專利名稱：抗暗紋東方鲀源致病性維氏氣單胞菌卵黃抗體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗暗紋東方飩源致病性維氏氣單胞菌卵黃抗體的制備技術(shù)，用于維氏氣單胞菌引起的魚類疾病防治。屬于生物制品制備技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)又稱凡隆氣單胞菌、維羅納氣單胞菌,1983年，美國疾病預(yù)防與控制中心為紀念法國微生物學(xué)家Veron在弧菌和氣單胞菌研究中的貢獻而命名。該菌普遍存在于淡水、污水，土壤乃至海水中，其中一部分菌株是微生態(tài)環(huán)境中正常存在的，而另一些菌株具有致病性，主要感染變溫動物，如中華絨螯蟹、泥鰍、錦鯉，斑點叉尾鲴等，可引起大量死亡；維氏氣單胞菌對恒溫動物是·一種機會致病菌，但有人認為免疫功能健全者也可被感染，通常患者發(fā)生急性腹瀉，也可能引起菌血癥、腦膜炎和心內(nèi)膜炎等。近年來，日益增多的病例表明維氏氣單胞菌已成為一種重要的人一魚共患致病菌，并在食品安全上表現(xiàn)出重要意義，部分國家已經(jīng)將其規(guī)定為食品安全的檢疫對象?？咕幬锏氖褂檬莿游锷a(chǎn)和疫病防治的重要措施，但抗菌藥的不科學(xué)使用，致使藥物殘留、環(huán)境污染和細菌耐藥已經(jīng)成為一個世界關(guān)注的獸醫(yī)公共衛(wèi)生問題。因此，尋求一種安全、高效的抗菌藥替代品成為一個急待解決的問題。特異性卵黃抗體可治療由細菌或病毒感染引起的疾病，具有安全、無殘留、不產(chǎn)生耐藥性、廉價、易得等優(yōu)點，是一種具有廣泛應(yīng)用前景的抗生素替代品。目前，卵黃抗體研制技術(shù)正成為國內(nèi)外醫(yī)藥領(lǐng)域的新熱點。卵黃中的卵黃抗體濃度能長期維持在相當于甚至超過血液抗體濃度的水平(Larsson等，1993), (Hatta等，1993),—羽高產(chǎn)蛋禽產(chǎn)蛋期每月大約可產(chǎn)1500mg卵黃抗體(Schade等，1994)。卵黃抗體的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，發(fā)揮作用后即可被機體作為營養(yǎng)物質(zhì)分解利用，純品不會殘留任何有害物質(zhì)；而且穩(wěn)定性較好，能耐酸、耐堿、耐熱、耐酶解(Shimizu等，1992)，可制成方便保存和運輸?shù)穆腰S抗體粉，是一種理想的綠色生物制品。目前IgY技術(shù)在國內(nèi)研究與應(yīng)用的大體情況是在獸醫(yī)學(xué)和功能食品開發(fā)上比較受重視，甚至較許多西方國家更加重視產(chǎn)品開發(fā)和商品化。但IgY技術(shù)應(yīng)用的基礎(chǔ)研究工作還比較薄弱，其劑型研究幾乎無人涉及，這也成為IgY普遍應(yīng)用的“瓶頸”。IgY在疾病防冶中的研究是被動免疫領(lǐng)域的熱點和十分活躍的課題。在細菌性腸道疾病防治方面，目前認為IgY有三大作用機理一是抗特定病原菌的IgY能直接粘附于病原菌的細胞壁上，改變病原菌細胞的完整性，直接抑制病原菌的生長；二是IgY可粘附于細菌菌毛上，使病原菌不能粘附于腸道黏膜；三是部分IgY在腸道消化酶作用下，降解為小肽(含有抗體未端高度可變的小肽=Fab部分)，這些小肽仍能與抗原結(jié)合，具有中和病原能力。在非胃腸道疾病防治方面，IgY進入胃腸道后，在消化酶的作用下，IgY部分降解為小肽，極易被腸道吸收，進入血液后能與特定病原菌的粘附因子結(jié)合，使病原菌不能粘附易感細胞而失去致病性，可對非腸道病原菌發(fā)揮抑菌作用?？鼓懩沂湛s素IgY能在SD大鼠十二指腸段以完整分子形式吸收或部分吸收進入血液，發(fā)揮其免疫學(xué)和生物學(xué)效應(yīng)，但抗CCK卵黃抗體的吸收機制未得到進一步的實驗論證。卵黃抗體在魚類細菌性疾病防冶方面的應(yīng)用已有一些報道，Arastech等用卵黃抗體對虹鱒進行被動免疫預(yù)防試驗，發(fā)現(xiàn)虹鱒服用卵黃抗體15天后對鰻弧菌產(chǎn)生了明顯的免疫力。Gutierrez等用卵黃抗體對日本鰻魚進行口服免疫，發(fā)現(xiàn)免疫后其腸道中遲緩愛德華菌的數(shù)量顯著減少，因而抑制該病原從受傷的腸壁入侵肝臟和腎臟，降低了該病的死亡率。