專利名稱：大熊貓西氏貝蛔蟲38kDa抗原及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬大熊貓蛔蟲病防治研究領(lǐng)域，涉及ー種西氏貝蛔蟲抗原以及該抗原的制備及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
大熊貓作為我國的國寶和野生動物保護(hù)的旗艦物種，被公認(rèn)為全球最為瀕危的物種之一，其目前僅分布于青藏高原以東的秦嶺、名山、大相嶺、小相嶺及涼山5個山系，種群數(shù)量為2，500-3，000。西氏貝蛔蟲(Baylisascaris schroederi)是大熊貓 體內(nèi)最為常見的一種腸道寄生蟲，對野生和圈養(yǎng)大熊貓危害極大。西氏貝蛔蟲成蟲通常寄生于大熊貓的腸道內(nèi)，但偶爾也可出現(xiàn)于大熊貓的口腔、喉、氣管、胃、胰管及膽管內(nèi)。因其成蟲和幼蟲所在位置的不同，對大熊貓造成的損害也不同。移行期幼蟲可引起廣泛而嚴(yán)重內(nèi)臟幼蟲移行癥(VLM)如腸炎、腸損傷以及典型蠕蟲性的肝炎和肺炎，而成蟲則可導(dǎo)致腸道堵塞、炎癥甚至大熊貓的死亡。和所有其它蛔蟲類似，西氏貝蛔蟲主要是經(jīng)ロ感染且整個發(fā)育過程無任何中間宿主。感染性蟲卵經(jīng)ロ攝入，卵中所含的L2期幼蟲在小腸內(nèi)孵出，然后穿過腸壁，移行至肝臟(L3)和肺臟(L4)，最終經(jīng)咽喉回到腸道發(fā)育成熟，交配并產(chǎn)卵，其蟲卵隨糞便排除。蟲卵對各種理化物質(zhì)和不良環(huán)境條件具有較強(qiáng)的抵抗力且在潮濕的土壌里能存活數(shù)年之久，因此極易引起大熊貓的感染。在自然條件下，野生大熊貓西氏貝蛔蟲的感染率可達(dá)50%以上，甚至100%，是引起野生大熊貓死亡的主要原發(fā)性和繼發(fā)性病因之一。從1971年至2005年間因感染西氏貝蛔蟲而導(dǎo)致野生大熊貓死亡的現(xiàn)象日趨明顯，其中僅2001年至2005年5年時間由VLM造成的死亡數(shù)就占到了總死亡數(shù)了 50%。此外，最新數(shù)據(jù)顯示野生大熊貓西氏貝蛔蟲的自然感染率目前仍超過54. 0%。迄今為止，國內(nèi)外未見任何可用的預(yù)防性疫苗，大熊貓西氏貝蛔蟲病的防治仍以藥物防治為主，且整個防御過程遵從多劑量、輪換用藥的原則，直到大熊貓排凈蟲體或蟲卵。然而，快速出現(xiàn)的耐藥性蟲株以及化學(xué)藥物所產(chǎn)生的食物鏈和環(huán)境污染，加之自然環(huán)境下大熊貓的重復(fù)性感染迫使我們不得不尋求新的預(yù)防和控制措施。而疫苗免疫似乎是ー個理想的防控手段。先前的研究已經(jīng)證實，使用紫外線照射的感染性蛔蟲幼蟲或者蟲卵免疫動物可使動物產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫力，抵制蛔蟲的感染。另外，利用不同發(fā)育階段蛔蟲幼蟲的粗提抗原也可誘導(dǎo)動物機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)カ?？上н@些方法被相應(yīng)因素所局限，例如潛在的偶發(fā)性感染，如感染性蛔蟲幼蟲或者蟲卵，以及有限數(shù)量的蛔蟲天然抗原。因此，探求ー種安全實際的免疫方法成為了必要，而使用非侵染性且可大量制備的重組疫苗抗原不失為一個更好的選擇。最近，幾個豬蛔蟲重組大腸桿菌蛋白抗原已被證實能夠給予實驗小鼠免疫保護(hù)カ從而抵御豬蛔蟲感染性蟲卵的攻擊。類似的現(xiàn)象(西氏貝蛔蟲大腸桿菌重組抗原)也被觀察存在于西氏貝蛔蟲——小鼠感染模型。然而截至目前，可用作西氏貝蛔蟲特異的疫苗靶向性蛋白抗原數(shù)量仍很缺少；重要的是這其中所涉及的準(zhǔn)確免疫機(jī)制仍有待進(jìn)ー步確定，盡管先前發(fā)表的研究成果已表明多數(shù)胃腸道寄生性線蟲感染以誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生較強(qiáng)的Th2性免疫反應(yīng)為主。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種針對西氏貝蛔蟲病的安全有效的能夠激發(fā)大熊貓抗西氏貝蛔蟲病的抗原，以及制備該抗原的方法和該抗原的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是，提供一種大熊貓西氏貝蛔蟲38kDa抗原,該抗原基因為Bsc38基因，該基因核昔酸序列如表I所不，對應(yīng)氣基酸序列如表2所示。本發(fā)明還提供了上述大熊貓西氏貝蛔蟲38kDa抗原的制備方法，按照以下步驟進(jìn)行
