專利名稱：使用固相和液相組合技術(shù)制備普蘭林肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多肽藥物合成技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種固相和液相組合技術(shù)制備普蘭林肽的方法。
背景技術(shù)：
普蘭林肽(Pramlitide,結(jié)構(gòu)見式1,2-7 ; 二硫鍵)是一種人工合成的胰淀素(Amylin，淀粉不溶素)類似物，其結(jié)構(gòu)特征為胰淀素第25位(丙氨酸)、第28位(絲氨酸)和第29位(絲氨酸)的氨基酸分別用脯氨酸替代。它充分保留了內(nèi)源性胰淀 素的生理作用，克服了人胰淀素在溶液中不穩(wěn)定、易水解、易凝集的物理特性。臨床研究表明，普蘭林肽可抑制胰高糖素的釋放，延緩胃排空及抑制攝食；與胰島素聯(lián)合應(yīng)用，能有效地控制血糖、減輕體重、減少胰島素用量。普蘭林肽最早由美國Amylin Pharmaceuticals公司研制,于2005年3月16號(hào)獲得美國FDA批準(zhǔn)，適用于使用胰島素但無法達(dá)到預(yù)期療效的I型和II型糖
尿病患者的輔助治療。
1 I5 I101520
H-Lys-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Ala-Thr-Glo-Arg-Ley-AIa-Asn-Fhe-Ieu-Val-His-Ser-Ser-
25303Sρ,
Asn-Asn Phe-G1y-Pro-lfe-Leu-Pro Pro*Thr-Asn V3l Gly*Ser Asii-Thr-Tyr-NH2
式⑴已知普蘭林肽的合成可以通過固相合成法(W0-A-93/10146，US-A-5424394，CN102206266A, CN101747426A)，將C端酪氨酸的羧基以共價(jià)鍵的形式固定在不溶性樹脂上，再以此氨基酸的氨基為起點(diǎn)，依次縮合氨基酸，延長(zhǎng)肽鏈，在樹脂上完成肽鏈的合成后，氧化第2位和第7位半胱氨酸的巰基形成分子內(nèi)二硫鍵，再將該肽鏈從樹脂上切割下來并脫除側(cè)鏈保護(hù)基，最終制備得到普蘭林肽。很顯然，對(duì)于含有37個(gè)氨基酸的普蘭林肽來說，這一合成途徑需要重復(fù)幾十步偶聯(lián)和脫保護(hù)步驟，合成路線冗長(zhǎng)，操作工藝繁瑣；且隨著肽鏈的延長(zhǎng)和可能存在的二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，縮合效率越來越差，導(dǎo)致雜質(zhì)變多且難以分離，目標(biāo)產(chǎn)物收率極低,成本很高,不適合工業(yè)化生產(chǎn)。使用固相和液相結(jié)合的片段縮合技術(shù)，適合于合成含有較長(zhǎng)氨基酸序列的多肽，其優(yōu)點(diǎn)在于副產(chǎn)物較少且易于純化，產(chǎn)物純度高。然而，片段縮合策略有時(shí)會(huì)受阻于(i)有增加消旋的危險(xiǎn)；(ii)大的保護(hù)片段溶解度差；(iii)片段間的低縮合率并伴有副反應(yīng)發(fā)生的危險(xiǎn)。為了消除或減少消旋，一般選擇Gly或Ρι·ο作為片段的C端殘基，如果不能實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，則選擇Ala或Arg作為C端殘基，因?yàn)樗鼈儾灰紫?。在?yīng)用片段縮合策略時(shí)，對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行合理的分段可以大大改善結(jié)果。除了合理選擇C端殘基，盡量減少消旋的風(fēng)險(xiǎn)，還應(yīng)考慮在固相上合成的片段的純度要高，溶解性要好；參與縮合的片段的C端和N端殘基的空間位阻要小，以提高片段間的縮合率。普蘭林肽由37個(gè)氨基酸殘基組成，因而存在許多種可能的片段和縮合順序，例如CN101824086A 采用 1-8 (片段 1),9-19 (片段 2)，20_28 (片段 3)，29_37 (片段 4)四個(gè)片段，以(4+ (3+2))+1的順序縮合的方法；CN102164608A (同族專利US2010/0081788A1)報(bào)道的方法與之類似，采用1-8 (片段1)，9-19 (片段2)，20-29 (片段3)，30_37 (片段4)四個(gè)片段，從C端到N端((4+3)+2)+1順序依次縮合；CN101790535A(同族專利W02009/00366A1)報(bào)道了采用1-12 (片段1)，13-24 (片段2)，25-37 (片段3)三個(gè)片段從C端到N端順序縮合的方法；CN102180943A則采用1-16 (片段1)，17_28 (片段2)，29_37 (片段3)三個(gè)片段從C端到N端依次縮合的方法。以上片段縮合合成策略中，前兩種方法中第19位Ser (C端)和第20位Ser (N端)以及第四種方法中第16位Leu (C端)和第17位Val (N端)均不是理想的斷點(diǎn)，因?yàn)樵趯?shí)際操作中這些片段間的縮合效率不高；第三種方法雖然斷點(diǎn)選擇較為合適，但片段3在固相合成上純度不佳，將影響片段縮合反應(yīng)效率。