蛋白和表皮生長因子雙表達(dá)載體，其特征在于所述的PPIC9K載體自身a信號肽切割位點(diǎn)氨基酸序列為Lys-Arg-Glu-Ala。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的I型人膠原蛋白和表皮生長因子雙表達(dá)載體，其特征在于所述的表皮生長因子的核苷酸序列為 IAATTCTGATT CTGAATGTCC TTTGTCCCAC GATGGTTACT GCTTGCATGA TGGTGTCTGC 61 ATGTATATTG AAGCATTGGA TAAGTATGCT TGTAACTGTG TTGTTGGCTA CATCGGTGAG 121 AGATGTCAGT ACAGAGACTT GAAGTGGTGG GAATTGAGAT AA
4.一種權(quán)利要求I所述的I型人膠原蛋白和表皮生長因子雙表達(dá)載體的表達(dá)純化方法，其特征在于它包括下述步驟 (I)基因的獲得 從離體的人胎盤中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，設(shè)計(jì)I型人膠原蛋白基因PCR擴(kuò)增引物，引入限制性酶切位點(diǎn)Xho I , EcoR I和PPIC9K載體自身a信號肽切割位點(diǎn)序列AAACGAGAAGCT，引物序列為F: CGCTCGAGAAACGAGAAGCTGGTGTTGCTGGTCCCAR: CGGAATTCTGTCTCACCCTTGTCACCACG采用PCR方法擴(kuò)增獲得I型人膠原蛋白基因； 重新設(shè)計(jì)并合成表皮生長因子的核苷酸序列，添加限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)EcoR I及Not I和pPIC9K載體自身a信號肽切割位點(diǎn)序列AAACGAGAAGCT，表皮生長因子的核苷酸序列如下 IGAATTCMAC GAGAAGCTAA TTCTGATTCT GAATGTCCTT TGTCCCACGA TGGTTACTGC 、 61TTGCATGATG GTGTCTGCAT GTATATTGM GCATTGGATA AGTATGCTTG TMCTGTGTT 、 121 GTTGGCTACA TCGGTGAGAG ATGTCAGTAC AGAGACTTGA AGTGGTGGGA ATTGAGATAA、181GCGGCCGC (2)載體pPIC9K與I型人膠原蛋白、表皮生長因子的連接 對PPIC9K及I型人膠原蛋白進(jìn)行Xho I和EcoR I雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，用DNA連接酶連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提取質(zhì)粒，命名為PPIC9K-C0L1 ;對pPIC9K-C0Ll質(zhì)粒與表皮生長因子分別進(jìn)行EcoR I及Not I雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，用DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提取質(zhì)粒，命名為PPIC9K-C0L1-EGF ； 該重組DNA序列如下 ICTCGAGAMC GAGAAGCTGG TGTTGCTGGT CCCAAGGGTC CCGCTGGTGA ACGTGGTTCT 61CCTGGCCCTG CTGGCCCCAA AGGATCTCCT GGTGMGCTG GTCGTCCCGG TGAAGCTGGT121CTGCCTGGTG CCAAGGGTCT GACTGGMGC CCTGGCAGCC CTGGTCCTGA TGGCMAACT 181GGCCCCCCTG GTCCCGCCGG TCAAGATGGT CGCCCCGGAC CCCCAGGCCC ACCTGGTGCC 241CGTGGTCAGG CTGGTGTGAT GGGATTCCCT GGACCTAAAG GTGCTGCTGG AGAGCCCGGC 301AAGGCTGGAG AGCGAGGTGT TCCCGGACCC