2. I提取大熊貓西氏貝蛔蟲蟲體總RNA，以該RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成第一條cDNA，以合成的cDNA為模板進(jìn)行Bsc38基因擴(kuò)增；上游引物5’-TAAAGATGGCATTGGCCGCATCG-3’，下游引物5，-CACTCTTTGATGAAATGCCATCTGTCA-3，；2. 2對克隆質(zhì)粒進(jìn)行目的片段序列測定；2. 3根據(jù)Bsc38基因所測序列，除去信號肽序列，擴(kuò)增編碼成熟肽核苷酸序列引物上游引物5’-CCCAAGCTTCGACAATCTCGCAGT-3’，含 HindIII 酶切位點 AAGCTT，下游引物5’-CCGCTCGAGTCACTCTTTGATGAAATGCCATCTGTC-3’，含 XhoI 酶切位點CTCGAG ；2.4PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠分離純化后，與表達(dá)載體pET32a⑴一起進(jìn)行HindIII和XhoI雙酶切；然后將目的片段與pET32a⑴進(jìn)行連接，構(gòu)建表達(dá)載體pET32a(+)-Bsc38 ;重組載體被重新轉(zhuǎn)入克隆菌DH5 α進(jìn)行再次克隆并測序；將測序正確的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌BL21(DE3)進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；表達(dá)溫度選擇37°C，誘導(dǎo)時間為5h ;離心收集表達(dá)菌株，并重懸于預(yù)冷的50mMNaH2P04 (pH 8. O) UOmM Tris-HCl (pH
8.O)、IOOmM NaCl裂解液中，按IOOmL培養(yǎng)物每5mL裂解液進(jìn)行裂解；然后將裂解菌液進(jìn)行超聲處理并離心，收集沉淀，棄去上清；用SM尿素沖洗所得沉淀直至完全溶解，在含有SM尿素的變性條件下分離純化得到重組Bsc38表達(dá)蛋白；該重組Bsc38表達(dá)蛋白即為所要制備的抗原。上述Bsc38基因擴(kuò)增和編碼成熟肽核苷酸序列擴(kuò)增的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序為PCR反應(yīng)體系(25 μ L) 2 μ LcDNAU. OU Taq DNA聚合酶、3. OmM MgCl2、400 μ MdNTP混合液、50 μ MlO XPCR 緩沖液(Mg2+Free)、8 μ LddH20、上下游引物各 IOpmol ；PCR 反應(yīng)程序94°C 預(yù)變性 5min ;94°C 變性 30sec，62°C 退火 30sec，72°C 延伸45sec，循環(huán)擴(kuò)增35次，最后72°延伸IOmin ;擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，純化；然后純化產(chǎn)物被連接入PMD19-T載體，轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞DH5 α進(jìn)行亞克隆。步驟2. 2對克隆質(zhì)粒進(jìn)行目的片段序列測定，測定結(jié)果已登錄到DDBJ/EMBL/GenBank數(shù)據(jù)庫，對應(yīng)登陸號為GQ859591。本發(fā)明還提供了上述大熊貓西氏貝蛔蟲38kDa抗原的應(yīng)用，將重組蛋白Bsc38用O. OlM, pH 7. 4的稀釋液PBS稀釋，然后與弗氏完全佐劑FCA進(jìn)行等體積混合制成針劑，混合液4°C避光處理16h，以備使用。設(shè)計引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增所得Bsc38基因，長1088bp，最大ORF為1083bp，編碼360個氨基酸；對應(yīng)分子量為40. 507kDa，等電點為6. 32。經(jīng)SignalP 3. O預(yù)測，其前20個氨基酸共同形成信號肽序列；切去信號肽所得成熟分子，其分子量大小為38. 478kDa，對應(yīng)等電點為6. 31。動物保護(hù)性實驗結(jié)果表明該基因能夠作為制備預(yù)防大熊貓西氏貝蛔蟲病基因エ程疫苗的侯選基因。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明能夠減少大熊貓西貝氏蛔蟲病藥物防治過程中耐藥性蟲株的出現(xiàn)以及藥物對食物鏈和環(huán)境的污染，井能夠減輕自然環(huán)境下大熊貓西氏貝蛔蟲的重復(fù)性感染。在國內(nèi)外首次闡明了西氏貝蛔蟲幼蟲感染宿主后的分子免疫機(jī)制。