王斌等在采用口服法對大菱 鲆進行免疫保護試驗發(fā)現(xiàn)，無論是用肌肉注射還是用劃傷浸泡的方法進行人工感染，都不會使魚發(fā)病，保護效果較好；卵黃抗體對劃傷浸泡感染的保護效果要好于注射感染組。但其中原因也未得到進一步的實驗論證。李肖梁等用特異性卵黃抗體添加劑對中華鱉的免疫保護實驗表明特異性IgY抗體的飼料添加劑對相應(yīng)病原具有較好的預(yù)防作用，腎臟中細菌總數(shù)明顯減少，但IgY在中華鱉機體內(nèi)的作用機理和代謝未做更明確的實驗論證。暗紋東方飩(Takifugu fasciatus)是具有極高經(jīng)濟價值的特種水產(chǎn)養(yǎng)殖對象，隨著暗紋東方飩?cè)斯し敝?、營養(yǎng)及無毒人工養(yǎng)殖等綜合養(yǎng)殖技術(shù)的不斷完善，暗紋東方飩高密度、集約化養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，病害已成為制約該行業(yè)發(fā)展的主要因素之一。維氏氣單胞菌引起的暗紋東方飩疾病在生產(chǎn)實踐中已有出現(xiàn)，造成一定的經(jīng)濟損失。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種易操作，效果好的抗暗紋東方飩源致病性維氏氣單胞菌卵黃抗體的制備方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種抗暗紋東方飩源致病性維氏氣單胞菌卵黃抗體的制備方法，其特征是包括下列步驟(I)將保藏編號為CCTCC No :M2012154的暗紋東方飩源致病性維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)SY-R2 (保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏單位地址中國武漢大學(xué)，保藏日期2012年5月3日，分類命名Aeromonas veronii SY-R2)劃線接種大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基平板，37°C培養(yǎng)24 h，挑取單菌落涂布于直徑15 cm的TSA平板，于37 V培養(yǎng)20 h;用無菌PBS洗下菌苔，測定并調(diào)整菌液濃度為2. 5 XIOki CFU/ mL ;純檢合格后按O. 5% (V/V)福爾馬林液37 °C滅活24 h，無菌檢驗合格后供制備抗原；每5重量份滅活菌液加入滅菌的氫氧化鋁膠I重量份，加入相當于滅活菌液和氫氧化鋁膠總重量O. 01%的硫柳汞防腐，得到菌苗；(2)免疫程序28周齡羅曼蛋雞進行翅靜脈采血作為對照血清，開產(chǎn)后收集雞蛋作為實驗對照；開產(chǎn)后第3天，用步驟(I)制備的菌苗胸肌多點注射免疫，劑量O. 5mL/只；首次免疫后I周進行第二次免疫，免疫劑量I. OmL/只；第二次免疫后每隔20d加強免疫，連續(xù)免疫2次，免疫劑量均為I. OmL/只；第四次免疫后40d，再進行免疫，免疫劑量為2. OmL/只；從首次免疫開始，每次免疫后7天翅靜脈采血分離血清，并收集所有雞蛋，對免疫后每間隔7d收集的雞蛋進行效價測定；用微量凝集法初步測定免疫雞血清和卵黃中抗體的有無；(3)卵黃液的預(yù)處理收集第四次免疫后雞蛋，用清水刷拭干凈后浸于O. 5%新潔爾滅中消毒、涼干，于無菌條件下分離出卵黃，加入I. 5倍體積的生理鹽水，高速勻漿制備乳濁液；(4)卵黃粉的制備將經(jīng)步驟(3)預(yù)處理的卵黃液進行噴霧干燥，制得卵黃粉，其中IgY即抗暗紋東方飩源致病性維氏氣單胞菌卵黃抗體。步驟(2)對免疫后每間隔7d收集的雞蛋，無菌條件下分離出卵黃，80g/L聚乙二醇-8 000 (PEG-8 000)—步法提純卵黃抗體，ELISA測定抗體效價，第四次免疫后ELISA測定的卵黃抗體效價為I : 12560。步驟(4)中噴霧干燥的進風(fēng)溫度為120°C _140°C，出風(fēng)溫度為68°C _72°C。步驟(3)中高速勻漿轉(zhuǎn)速為9500r/min，時間為10_20min。保藏編號為CCTCC No M2012154的暗紋東方飩源致病性維氏氣單胞菌 (Aeromonas veronii) SY-R2通過下列步驟的選育方法得到取具有典型癥狀、死亡后一小時內(nèi)的暗紋東方飩的心臟、肝臟病灶進行細菌分離培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基平板，30°C培養(yǎng)24h，選取優(yōu)勢菌在TSA平板上進行純培養(yǎng)直至菌落純，獲得致病菌株；所述典型癥狀為腹部膨大，肛門紅腫，體表及胸鰭、腹鰭和臀鰭殘缺、基部充血、出血、解剖時有大量淡黃色帶血的水樣腹水；肝臟腫大，呈土黃色，有大小不一的出血斑塊；膽囊膨大；腸道無食，充滿泡沫狀粘液，腸粘膜出血。