專(zhuān)利名稱(chēng)：一種竹葉黃酮分子印跡固相萃取柱、制備及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物分離技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是涉及竹葉提取液中黃酮類(lèi)物質(zhì)的高選擇性分離、純化和富集的竹葉黃酮 分子印跡固相萃取柱的制備方法。
背景技術(shù)：
在藥物分離中，樣品的前處理過(guò)程至關(guān)重要。柱色譜分離是一種較為常用的樣品前處理技術(shù)。固相萃取(Solid Phase Extraction, SPE)由液固萃取和柱液相色譜技術(shù)結(jié)合發(fā)展而來(lái)，與液-液萃取法(Liquid-Liquid Extraction, HE)相比，SPE具有回收率高、分離效果好，操作簡(jiǎn)單、省時(shí)、省力等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于樣品的前處理。目前SPE柱填料種類(lèi)正相、反相及離子交換柱和吸附樹(shù)脂柱。正相SPE柱填料主要為硅膠、氧化鋁和硅鎂吸附劑等。反相SPE柱填料主要為C18鍵合硅膠、氰基鍵合硅膠柱(CN)等。這些柱填料通過(guò)吸附目標(biāo)物，使產(chǎn)生干擾的共提物被淋洗移除，達(dá)到凈化、富集的目的；或?qū)㈦s質(zhì)留在柱上，待測(cè)的目標(biāo)物通過(guò)SPE柱，樣品被凈化，但不能富集待測(cè)組分，也不能分離保留性質(zhì)比待測(cè)組分更弱的雜質(zhì)，造成凈化不完全。分子印跡固相萃取(Molecularlyimprinted solid-phase extraction, MIPSE)是利用MIP選擇吸附機(jī)理制備SPE填料，不僅可以提高SPE凈化效果，實(shí)現(xiàn)低濃度的藥物的分離富集，同時(shí)可以實(shí)現(xiàn)SPE柱的多次重復(fù)使用，從而降低成本。竹葉黃酮是從竹葉中提取出的一類(lèi)天然產(chǎn)物，具有抗氧化、抗衰老等作用，是新興的功能性食品添加劑和天然藥物。竹葉黃酮以炭苷黃酮為主，葒草苷、異葒草苷、牡荊苷和異特荊苷是竹葉黃酮的主要成分。目前市場(chǎng)上的竹葉黃酮產(chǎn)品主要為粗制品，上述4種黃酮的總含量一般在10%以?xún)?nèi)，難以滿(mǎn)足市場(chǎng)對(duì)高含量竹葉黃酮產(chǎn)品的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)室分離、富集竹葉黃酮方法的缺點(diǎn)和不足，提供一種竹葉黃酮分子印跡固相萃取柱、制備及應(yīng)用方法，使其能夠快速簡(jiǎn)單的分離純化竹葉提取液中的竹葉黃酮，可直接應(yīng)用于竹葉黃酮的特異性選擇分離、高效富集。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的竹葉黃酮分子印跡固相萃取柱的制備方法，包括以下步驟⑴制備質(zhì)量濃度為3%_3. 5%的分散劑水溶液；將功能單體4-乙烯基吡啶和模板分子木犀草素溶解在分散劑水溶液中；將交聯(lián)劑二甲基丙烯酸乙二醇酯、引發(fā)劑偶氮二異丁腈分別溶解于有機(jī)溶劑中，然后和上述分散劑水溶液混合；并進(jìn)行超聲脫氣；在70-75°C下攪拌，在通氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行聚合反應(yīng)10_24h，生成分子印跡聚合物顆粒；所述的模板分子木犀草素、4-乙烯基吡啶、二甲基丙烯酸乙二醇酯的摩爾比為I (5-6) 80，二甲基丙烯酸乙二醇酯、有機(jī)溶劑、分散劑溶液的體積比為I : 2-3 20-30。偶氮二異丁腈是本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)，只要加入少量引發(fā)即可。⑵反應(yīng)結(jié)束后，離心過(guò)濾，分離出聚合物顆粒；再將分離出的聚合物顆粒用水反復(fù)洗滌，再用甲醇、丙酮洗滌多次；最后通過(guò)索氏提取進(jìn)一步除去聚合物顆粒中的模板分子木犀草素，直至檢測(cè)不出模板分子，然后真空干燥；⑶將⑵所制得的聚合物顆粒填充于聚丙烯或玻璃色譜柱管內(nèi)，管的兩端分別裝上篩板，即制得固相萃取柱。所述的分散劑水溶液為羧乙基纖維素水溶液；所述的篩板為聚乙烯篩板，其孔徑為20i!m。