圖I重組Bsc38蛋白的表達(dá)與Western blotting分析。圖2西氏貝蛔蟲內(nèi)源性Bsc38蛋白及同系物的鑒定分析。圖3西氏貝蛔蟲內(nèi)源性Bsc38在雌性成蟲中的免疫組織化學(xué)分析。圖4重組Bsc38蛋白與不同動物抗西氏貝蛔蟲免疫血清反應(yīng)活性檢測分析。圖5免疫組rBsc38-FCA-PBS、佐劑組FCA-PBS、空白對照組PBS小鼠攻蟲后肝臟、肺臟及肝肺幼蟲回收數(shù)量分析。圖6rBsc38-FCA-PBS組O、FCA-PBS組ぐ、PBS組☆小鼠在三免后2周感染3，200枚西氏貝蛔蟲感染性蟲卵的致死率觀察分析。圖7免疫組rBsc38-FCA-PBS、佐劑組FCA-PBS、空白對照組PBS小鼠在攻蟲前后rBsc38特異性抗體IgG/A、IgGl及IgG2a/B水平檢測分析。圖8免疫組rBsc38-FCA-PBS、佐劑組FCA-PBS、空白對照組PBS小鼠三免后2周細(xì)胞因子，包括Y -IFN、IL-2、IL-4、IL-10水平測定ELISA分析。圖I中A :不同誘導(dǎo)時間下重組Bsc38蛋白的表達(dá)分析，1-6 :誘導(dǎo)時間分別為0h、lh、2h、3h、4h、5h，M蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，7 :透析純化后的rBsc38 ；B :重組Bsc38蛋白的Western blotting分析,8_10 :印跡血清分別為兔抗西氏貝蛔蟲血清、健康兔血清、抗rBcs38小鼠血清。圖2中A :西氏貝蛔蟲不同發(fā)育階段內(nèi)源性Bsc38蛋白的鑒定，1_5 :分別為rBsc38、雌性成蟲、L3期幼蟲、L2期幼蟲、胚胎期蟲卵；B Bsc38同系物蛋白在其他蛔蟲中的鑒定，1-5 :分別為人蛔蟲成蟲、西氏貝蛔蟲成蟲、豬蛔蟲成蟲、犬弓蛔蟲成蟲。圖3中A和C :小鼠抗rBsc38血清為ー抗，按1:100稀釋;B和D :小鼠陰性血清，按1:100稀釋；A和B :放大100倍；C和D放大200倍。A和C中箭頭指示內(nèi)源性Bsc38所在區(qū)域。圖4中I :兔感染前血清；2 :兔感染血清；3小鼠感染前血清；4小鼠感染血清。圖5中各組數(shù)據(jù)差異性表示分別為:*P〈0. 05，**P〈0. 01，***P〈0. 001。圖6中*表示數(shù)據(jù)存在差異性P〈0. 05。圖7中箭頭表示攻蟲時間點；*表示數(shù)據(jù)存在差異性P〈0. 001。圖8中各組數(shù)據(jù)差異性表示分別為*ρ〈0· 01，**Ρ〈0· 001。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例和附圖進(jìn)行說明，本實施例僅以試驗小鼠和兔作為實施對象以說明Bsc38抗原的實用性。本實施例制備的抗原，其基因為Bsc38基因，該基因核昔酸序列如表I所不Bsc38編碼成熟肽的核苷酸序列，對應(yīng)氨基酸序列如表2所示。I、RNA的提取與Bsc38基因的擴(kuò)增提取西氏貝蛔蟲蟲體總RNA，所提RNA濃度約I μ g/ μ L，以提取的5 μ L總RNA為模板，0igo(dT)18為反轉(zhuǎn)錄引物，進(jìn)行第一條cDNA的合成。然后以合成的cDNA為模板進(jìn)行Bsc38基因的擴(kuò)增；擴(kuò)增引物設(shè)計如下上游引物5’-TAAAGATGGCATTGGCCGCATCG-3’，下游引物5’-CACTCTTTGATGAAATGCCATCTGTC A-3’， PCR 反應(yīng)體系(25 μ L)為2 μ LcDNA、I. OU Taq DNA 聚合酶、3. OmM MgCl2,400 μ MdNTP 混合液、50 μ MlO XPCR 緩沖液(Mg2+Free)、8 μ LddH20、上下游引物各 IOpmol。PCR反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30sec，62°C退火30sec，72°C延伸45sec，循環(huán)擴(kuò)增35次，最后72°延伸lOmin。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離后進(jìn)行純化；然后純化產(chǎn)物被連接入PMD19-T載體，轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞DH5 α進(jìn)行亞克隆。2、DNA序列分析對上述克隆質(zhì)粒進(jìn)行目的片段序列測定。該目的片段已登錄到DDBJ/EMBL/GenBank數(shù)據(jù)庫，對應(yīng)登陸號為GQ859591。3、重組蛋白Bsc38的表達(dá)與純化根據(jù)上述Bsc38基因所測序列，除去信號肽序列，設(shè)計擴(kuò)增編碼成熟肽核苷酸序列引物上游引物5’-CCCAAGCTTCGACAATCTCGCAGT-3’，含 HindIII 酶切位點 AAGCTT，下游引物5’-CCGCTCGAGTCACTCTTTGATGAAATGCCATCTGTC-3’，含 XhoI 酶切位點CTCGAG ；PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參考上述I部分，模板為測序正確的亞克隆質(zhì)粒。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠分離純化后，與表達(dá)載體pET32a(+) —起進(jìn)行HindIII和XhoI雙酶切；然后將目的片段與pET32a(+)進(jìn)行連接，構(gòu)建表達(dá)載體pET32a(+)-Bsc38。