本發(fā)明易操作，效果好，第四次免疫后ELISA測定的卵黃抗體效價為I :12560。，進一步制成的卵黃抗體粉效價不變。與其他技術(shù)相比本發(fā)明的獨特之處還在于首先，抗原來自于暗紋東方飩，維氏氣單胞菌引起的暗紋東方飩疾病在國內(nèi)外從未見過報道，是暗紋東方飩一種全新的疾病。第二，以維氏氣單胞菌為抗原制備的卵黃抗體在國內(nèi)外同樣未見過報道。第三，該發(fā)明中所述的卵黃抗體液的預(yù)處理使卵黃抗體形成乳濁液，這在卵黃抗體粉的制備過程中未見過報道。下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。
具體實施例方式一種抗暗紋東方飩源致病性維氏氣單胞菌卵黃抗體的制備方法，包括下列步驟(I)將保藏編號為CCTCC No :M2012154的暗紋東方飩源致病性維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii) SY-R2 劃線接種大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(Tryptose Soya Agar, TSA)平板，37°C培養(yǎng)24h，挑取單菌落涂布于直徑15cm的TSA平板，于37°C培養(yǎng)20h ;用無菌PBS(0.01M, pH 7. 2)洗下菌苔，測定并調(diào)整菌液濃度為2. 5X101(lCFU/mL;純檢合格后按0. 5%(V/V)福爾馬林液37°C滅活24h，無菌檢驗合格后供制備抗原；每5重量份滅活菌液加入滅菌的氫氧化鋁膠I重量份，加入相當于滅活菌液和氫氧化鋁膠總重量0. 01%的硫柳汞防腐，得到菌苗；(2)免疫程序28周齡羅曼蛋雞進行翅靜脈采血作為對照血清，開產(chǎn)后收集雞蛋作為實驗對照；開產(chǎn)后第3天，用步驟(I)制備的菌苗胸肌多點注射免疫，劑量0. 5mL/只；首次免疫后I周進行第二次免疫，免疫劑量I. OmL/只；第二次免疫后每隔20d加強免疫，連續(xù)免疫2次，免疫劑量均為I. OmL/只；第四次免疫后40d，再進行免疫，免疫劑量為2. OmL/只；從首次免疫開始，每次免疫后7天翅靜脈采血分離血清，并收集所有雞蛋，對免疫后每間隔7d收集的雞蛋進行效價測定；用微量凝集法初步測定免疫雞血清和卵黃中抗體的有無；
(3)卵黃液的預(yù)處理收集第四次免疫后雞蛋，用清水刷拭干凈后浸于O. 5%新潔爾滅中消毒、涼干，于無菌條件下分離出卵黃，加入I. 5倍體積的生理鹽水，高速勻漿制備乳濁液；(4)卵黃粉的制備將經(jīng)步驟(3)預(yù)處理的卵黃液進行噴霧干燥，制得卵黃粉，其中IgY即抗暗紋東方飩源致病性維氏氣單胞菌卵黃抗體。步驟(2)對免疫后每間隔7d收集的雞蛋，無菌條件下分離出卵黃，80g/L聚乙二醇-8 000 (PEG-8 000)—步法提純卵黃抗體，ELISA測定抗體效價，第四次免疫后ELISA測定的卵黃抗體效價為I :12560。步驟(4)中噴霧干燥的進風(fēng)溫度為120°C _140°C，出風(fēng)溫度為 68 0C -72 0C ο
步驟(3)中高速勻漿轉(zhuǎn)速為9500r/min，時間為10_20min。保藏編號為CCTCC No M2012154的暗紋東方飩源致病性維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii) SY-R2通過下列步驟的選育方法得到取具有典型癥狀、死亡后一小時內(nèi)的暗紋東方飩的心臟、肝臟病灶進行細菌分離培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基平板，30°C培養(yǎng)24h，選取優(yōu)勢菌在TSA平板上進行純培養(yǎng)直至菌落純，獲得致病菌株；所述典型癥狀為腹部膨大，肛門紅腫，體表及胸鰭、腹鰭和臀鰭殘缺、基部充血、出血、解剖時有大量淡黃色帶血的水樣腹水；肝臟腫大，呈土黃色，有大小不一的出血斑塊；膽囊膨大；腸道無食，充滿泡沫狀粘液，腸粘膜出血。
權(quán)利要求