鑒于普蘭林肽重要的藥學(xué)應(yīng)用價(jià)值，有必要提供更有效的普蘭林肽合成方案，能 夠克服以上方法的缺陷并適合工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種新的普蘭林肽的制備方法，該方法能夠克服現(xiàn)有制備方法的不足與缺陷，并適合工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明中普蘭林肽的制備方法，采用的是固相合成片段和片段液相縮合的組合技術(shù)。首先利用固相化學(xué)在樹脂載體上合成普蘭林肽的4個(gè)側(cè)鏈保護(hù)的中間體片段肽片段a(1-12)，片段b (13-20)，片段c (21-28)，片段d (29-37)，然后在液相中將側(cè)鏈保護(hù)的中間體片段肽縮合，最后脫除氨基端及側(cè)鏈保護(hù)基得到普蘭林肽。本方法中選擇了適宜的4個(gè)片段肽，通過常規(guī)固相合成法均可以高效率、高產(chǎn)率、高純度的獲得各個(gè)片段肽；各個(gè)片段肽在液相縮合體系中溶解度高，且參與縮合的片段的C端和N端空間位阻小，縮合產(chǎn)率高，產(chǎn)物易于純化。具體而言，本發(fā)明提供的普蘭林肽制備方法，包括以下步驟(I) 利用固相化學(xué)方法，以氨基樹脂為載體，合成偵U鏈保護(hù)的肽中間體片段a =AA29-AA37-氨基樹脂，片段a的實(shí)例
2937
Fr ioc-Pro-Thr(P)-Asn{Tft)-Vaf-Gly-Ser{lBu)-Asn(Trl)-Thf(tBuI-Tyr(IBυ)- Μ· 脂;氨基樹脂的實(shí)例為9-FmoC-氨基咕噸_3_氧基聚苯乙烯樹脂[9-Fmoc-Aminoxanthen -3 - yloxy -polystyrene (Sieber Amide 樹月旨)]或9-Fmoc-氨基咕噸-3-氧基乙酸甲基樹脂(9-Fmoc-Aminoxanthen-3-yloxy-acetamidomethylResin)。(2)利用固相化學(xué)方法，以三苯甲基樹脂為載體，合成側(cè)鏈保護(hù)的肽中間體片段b :AA21-AA28-二苯甲基樹脂,片段b的實(shí)例21 28 (
Fmoc- Asr (Tr{)-Asii{Trl)-Phe-Gly-Pro-|}e-Leu-Pro·:.木111 —. 樹胎(3)利用固相化學(xué)方法，以三苯甲基樹脂為載體，合成側(cè)鏈保護(hù)的肽中間體片段c :AA13-AA2(I-二苯甲基樹脂,片段c的實(shí)例
1320
Fnioc-Aia-Asn(Trt)-Phe-Leu-VaI-Hisdrt}-Ser(fBuI-Ser(P)-: -: $ Φ MWlM(4)利用固相化學(xué)方法，以三苯甲基樹脂為載體，合成側(cè)鏈保護(hù)的肽中間體，然后形成2，7 二硫橋鍵，得到肽中間體片段d =AA1-AA12-三苯甲基樹脂，片段d的實(shí)例
1 [...........................................................................................................................I12 .…
K-LystBoc}-Cys-Asn(Trt|-T{ir(P}-Aia-Thr(P)-Cys-Aia-Thr(tBu}-Gin(TrtJ-Arg(Pbf)-Leu-￡ $ 中'M; iNf 脂片段a、c、d中P表示偽脯氨酸保護(hù)基(ΨΜε’ Me Pro)或tBu保護(hù)基，優(yōu)選偽脯氨酸保護(hù)基(ΨΜε’ Me Pro);片段d中的K表示Fmoc保護(hù)基或者Boc保護(hù)基，優(yōu)選Boc保護(hù)基。合成2，7 二硫橋鍵的環(huán)化試劑的實(shí)例是用I2，溶劑為DMF，環(huán)化時(shí)間為l_4h，環(huán)化溫度為15-25°C。步驟⑵、⑶、⑷中的三苯甲基樹脂實(shí)例為2-氯-三苯甲基氯樹脂(CTC樹脂)，氯化三苯甲基樹脂，4-甲基氯化三苯甲基樹脂或4-甲氧基氯化三苯甲基樹脂。片段合成采用常規(guī)固相合成肽的方法(SPPS)。例如，步驟(1)-(4)中可以采用在樹脂上依肽序逐步偶聯(lián)保護(hù)氨基酸，偶聯(lián)體系為DIEA與H0Bt，H0At或Cl-HOBt中的任意一個(gè)或一個(gè)以上的組合與HBTU，HATU, PyBOP或PyAOP中的任意一個(gè)或一個(gè)以上的組合組成的偶聯(lián)體系。(5)將側(cè)鏈保護(hù)的肽中間體片段a、b、C、d從樹脂上裂解下來，在溶液中進(jìn)行縮合反應(yīng)，得到側(cè)鏈保護(hù)肽(d-c-b-a)；液相縮合的方法可以參考Shumpei Sakakibara的文獻(xiàn)Chemical Synthesis ofProteins in Solution (Biopolymers(Peptide Science),. 