重組載體被重新轉(zhuǎn)入克隆菌DH5a進(jìn)行再次克隆并測序。將測序正確的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌BL21 (DE3)進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，終濃度為ImM ;表達(dá)溫度選擇37°C，誘導(dǎo)時間為5h。離心收集表達(dá)菌株，并重懸于預(yù)冷的 50mM NaH2PO4 (pH 8. O) UOmM Tris-HCl (pH 8. O)、IOOmM NaCl裂解液中，按IOOmL培養(yǎng)物每5mL裂解液進(jìn)行裂解；然后將裂解菌液進(jìn)行超聲處理并離心，離心轉(zhuǎn)速為1，2000r/min,時間15min,收集沉淀,棄去上清。用8M尿素沖洗所得沉淀直至完全溶解。重組Bsc38表達(dá)蛋白在含有SM尿素的變性條件下被分離純化；其純化物經(jīng)超濾濃縮后被梯度透析，尿素濃度分別為8M、6M、4M、3M、2M、1M、PBS。透析產(chǎn)物濃度被測定并被等量分裝存于-70°C，待使用。所述成熟肽核苷酸序列見表1，與該成熟肽核苷酸序列相對應(yīng)的氨基酸序列如表2所示。4、免疫血清的制備用現(xiàn)有方法進(jìn)行兔抗西氏貝蛔蟲免疫血清的制備。小鼠抗重組Bsc38蛋白多克隆抗體的制備方法如下所述10只雌性小鼠皮下接種重組Bsc38與FCA混合疫苗，50 μ g/只，2周后重復(fù)一次，共兩次。最后一次免疫后2周，采血分離血清，經(jīng)瓊脂糖擴(kuò)散試驗檢測其效價達(dá)1:32后于-20で保存。5、免疫印跡寄生蟲抗原以及重組Bsc38蛋白先分別經(jīng)10%的SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)入硝酸纖維膜(NC膜)上，并于室溫在5%BSA中孵育Ih。對于蟲體內(nèi)源性Bsc38的檢測，上述NC膜將與小鼠或兔抗rBsc38血清進(jìn)ー步孵育；而對于重組Bsc38蛋白抗原性的檢測，上述NC膜則需要與小鼠或兔抗西氏貝蛔蟲感染血清、小鼠抗rBsc38血清及兔正常血清孵育。經(jīng)ー抗孵育后，棄ー抗，用TBS-T洗膜，5minX3次；加入堿性磷酸酶偶聯(lián)羊抗鼠或羊抗兔ニ抗，按I 200比例用TBS-T稀釋，室溫孵育2h ;棄去ニ抗，用TBS-T洗膜3次，每次5min ;加入顯色液 nitroblue tetrazol ium/5-bromo-4-chloro-3-in-doIylphosphate(NBT/BCIP),避光 顯色直至印跡帶出現(xiàn)，然后放入ddH20終止顯色反應(yīng)。6、內(nèi)源性Bsc38在雌性成蟲蟲體中的免疫定位用4%多聚甲醛溶液，含O. IM磷酸緩沖液pH=7. 2，對一條西氏貝蛔蟲雌性成蟲蟲體進(jìn)行4°C過夜固定處理，然后包埋入蠟。蟲體橫切面經(jīng)脫蠟和梯度脫水處理后，用PBS液侵泡。3%H202被用于滅活內(nèi)源性的過氧化物酶，而含10%山羊血清的PBS液則被用于封閉非特異性的抗原位點，室溫作用10-15min。隨后在組織切片上滴加稀釋的小鼠抗rBsc38血清，稀釋倍數(shù)1:100，而對照組則滴加同樣稀釋倍數(shù)的健康小鼠血清，室溫共同作用lh，拋去載破片上殘余血清，將載破片放入PBS中洗滌3次，每次5min。拋去多余PBS后滴加生物素化的山羊抗小鼠標(biāo)記IgG ニ抗1:1000，然后置于室溫2011^11，？85沖洗載破片，51^11\3次；拋干PBS,在光學(xué)顯微鏡下滴加顯色底物3’，3’_diaminobenzidinetetrahydrochloride并控制顯色時間。如達(dá)到理想效果，可用蒸餾水洗滌，終止顯色反應(yīng)。蒸餾水洗滌IOmin后，用蘇木精復(fù)染30sec,蒸懼水洗漆IOmin,常規(guī)方法脫水、ニ甲苯透明、中性樹膠封片,鏡檢。7、免疫保護(hù)試驗先將重組Bsc38蛋白稀釋至600yg/mL，稀釋液PBS，0. 01M，pH 7. 4，然后與弗氏完全佐劑FCA進(jìn)行等體混合，混合液4°C避光處理16h。整個保護(hù)性試驗設(shè)置FCA-PBS和PBS兩個對照組。健康小白鼠90只，隨機(jī)分成3組，每組30只，分別為rBsc38-FCA-PBS組、FCA-PBS組和PBS組。三組小鼠分別進(jìn)行皮下注射rBsc38-FCA-PBS、FCA-PBS和PBS，注射劑量為IOOyL/只。首次注射后兩周，各組分別實施第一次和第二次加強(qiáng)免疫，兩次免疫間隔時間為14d。最后一次免疫之后2周，每組隨機(jī)挑選10只小鼠，采集其脾臟進(jìn)行淋巴因子試驗，而各組剩余20只小鼠則通過人工灌胃方式感染3，200枚西氏貝蛔蟲感染性蟲卵。