所述的超聲脫氣時(shí)間為10-20min ;所述的攪拌轉(zhuǎn)速為600_700rpm。所述的水為超純水。所述聚合物顆粒真空干燥，溫度為60°C，干燥時(shí)間為6 8h。 本發(fā)明制備的竹葉黃酮分子印跡固相萃取柱，應(yīng)用于竹葉提取液中竹葉黃酮的分離、純化和富集，具體步驟如下⑴裝填竹葉黃酮分子印跡固相萃取柱后，先用乙腈活化，再用質(zhì)量濃度5-15%甲醇水溶液淋洗，⑵加入樣品提取液或樣品溶液；⑶用15-15%甲醇水溶液淋洗；⑷用甲醇洗脫2次，收集洗脫液，用0. 45 y m濾膜過(guò)濾后，進(jìn)行收集。上述優(yōu)選甲醇水溶液濃度10% ;本發(fā)明制備的竹葉黃酮分子印跡聚合物顆粒是一種具有固定空穴大小、形狀和確定排列功能基團(tuán)的高分子交聯(lián)聚合物，對(duì)竹葉黃酮的立體結(jié)構(gòu)具有動(dòng)態(tài)記憶功能。本發(fā)明可應(yīng)用于竹葉提取液中竹葉黃酮的分離、富集和純化，較普通的液-液萃取法、C18固相萃取法更為簡(jiǎn)單、快速、更為高效。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明內(nèi)容，但本發(fā)明并不限制于如下實(shí)施例的范圍。實(shí)例I.竹葉黃酮分子印跡聚合物顆粒固相萃取柱(模板分子與功能單體摩爾比為 I : 5)⑴配制濃度為3%_3. 5%的羧乙基纖維素溶液；將2. 5mmol功能單體4_乙烯基吡啶(4-vp)、0. 5mmol模板分子木犀草素和5mmol的乙酸鋅溶解在甲醇中，超聲作用30min ;將7. 5mL的交聯(lián)劑二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)、0. 2g引發(fā)劑(AIBN)和7. 5mL的二甲苯混合；超聲作用20min ;將上述三種溶液混合超聲脫氣IOmin ;在70°C恒溫650rpm攪拌10h。⑵將上述制備的分子印跡聚合物顆粒離心過(guò)濾，然后用超純水洗滌5次，再用甲醇抽濾洗滌5次，最后通過(guò)索氏提取進(jìn)一步除去模板分子。⑶將除去模板分子的聚合物，真空干燥(60°C )，得到竹葉黃酮分子印跡聚合物顆粒。⑷將所制得的聚合物顆粒填充于聚丙烯或玻璃色譜柱管內(nèi)，管的兩端分別裝上篩板，即制得固相萃取柱。實(shí)例2.竹葉黃酮分子印跡聚合物顆粒固相萃取柱(模板分子與功能單體摩爾比為 I : 8)⑴配制濃度為3%-3. 5%的羧乙基纖維素溶液；將4. Ommol功能單體4_乙烯基吡啶(4-vp)、0. 5mmol模板分子木犀草素和5mmol的乙酸鋅溶解在甲醇中，超聲作用30min ;將7. 5mL的交聯(lián)劑二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)、0. 2g引發(fā)劑(AIBN)和7. 5mL的二甲苯混合；超聲作用20min ;將上述三種溶液混合超聲脫氣IOmin ;在70°C恒溫650rpm攪拌10h。⑵將上述制備的分子印跡聚合物顆粒離心過(guò)濾，然后用超純水洗滌5次，再用甲醇抽濾洗滌5次，最后通過(guò)索氏提取進(jìn)一步除去模板分子。⑶將除去模板分子的聚合物，真空干燥(60°C )，得到竹葉黃酮分子印跡聚合物顆粒。⑷將所制得的聚合物顆粒填充于聚丙烯或玻璃色譜柱管內(nèi)，管的兩端分別裝上篩板，即制得固相萃取柱。實(shí)例3.竹葉黃酮分子印跡固相萃取柱的制備與性能評(píng)價(jià)
⑴用3mL聚丙烯固相萃取小柱空管作為固相萃取小柱,在固相萃取柱的底部放置一層20 ii m的聚乙烯篩板，準(zhǔn)確稱(chēng)取200mg實(shí)施例I或2的分子印跡聚合物，干法裝填入小柱中，輕輕敲打壓實(shí)上面再加入一層篩板，即得竹葉黃酮分子印跡固相萃取小柱。⑵用2mL乙腈潤(rùn)洗柱子，并保持2min，除去殘留的液體，保持濕潤(rùn)，上樣前勿讓淋洗劑流干；⑶上樣。取IOmL竹葉提取液，加入分子印跡固相萃取柱中。提取液中含有木犀草素、葒草苷、異葒草苷、牡荊苷、槲皮素和異牡荊苷標(biāo)準(zhǔn)品。⑷淋洗，5mL10%甲醇淋洗,流速<2mL/min。(5)洗脫，加入IOmL甲醇，抽真空洗脫，收集洗脫液,用0. 45 U m濾膜過(guò)濾后，HPLC分析。本發(fā)明效果為，該固相萃取柱吸附竹葉黃酮效果較好，在添加濃度為10mg/L時(shí)，6種竹葉黃酮的的回收率在80%-120%之間，RSD在3%-5%之間。