CCTGGCGCTG TCGGTCCTGC TGGCAAAGAT 361GGAGAGGCTG GAGCTCAGGG ACCCCCTGGC CCTGCTGGTC CCGCTGGCGA GAGAGGTGAA 421CAAGGCCCTG CTGGCTCCCC CGGATTCCAG GGTCTCCCTG GTCCTGCTGG TCCTCCAGGT 481GAAGCAGGCA AACCTGGTGA ACAGGGTGTT CCTGGAGACC TTGGCGCCCC TGGCCCCTCT 541GGAGCAAGAG GCGAGAGAGG TTTCCCTGGC GAGCGTGGTG TGCAAGGTCC CCCTGGTCCT 601GCTGGTCCCC GAGGGGCCAA CGGTGCTCCC GGCAACGATG GTGCTAAGGG TGATGCTGGT 661GCCCCTGGAG CTCCCGGTAG CCAGGGCGCC CCTGGCCTTC AGGGAATGCC TGGTGAACGT 721GGTGCAGCTG GTCTTCCAGG GCCTAAGGGT GACAGAGGTG ATGCTGGTCC CMAGGTGCT 781GATGGCTCTC CTGGCMAGA TGGCGTCCGT GGTCTGACTG GCCCCATTGG TCCTCCTGGC 841CCTGCTGGTG CCCCTGGTGA CAAGGGTGAA AGTGGTCCCA GCGGCCCTGC TGGTCCCACT 901GGAGCTCGTG GTGCCCCCGG AGACCGTGGT GAGCCTGGTC CCCCCGGCCC TGCTGGCTTT 961GCTGGCCCCC CTGGTGCTGA CGGCCAACCT GGTGCTMAG GCGAACCTGG TGATGCTGGT1021GCTAAAGGCG ATGCTGGTCC CCCTGGCCCT GCCGGACCCG CTGGACCCCC TGGCCCCATT1081GGTAATGTTG GTGCTCCTGG AGCCMAGGT GCTCGC GGCA GCGCTGGTCC CCCTGGTGCT1141ACTGGTTTCC CTGGTGCTGC TGGCCGAGTC GGTCCTCCTG GCCCCTCTGG AAATGCTGGA1201CCCCCTGGCC CTCCTGGTCC TGCTGGCAAA GAAGGCGGCA AAGGTCCCCG TGGTGAGACT1261GGCCCTGCTG GACGTCCTGG TGAAGTTGGT CCCCCTGGTC CCCCTGGCCC TGCTGGCGAG1321AAAGGATCCC CTGGTGCTGA TGGTCCTGCT GGTGCTCCTG GTACTCCCGG GCCTCAAGGT1381ATTGCTGGAC AGCGTGGTGT GGTCGGCCTG CCTGGTCAGA GAGGAGAGAG AGGCTTCCCT1441GGTCTTCCTG GCCCCTCTGG TGAACCTGGC AAACAAGGTC CCTCTGGAGC AAGTGGTGAA1501CGTGGTCCCC CTGGTCCCAT GGGCCCCCCT GGATTGGCTG GACCCCCTGG TGAATCTGGA1561CGTGAGGGGG CTCCTGGTGC CGAAGGTTCC CCTGGACGAG ACGGTTCTCC TGGCGCCAAG1621GGTGACCGTG GTGAGACCGG CCCCGCTGGA CCCCCTGGTG CTCCTGGTGC TCCTGGTGCC 1681CCTGGCCCCG TTGGCCCTGC TGGCMGAGT GGTGATCGTG GTGAGACTGG TCCTGCTGGT 1741CCCGCCGGTC CTGTCGGCCC TGTTGGCGCC CGTGGCCCCG CCGGACCCCA AGGCCCCCGT 1801GGTGACMGG GTGAGACAGA ATTCAMCGA GAAGCTAATT CTGATTCTGA ATGTCCTTTG 1861TCCCACGATG GTTACTGCTT GCATGATGGT GTCTGCATGT ATATTGAAGC ATTGGATMG. 