攻蟲后一周，各組隨機(jī)挑選10只小白鼠，分別采集其肝臟和肺臟，并用外科手術(shù)刀進(jìn)行搗碎，使用貝爾曼法收集每組小鼠肝肺幼蟲，在顯微鏡下觀察和記錄所得幼蟲數(shù)。每組最后10只小白鼠則被用于西氏貝蛔蟲致死性觀察，觀察期設(shè)為攻蟲感染后的80d內(nèi)。rBsc38-FCA-PBS組小鼠的相對存活率RPS使用如下公式計算RPS= {I-(rBsc38-FCA-PBS組小鼠致死率/PBS組小鼠致死率)} X100。整個動物保護(hù)性試驗設(shè)計被展示見表3。另外，用于抗體檢測的血清樣品采集分別在每次免疫之后以及攻蟲后的0d、7d、21d、35d、42d和49d進(jìn)行，且所用樣品隨即儲存于_20°C條件，待用。8、ELISA 檢測抗體免疫組小鼠血清中rBsc38特異性抗體IgM、IgE、IgG及IgG亞型(IgGl和IgG2a)的測定使用酶聯(lián)免疫吸附試驗ELISAs。其中，IgM、IgG及IgG亞型抗體水平的測定使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體作為ニ抗，對應(yīng)的親和純化山羊抗小鼠IgM、IgG、IgGl和IgG2a被用作標(biāo)準(zhǔn)對照。用O. IM碳酸鹽緩沖液(IOmM Na2CO3, 30mM NaHCO3 ；pH 9. 6)稀釋成的2 μ g/mL rBsc38蛋白包被于96孔ELISA板，100 μ L/孔，置于4°C冰柜孵育14 16h，然后用O. 05%Tween20 (PBS-T)洗滌3次，每次5min，再加2%PBS溶解的BSA進(jìn)行封閉，100 μ L/孔，37°C作用 2h，用 PBS-T 洗滌，5minX3 次，加入 PBS(0.01M，pH 7.4)按 1:2000 稀釋小鼠血清，100 μ L/孔，370C孵育Ih,再用PBS-T洗滌3次，每次5min，拋干，加入PBS (O. 01M, pH7. 4)稀釋的山羊抗小鼠 IgM-HRP (1:5000)、IgG-HRP (1:5000)及 HRP 偶聯(lián) IgG亞型(I: 5000)酶標(biāo)ニ抗，100 μ L/孔，370C孵育lh, PBS-T洗滌，5minX 3次，拋干，加入底物溶液O. 4mg/mL OPD, 50mM 磷酸氫ニ鈉，25mM 枸櫞酸 and 30%H202, 100 μ L/ 孔，37°C作用 5 lOmin，加入 100 μ L終止液2Μ H2SO4終止反應(yīng)。rBsc38特異性抗體IgE的測定，使用抗體捕獲性ELISA檢測法。大鼠抗小鼠IgE抗體作為捕獲性抗體，而大鼠抗小鼠IgE單克隆抗體(按1:10，OOO稀釋)則被用作標(biāo)準(zhǔn)對照。包被有相同濃度rBsc38 (2 μ g/mL)的96孔ELISA板先后與待測血清(按1: 1，000)和大鼠抗小鼠IgE單克隆抗體(I: 10，000)進(jìn)行37°C孵育，時間均為lh，然后PBS-T洗滌，各3次，每次5min，拋干，加入HRP標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG ニ抗，37°C作用lh，用PBS-T洗滌，5minX3次，拋干，加入與IgG測定相同的底物進(jìn)行顯色反應(yīng)，用2M H2SO4終止反應(yīng)。所有ELISA板均以490nm作為其OD值測定的指定波長，且各板均設(shè)置陽性和陰性對照組。參考各待測抗體對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(來自標(biāo)準(zhǔn)對照)進(jìn)行抗體濃度的確定。9、脾細(xì)胞的培養(yǎng)與細(xì)胞因子的測定先將小鼠脾臟鈍性分離，懸浮于預(yù)冷的Hanks平衡鹽溶液HBSS，附含5%(v/v)熱處理的胎牛血清FCSUOO μ g/mL青霉素、100 μ g/mL鏈霉素。待紅細(xì)胞破裂后，以T淋巴細(xì)胞為主的所有細(xì)胞被重懸于完全RPMI 1640溶液，內(nèi)含10%(v/v)熱處理的FCSUOmM N-2-hydroxyethylpiperazine-N,-2-etha-nesulfonic acid(HEPES)緩沖液、2mM L-谷氨酸胺、ImM 丙酮酸鈉、ImM 非必氨基酸、lmg/mL 氟胞卩密唳、5 X ICT5M 2mercaptoethanoland、100U/mL青霉素、5 μ g/mL慶大霉素；隨后所有脾細(xì)胞被轉(zhuǎn)移至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板4X IO6細(xì)胞/孔，