1999; 51(4) : 279-296),例如所用的溶劑可以為NMP或DMF，偶聯(lián)體系為DCC與HOBt，HOAt或Cl-HOBt中的任意一個(gè)或一個(gè)以上的組合，或者DIEA與H0Bt，H0At或Cl-HOBt中的任意一個(gè)或一個(gè)以上的組合與HBTU, HATU, PyBOP或PyAOP中的任意一個(gè)或一個(gè)以上的組合組成的縮合體系。(6)脫除側(cè)鏈保護(hù)肽(d-c-b-a)的氨基端保護(hù)基和側(cè)鏈保護(hù)基，得到普蘭林肽粗肽；(7)經(jīng)純化后得到普蘭林肽。本發(fā)明中所使用的術(shù)語“偽脯氨酸(Pseudoprolines)”是指脯氨酰環(huán)中CyH2基被氧或硫原子所取代的脯氨酸類似物(CN101472939A)。偽脯氨酸是絲氨酸、蘇氨酸和半胱氨酸與醛或者酮環(huán)化縮合而成。本發(fā)明實(shí)施例中用到的絲氨酸和蘇氨酸的偽脯氨酸二肽結(jié)構(gòu)如下
權(quán)利要求
1.一種利用固相和液相組合技術(shù)制備普蘭林肽的方法，普蘭林肽結(jié)構(gòu)式如式I所示，
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，步驟(I)中所用的氨基樹脂為9-Fmoc-氨基咕噸-3-氧基聚苯乙烯樹脂[9-Fmoc-Aminoxanthen-3-yloxy-polystyrene (Sieber Amide樹脂)]或9-Fmoc-氨基咕噸-3-氧基乙酸甲基樹脂(9-Fmoc-Aminoxanthen-3-yloxy_acetamidomethyl Resin),優(yōu)選 Sieber Amide 樹月旨。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，步驟(2)-(4)中所用的三苯甲基樹脂為2-氯-三苯甲基氯樹脂(CTC樹脂)，氯化三苯甲基樹脂，4-甲基氯化三苯甲基樹脂或4-甲氧基氯化三苯甲基樹脂，優(yōu)選CTC樹脂。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，步驟(1)-(4)采用在樹脂上依肽序逐步偶聯(lián)保護(hù)氨基酸，偶聯(lián)體系為DIEA與H0Bt，H0At或Cl-HOBt中的任意一個(gè)或一個(gè)以上的組合與HBTU，HATU, PyBOP或PyAOP中的任意一個(gè)或一個(gè)以上的組合組成的偶聯(lián)體系。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，步驟(4)合成2，7兩個(gè)半胱氨酸的二硫橋鍵的環(huán)化試劑是I2，溶劑為DMF，環(huán)化時(shí)間為l_4h，環(huán)化溫度為15-25°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，步驟(5)中所用的溶劑為NMP或DMF，縮合體系為DCC與H0Bt，H0At或Cl-HOBt中的任意一個(gè)或一個(gè)以上的組合，或者DIEA與H0Bt，H0At或Cl-HOBt中的任意一個(gè)或一個(gè)以上的組合與HBTU，HATU,PyBOP或PyAOP中的任意一個(gè)或一個(gè)以上的組合組成的縮合體系。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，步驟(5)- )中脫除氨基端Fmoc保護(hù)基的方法在含有哌啶的DMF或NMP的溶液中進(jìn)行。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，步驟(5)包括(5. 1)將片段a從樹脂上裂解下來，脫除氨基端保護(hù)基；將片段b從樹脂上裂解下來，二者在溶液中縮合，得到片段(b-a)； (5. 2)脫除片段(b-a)的氨基端保護(hù)基，與從樹脂上裂解下來的c片段在溶液中縮合，得到片段(c-b-a); (5. 3)脫除片段(c-b-a)的氨基端保護(hù)基，與從樹脂上裂解下來的d片段在溶液中縮合，得到側(cè)鏈保護(hù)肽(d-c-b-a)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中 片段(b_a)是
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中 片段a是
全文摘要
本發(fā)明涉及利用固相和液相組合技術(shù)制備普蘭林肽的方法，所述方法包括利用固相化學(xué)分別合成1-12，13-20，21-28和29-37四個(gè)肽中間體片段，然后利用液相化學(xué)縮合得到普蘭林肽。通過本發(fā)明路線制備普蘭林肽，操作步驟簡(jiǎn)短，后處理簡(jiǎn)單，副產(chǎn)物少，產(chǎn)率高，污染小，適合大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07K14/00GK102816213SQ20121017139
公開日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月29日
發(fā)明者蘇賢斌, 繆李鵬, 毛怡春, 王蔡典, 董海軍 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué), 南京英沛生物技術(shù)有限公司