1921 TATGCTTGTA ACTGTGTTGT TGGCTACATC GGTGAGAGAT GTCAGTACAG AGACTTGAAG .1981 TGGTGGGAAT TGAGATAAGC GGCCGC (3)畢赤酵母電轉(zhuǎn)化 將10 ii g經(jīng)Sal I內(nèi)切酶線性化的PPIC9K-COL1-EGF質(zhì)粒，與80 y L畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞混勻，轉(zhuǎn)至0. 2cm冰預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中，電擊4 10毫秒，加入ImL冰預(yù)冷的lmol/L的山梨醇溶液將菌體混勻，涂布MD培養(yǎng)基平板，30 1倒置培養(yǎng)2 3天，在MD培養(yǎng)基平板上長出菌落； (4)多拷貝插入重組子的篩選將MD培養(yǎng)基平板上長出的菌落用無菌牙簽對應(yīng)接種到G418濃度分別為0. 5g/L、lg/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L的YPD平板上，30°C培養(yǎng)，篩選獲得轉(zhuǎn)化子；(5)I型人膠原蛋白-表皮生長因子的發(fā)酵表達(dá) 將篩選到的轉(zhuǎn)化子接種于400ml BMGY培養(yǎng)基中，30 1振蕩培養(yǎng)24小時，作為一級種子轉(zhuǎn)接于裝有4L FBS培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，溫度設(shè)定為30 °C，pH值為5.0，培養(yǎng)16 .20小時，作為二級種子轉(zhuǎn)接入裝有FBS培養(yǎng)基的150L大罐發(fā)酵，生長溫度30°C，誘導(dǎo)溫度.29°C, pH值為5. 5，溶氧控制在20% 30%，流加質(zhì)量濃度為75%的含12 mL/L PTMl微量元素的甲醇水溶液，F(xiàn)BS培養(yǎng)基與質(zhì)量濃度為75%的含12 mL/L PTMl微量元素的甲醇水溶液的體積比為1:0. 25,誘導(dǎo)發(fā)酵36 42小時,在發(fā)酵分泌表達(dá)出胞外的過程中，切割a信號肽切割位點(diǎn)，切割出I型人膠原蛋白、表皮生長因子兩種蛋白； (6)I型人膠原蛋白和表皮生長因子的純化 發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液離心分離，取上清液，用孔徑為0. I y m中空纖維微濾系統(tǒng)進(jìn)行微濾，收集濾過液，用分子量為1000D的卷式超濾膜超濾，收集濃縮液，獲得表皮生長因子與I型人膠原蛋白混合濃縮液，用分子篩層析分離，分別收集表皮生長因子與I型人膠原蛋白，獲得表皮生長因子粗蛋白液及I型人膠原蛋白粗蛋白液；表皮生長因子粗蛋白液用陰離子交換層析，獲得表皮生長因子；I型人膠原蛋白粗蛋白液，用陽離子交換層析，獲得I型人膠原蛋白。
全文摘要
一種Ⅰ型人膠原蛋白和表皮生長因子雙表達(dá)載體，N-端為Ⅰ型人膠原蛋白編碼序列，C-端為人表皮生長因子編碼序列，兩段肽段之間用α信號肽切割位點(diǎn)Lys-Arg-Glu-Ala連接，建立人表皮生長因子和膠原蛋白雙表達(dá)體系。表達(dá)純化方法包括基因的獲得、載體pPIC9K與Ⅰ型人膠原蛋白和表皮生長因子的連接、畢赤酵母電轉(zhuǎn)化、多拷貝插入重組子的篩選、Ⅰ型人膠原蛋白-表皮生長因子的發(fā)酵表達(dá)、Ⅰ型人膠原蛋白和表皮生長因子的純化步驟。本發(fā)明利用膠原蛋白在畢赤酵母的高表達(dá)特性，引導(dǎo)融合人表皮生長因子的高表達(dá)，在蛋白酶作用下，切割成兩個獨(dú)立的單體蛋白，通過純化，獲得基因重組人表皮生長因子及Ⅰ型人膠原蛋白。
文檔編號C07K1/36GK102747097SQ201210139088
公開日2012年10月24日 申請日期2012年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月7日
發(fā)明者侯增淼, 李哲, 趙真虎, 趙金禮, 高恩 申請人:陜西東大生化科技有限責(zé)任公司