I.OmL/孔，在37°C、5%C02濃度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，用15 μ g/mL濃度的rBsc38刺激培養(yǎng)細(xì)胞72h后，收集細(xì)胞上清液，凍存于-80°C。對各試驗組小鼠細(xì)胞因子包括白介素2、白介素4、白介素10及Y干擾素含量進(jìn)行測定，并參考各自標(biāo)準(zhǔn)曲線確定各細(xì)胞因子濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及細(xì)胞因子檢測按使用說明重復(fù)三次。10、數(shù)據(jù)分析本發(fā)明所得數(shù)據(jù)均以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差SD的形式展示于各試驗圖片中。數(shù)據(jù)分析與檢驗使用SPSS統(tǒng)計軟件(SPSS for Windows 13. 0) (SPSS Inc)，組間差異顯著性分析使用one-way AN0VA、LSD、Duncan法或Scheffe法檢驗,P〈0. 05視為差異性顯著。所有動物試驗被重復(fù)2次,且姆個試驗組包含10只小白鼠。作為判定免疫效果指標(biāo),減蟲率(%) = [ (PBS組平均檢獲幼蟲數(shù)-rBsc38-FCA-PBS組平均檢獲幼蟲鼠)/PBS組平均檢獲幼蟲數(shù)]X 100。ll、Bsc38基因的克隆與鑒定經(jīng)PCR擴(kuò)增所得Bsc38基因，最大ORF為1083bp，編碼360個氨基酸；對應(yīng)分子量為40. 507kDa，等電點為6. 32。切去信號肽所得成熟分子，其分子量大小為38. 478kDa，見表1，對應(yīng)等電點為6. 31。NCBI同源性搜索發(fā)現(xiàn)，BSC380RF編碼氨基酸序列與C. remaneiCRE-PYP-I 蛋白(GenBank accession no. :EFP04160)相似性為 64. 4% ;與寄生性線蟲(包括馬來絲蟲(GenBank accession no. :EDP36300)、L. Ioa (GenBank access ionno. :EF025093)、旋毛蟲(GenBank accession no. :EFV52164))和自由營生線蟲(包括秀I 隱桿線蟲(GenBank accession no. :ΝΡ_001023073) > C. briggsae (GenBank accessionno. :XP_002633752))的無機(jī)焦磷酸酶相似性為45. 8 56. 5%。多序列比對顯示，同源區(qū)域遍布整個序列，但序列兩端少見。除上述序列外，Bsc38與其他物種不具有氨基酸序列相似度。12、重組Bsc38蛋白的表達(dá)、純化與生化特征分析Bsc38基因序列經(jīng)生物信息學(xué)分析，切去信號肽，其編碼成熟氨基酸序 列被亞克隆入pET32a(+)原核表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)BL21(DE3)表達(dá)宿主菌進(jìn)行融合表達(dá)，其大小約為58kDa，如圖IA所示。其中，His-Tag標(biāo)簽蛋白為20kDa，rBsc38約為38kDa，該大小與預(yù)期蛋白分子量(Bcs38基因去信號肽編碼成熟氨基酸)相符。IPTG誘導(dǎo)5h后，rBsc38的表達(dá)量達(dá)到最大；收集此時的表達(dá)菌進(jìn)行超聲處理，獲取包涵體沉淀，溶于8M尿素。經(jīng)過柱純化后用尿素梯度透析進(jìn)行復(fù)性。rBsc38融合蛋白的表達(dá)量為4mg每I升培養(yǎng)物，其純度如圖IA所示。分別以人工感染的抗西氏貝蛔蟲的兔血清(試驗組)、抗rBsc38小鼠免疫血清(陽性對照組)、健康兔血清(陰性對照組)作為ー杭，Western blot分析結(jié)果顯示試驗組和陽性對照組在58kDa處出現(xiàn)印跡條帶，見圖1B，表明rBsc38具有較好的抗原性。該純化重組蛋白隨即被運(yùn)用于小鼠多克隆抗體的制備、免疫組化分析(高免血清的制備)、與不同物種免疫血清反應(yīng)原性觀察以及動物免疫保護(hù)試驗。13、西氏貝蛔蟲內(nèi)源性Bsc38抗原及其同系物的鑒定分別來自西氏貝蛔蟲胚胎期蟲卵、L2期幼蟲、L3期幼蟲和成年雌蟲的蟲體蛋白與小鼠抗rBsc38血清印跡后，均在38kDa處呈現(xiàn)明顯的反應(yīng)條帶，見圖2A，而小鼠正常血清則表現(xiàn)為陰性，無任何印跡帶，該結(jié)果證實天然的Bsc38抗原廣泛分布于西氏貝蛔蟲的各個發(fā)育階段，包括胚胎期蟲卵、L2期幼蟲、L3期幼蟲及成年雌蟲。此外，來自人蛔蟲(A. Iumbricoides)、豬蛔蟲(A. suum)、犬弓蛔蟲(T. can is)蟲體蛋白提取物與抗rBsc38小鼠免疫血清作用后，在38kDa處也均出現(xiàn)印跡條帶，見圖2B，該現(xiàn)象表明Bsc38的同系物也存在于這三種蛔蟲蟲體內(nèi)。小鼠陰性血清未見此反應(yīng)。14、西氏貝蛔蟲內(nèi)源性Bsc38在雌性成體中的定位使用制備的小鼠抗rBsc38血清(試驗組)及小鼠健康血清(陰性組)作為ー杭，用生物素化的山羊抗小鼠標(biāo)記IgG為ニ抗，對西氏貝蛔蟲雌性成蟲切片進(jìn)行內(nèi)源性Bsc38的組織化學(xué)定位。