實(shí)例4.分子印跡固相萃取小柱應(yīng)用于竹葉黃酮的分離、純化⑴稱(chēng)取IOg市售竹葉黃酮粉樣品，用10%乙醇溶解、稀釋100倍，過(guò)濾或離心，得到竹葉黃酮樣品溶液。⑵稱(chēng)取500mg制備的竹葉黃酮分子印跡聚合物，按照實(shí)例2方法裝填固相萃取柱。⑶在裝填的固相萃取柱中加入2mL乙腈活化，再用2mL10%甲醇淋洗。⑷移取50mL步驟中⑴制備的竹葉黃酮樣品溶液，加入已活化的固相萃取柱中；待樣品溶液完全淋下后，用5mL10%甲醇淋洗，棄去淋洗液；再用5mL甲醇洗脫2次。(5)將收集的洗脫液于45°C下減壓濃縮，得到分離的竹葉黃酮樣品，經(jīng)HPLC檢測(cè)，所得竹葉黃酮樣品中總黃酮含量為86. 20%。
權(quán)利要求
1.一種竹葉黃酮分子印跡固相萃取柱的制備方法，包括以下步驟 ⑴制備質(zhì)量濃度為3%-3. 5%的分散劑水溶液；將功能單體4-乙烯基吡啶和模板分子木犀草素溶解在分散劑水溶液中；將交聯(lián)劑二甲基丙烯酸乙二醇酯、引發(fā)劑偶氮二異丁腈分別溶解于有機(jī)溶劑中，然后和上述分散劑水溶液混合；并進(jìn)行超聲脫氣；在70-75°C下攪拌，在通氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行聚合反應(yīng)10_24h，生成分子印跡聚合物顆粒； 所述的模板分子木犀草素、4-乙烯基吡啶、二甲基丙烯酸乙二醇酯的摩爾比為I :(5-6) 80，二甲基丙烯酸乙二醇酯、有機(jī)溶劑、分散劑溶液的體積比為I : (2-3): (20 —30)； ⑵反應(yīng)結(jié)束后，離心過(guò)濾，分離出聚合物顆粒；再將分離出的聚合物顆粒用水反復(fù)洗滌，再用甲醇、丙酮洗滌多次；最后通過(guò)索氏提取進(jìn)一步除去聚合物顆粒中的模板分子木犀草素，直至檢測(cè)不出模板分子，然后真空干燥； (3)將(2)所制得的聚合物顆粒填充于聚丙烯或玻璃色譜柱管內(nèi)，管的兩端分別裝上篩板，即制得固相萃取柱。
2.按照權(quán)利要求I的方法，其特征在于，所述的分散劑水溶液為羧乙基纖維素水溶液。
3.按照權(quán)利要求I的方法，其特征在于，所述的篩板為聚乙烯篩板，其孔徑為20i!m。
4.按照權(quán)利要求I的方法，其特征在于，所述的超聲脫氣時(shí)間為10-20min;所述的攪拌轉(zhuǎn)速為 600-700rpm。
5.按照權(quán)利要求I的方法，其特征在于，所用的水為超純水。
6.按照權(quán)利要求I的方法，其特征在于，所述聚合物顆粒真空干燥，溫度為60°C，干燥時(shí)間為6-8h。
7.按照權(quán)利要求1-6的任一方法制備的竹葉黃酮分子印跡固相萃取柱。
8.權(quán)利要求7的竹葉黃酮分子印跡固相萃取柱，應(yīng)用于竹葉提取液中竹葉黃酮的分離、純化和富集，具體步驟如下 ⑴裝填竹葉黃酮分子印跡固相萃取柱后，先用乙腈活化，再用質(zhì)量濃度5-15%甲醇水溶液淋洗； ⑵加入樣品提取液或樣品溶液； ⑶用15-15%甲醇水溶液淋洗； ⑷用甲醇洗脫2次，收集洗脫液，用0. 45 y m濾膜過(guò)濾后，進(jìn)行收集。
9.按照權(quán)利要求8的應(yīng)用，其特征在于，甲醇水溶液濃度10%。
全文摘要
一種竹葉黃酮分子印跡固相萃取柱、制備及其應(yīng)用，屬于藥物分離技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明將模板分子木犀草素、功能單體4-乙基吡啶和交聯(lián)劑二甲基丙烯酸乙二醇酯，按模板分子∶功能單體∶交聯(lián)劑摩爾比為1∶(5-8)∶80，通過(guò)懸浮聚合而成竹葉黃酮分子印跡聚合物顆粒。將制備的竹葉黃酮分子印跡聚合物顆粒，填充于聚丙烯或玻璃固相萃取柱空管內(nèi)，制得竹葉黃酮分子印跡固相萃取柱。本發(fā)明制得的竹葉黃酮固相萃取柱用于竹葉黃酮提取液的選擇性富集和純化，具有簡(jiǎn)單、快速、回收率高等特點(diǎn)，在天然黃酮類(lèi)化合物分離領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)C07D311/30GK102671639SQ20121016449
公開(kāi)日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月24日
發(fā)明者姚曦, 孫嘏, 岳永德, 湯鋒, 王光勇, 王進(jìn), 郭雪峰 申請(qǐng)人:國(guó)際竹藤中心