顯微鏡下觀察試驗組西氏貝蛔蟲的皮下組織、肌肉組織、腸上皮細(xì)胞、背索、側(cè)線、非胚胎期蟲卵、子宮、卵巣等組織器官呈現(xiàn)出明顯的棕褐色，而在對照組中相應(yīng)區(qū)域未見其顏色反應(yīng)，見圖3A-D。Bsc38的同系物蛋白在人蛔蟲和豬蛔蟲的免疫組化分析中，其分布區(qū)域與內(nèi)源性Bsc38在西氏貝蛔蟲中的相似。15、rBsc38與不同動物免疫血清的反應(yīng)原性用人工感染西氏貝蛔蟲的小鼠和兔血清與重組蛋白Bsc38進(jìn)行印跡，結(jié)果顯示rBsc38能分別與上述兩種血清發(fā)生反應(yīng)，出現(xiàn)印記條帶，而兩種動物陰性血清未見其反應(yīng)，見圖IB和圖4 ;進(jìn)ー步表明rBsc38具有較好的抗原性和反應(yīng)原性。16、西氏貝蛔蟲rBsc38抗原的疫苗免疫保護(hù)效果
通過給小鼠皮下免疫接種rBsc38-FCA_PBS(試驗組)、FCAPBS (佐劑對照組)、PBS(空白對照組)，連續(xù)3次，毎次間隔2周，然后進(jìn)行攻蟲實驗。攻蟲I周后，觀察記錄各組小鼠體內(nèi)西氏貝蛔蟲移行幼蟲數(shù)量。結(jié)果分析顯示試驗組肝臟幼蟲回收數(shù)(23.6±0.81)與空白對照組(57.7±6.62)相比，明顯減少(P〈0. 024)，而試驗組肺臟幼蟲回收數(shù)(8. 5±2. 16)較空白對照組(47. 5±5. 00)顯著減少(P〈0. 0085)，整個試驗組與空白對照組相比回收幼蟲明顯減少了(P〈0. 001) 69. 02%，見圖5。此外，組織病理學(xué)觀察顯示試驗組小鼠肝肺病變(典型的幼蟲移行癥狀“乳斑肝”與肺出血)與對照組相比明顯減少。為了進(jìn)ー步說明重組Bsc38蛋白的疫苗免疫保護(hù)效果，尤其是對移行期幼蟲的影響以及降低感染小鼠死亡數(shù)方面，各組剩余的10只小鼠，其存活數(shù)被進(jìn)ー步觀察和記錄。結(jié)果顯示各組小鼠在攻蟲后的前8周，均未出現(xiàn)致死情況；而后3周里試驗組(接種rBsc38-FCA-PBS)、佐劑對照組(接種FCA-PBS)、空白對照組(接種PBS)小鼠的累積死亡率分別為20%、100%、100%,與兩對照組相比試驗組的相對存活率為80%，見圖6。攻蟲后第80天，將所有存活的小鼠處死，與之前致死小鼠一起剖解，對每只小鼠的肝臟、肺臟、腎臟、腦、脾臟以及肌肉組織進(jìn)行鏡檢，發(fā)現(xiàn)西氏貝蛔蟲為其唯一寄生性線蟲，證實各組小鼠致死病原為西氏貝蛔蟲，即移行期幼蟲。17、體液免疫對rBsc38-FCA-PBS 組、FCA-PBS 組、PBS 組小鼠血清抗體(IgG、IgE、IgM、IgGl、IgG2a)的ELISA檢測結(jié)果顯示，rBsc38-FCA-PBS組小鼠血清中IgG含量在一免后較對照組(包括=FCA-PBS組和PBS組)有顯著的增加(P〈0. 001)，且在整個試驗期間維持較高的水平，其峰值出現(xiàn)在一免后第四周和攻蟲后的第一周，見圖7A ;而各組小鼠血清中未檢測到rBsc38特異性IgE的存在。與IgE含量類似，IgM的檢測量也很低或不能檢出；有趣的是在攻蟲后一周，IgM的含量出現(xiàn)較小的升高，但各組之間彼此差異性不顯著。基于試驗組(rBsc38-FCA-PBS組)呈現(xiàn)較高的IgG反應(yīng)，重組rBsc38蛋白疫苗所介導(dǎo)的體液免疫類型(Thl或者Th2)通過對IgG抗體亞型(IgGl和IgG2a)的測定被進(jìn)ー步證實，結(jié)果表明試驗組小鼠血清中IgGl和IgG2a的含量在免疫后的第2周、第4周、第6周與對照組相比均有顯著上升(P〈0. 001)，但是IgGl的％含量明顯高于IgG2a，見圖7B。18、細(xì)胞免疫細(xì)胞因子ELISA檢測顯示，試驗組(rBsc38_FCAPBS組)小鼠再經(jīng)三次免疫接種后，其脾細(xì)胞在體外rBsc38刺激后將分泌出較對照組(包括FCA-PBS組和PBS組)小鼠脾細(xì)胞高的Th2型細(xì)胞因子白介素10 (P〈0. 001)和白介素4 (P〈0. 01)，而Thl型細(xì) 胞因子白介素2和Y干擾素在各組小鼠皮細(xì)胞培養(yǎng)液中的含量不存在顯著性差異，如圖8所示?；诩?xì)胞因子分泌情況表明重組Bsc38蛋白疫苗在小鼠免疫試驗中以介導(dǎo)Th2型免疫反應(yīng)為主。表3小鼠保護(hù)性試驗設(shè)計
權(quán)利要求
1.大熊貓西氏貝蛔蟲38kDa抗原，其特征在于，其抗原基因為Bsc38基因，該基因核苷酸序列如表I所示Bsc38編碼成熟肽的核苷酸序列，對應(yīng)氨基酸序列如表2所示。
2.—種權(quán)利要求I所述大熊貓西氏貝蛔蟲38kDa抗原的制備方法，其特征在于，大熊貓西氏貝蛔蟲38kDa抗原按照以下步驟制備 2.I提取大熊貓西氏貝蛔蟲蟲體總RNA，以該RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成第一條cDNA，以合成的cDNA為模板進(jìn)行Bsc38基因擴(kuò)增； 上游引物5’ -TAAAGATGGCATTGGCCGCATCG-3’， 下游引物5，-CACTCTTTGATGAAATGCCATCTGTC A-3，； 2.2對克隆質(zhì)粒進(jìn)行目的片段序列測定； 2.3根據(jù)Bsc38基因所測序列，除去信號肽序列，擴(kuò)增編碼成熟肽核苷酸序列引物 上游引物5’ -CCCAAGCTTCGACAATCTCGCAGT-3’ ,含 Hindlll 酶切位點 AAGCTT， 下游引物5’-CCGCTCGAGTCACTCTTTGATGAAATGCCATCTGTC-3’，含辦ol 酶切位點CTCGAG ； 2.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠分離純化后，與表達(dá)載體pET32a (+) —起進(jìn)行沿/？ /ΙΙΙ和通ol雙酶切；然后將目的片段與pET32a (+)進(jìn)行連接，構(gòu)建表達(dá)載體pET32a(+)-Bsc38 ;重組載體被重新轉(zhuǎn)入克隆菌DH5 α進(jìn)行再次克隆并測序；將測序正確的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌BL21 (DE3)進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；表達(dá)溫度選擇37°C，誘導(dǎo)時間為5 h ;離心收集表達(dá)菌株，并重懸于預(yù)冷的50 mM NaH2 PO4 (pH 8. 0),10 mM Tris-HCl(pH 8. 0),100 mM NaCl裂解液中，按100 mL培養(yǎng)物每5 mL裂解液進(jìn)行裂解；然后將裂解菌液進(jìn)行超聲處理并離心，收集沉淀，棄去上清；用8 M尿素沖洗所得沉淀直至完全溶解，在含有8 M尿素的變性條件下分離純化得到重組Bsc38表達(dá)蛋白；該重組Bsc38表達(dá)蛋白即為所要制備的抗原。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的大熊貓西氏貝蛔蟲38kDa抗原的制備方法，其特征在干，Bsc38基因擴(kuò)增和編碼成熟肽核苷酸序列擴(kuò)增的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序為 PCR 反應(yīng)體系(25μυ :2 μ cDNAU. O U Taq DNA 聚合酶、3. O mM MgCl2,400 μΜ dNTP混合液、50 μΜ IOX PCR 緩沖液(Mg2+ Free)、8μ ddH20、上下游引物各 10 pmol ； PCR反應(yīng)程序94 °C預(yù)變性5 min;94°C變性30 sec，62°C退火30 sec，72°C延伸45sec，循環(huán)擴(kuò)增35次，最后72°延伸10 min ;擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，純化；然后純化產(chǎn)物被連接入PMD19-T載體，轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞DH5 α進(jìn)行亞克隆。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的大熊貓西氏貝蛔蟲38kDa抗原的應(yīng)用，其特征在干，將重組Bsc38蛋白用O. 01 M, pH 7. 4的稀釋液PBS稀釋，然后與弗氏完全佐劑FCA進(jìn)行等體積混合制成針劑，混合液4°C避光處理16 h，以備使用。
全文摘要
一種大熊貓西氏貝蛔蟲38kDa抗原以及制備該抗原的方法和應(yīng)用，該抗原基因為Bsc38基因，該基因核苷酸序列如表1所示Bsc38編碼成熟肽的核苷酸序列，對應(yīng)氨基酸序列如表2所示。本發(fā)明針對目前大熊貓西氏貝蛔蟲病的防治仍以藥物防治為主，藥物的頻繁使用導(dǎo)致耐藥性蟲株的出現(xiàn)以及化學(xué)藥物所產(chǎn)生的食物鏈和環(huán)境污染等問題，鑒定和篩選出了一個用于制備預(yù)防大熊貓西氏貝蛔蟲病的基因工程疫苗侯選抗原。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明能減少大熊貓西貝氏蛔蟲病藥物防治過程中耐藥蟲株的出現(xiàn)和藥物對食物鏈和環(huán)境的污染，能減輕自然環(huán)境下大熊貓的重復(fù)性感染。本發(fā)明在國內(nèi)外首次闡明了西氏貝蛔蟲幼蟲感染宿主后的分子免疫機(jī)制。
文檔編號C07K14/435GK102675446SQ20121017140
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月8日
發(fā)明者嚴(yán)玉寶, 余華, 古小彬, 彭雪蓉, 楊光友, 王淑賢, 謝躍, 陳世界 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)