1.一種抗暗紋東方飩源致病性維氏氣單胞菌卵黃抗體的制備方法，其特征是包括下列步驟 (1)將保藏編號為CCTCCNo M2012154的暗紋東方飩源致病性維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)SY_R2劃線接種大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基平板,37°C培養(yǎng)24h,挑取單菌落涂布于直徑15cm的TSA平板，于37°C培養(yǎng)20h ;用無菌PBS洗下菌苔，測定并調(diào)整菌液濃度為2. 5X1010CFU/mL ;純檢合格后按O. 5%福爾馬林液37°C滅活24h，無菌檢驗合格后供制備抗原；每5重量份滅活菌液加入滅菌的氫氧化鋁膠I重量份，加入相當于滅活菌液和氫氧化鋁膠總重量O. 01%的硫柳汞防腐，得到菌苗； (2)免疫程序28周齡羅曼蛋雞進行翅靜脈采血作為對照血清，開產(chǎn)后收集雞蛋作為實驗對照；開產(chǎn)后第3天，用步驟(I)制備的菌苗胸肌多點注射免疫，劑量O. 5mL/只；首次免疫后I周進行第二次免疫，免疫劑量I. OmL/只；第二次免疫后每隔20d加強免疫，連續(xù)免疫2次，免疫劑量均為I. OmL/只；第四次免疫后40d，再進行免疫，免疫劑量為2. OmL/只；從首次免疫開始，每次免疫后7天翅靜脈采血分離血清，并收集所有雞蛋，對免疫后每間隔7d收集的雞蛋進行效價測定；用微量凝集法初步測定免疫雞血清和卵黃中抗體的有無； (3)卵黃液的預(yù)處理收集第四次免疫后雞蛋，用清水刷拭干凈后浸于O.5%新潔爾滅中消毒、涼干，于無菌條件下分離出卵黃，加入I. 5倍體積的生理鹽水，高速勻漿制備乳濁液； (4)卵黃粉的制備將經(jīng)步驟(3)預(yù)處理的卵黃液進行噴霧干燥，制得卵黃粉，其中IgY即抗暗紋東方飩源致病性維氏氣單胞菌卵黃抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的抗暗紋東方飩源致病性維氏氣單胞菌卵黃抗體的制備方法，其特征是步驟(2)對免疫后每間隔7d收集的雞蛋，無菌條件下分離出卵黃，80g/L聚乙二醇-8000 —步法提純卵黃抗體，ELISA測定抗體效價，第四次免疫后ELISA測定的卵黃抗體效價為I : 12560。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的抗暗紋東方飩源致病性維氏氣單胞菌卵黃抗體的制備方法，其特征是步驟(4)中噴霧干燥的進風(fēng)溫度為120°C _140°C，出風(fēng)溫度為68°C _72°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求I、2或3所述的抗暗紋東方飩源致病性維氏氣單胞菌卵黃抗體的制備方法，其特征是步驟(3)中高速勻漿轉(zhuǎn)速為9500r/min，時間為10_20min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的抗暗紋東方飩源致病性維氏氣單胞菌卵黃抗體的制備方法，其特征是保藏編號為CCTCC No M2012154的暗紋東方飩源致病性維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii) SY-R2通過下列步驟的選育方法得到取具有典型癥狀、死亡后一小時內(nèi)的暗紋東方飩的心臟、肝臟病灶進行細菌分離培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基平板，30°C培養(yǎng)24h，選取優(yōu)勢菌在TSA平板上進行純培養(yǎng)直至菌落純，獲得致病菌株；所述典型癥狀為腹部膨大，肛門紅腫，體表及胸鰭、腹鰭和臀鰭殘缺、基部充血、出血、解剖時有大量淡黃色帶血的水樣腹水；肝臟腫大，呈土黃色，有大小不一的出血斑塊；膽囊膨大；腸道無食，充滿泡沫狀粘液，腸粘膜出血。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗暗紋東方鲀源致病性維氏氣單胞菌卵黃抗體的制備方法，包括制備菌苗、免疫程序、卵黃液的預(yù)處理、卵黃粉的制備等步驟。本發(fā)明易操作，效果好，對免疫后每間隔7d收集的雞蛋進行效價測定，第四次免疫后ELISA測定的效價可達112560，進一步制成的卵黃抗體粉效價不變。
文檔編號C07K16/12GK102718866SQ20121018110
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月4日
發(fā)明者劉思園, 常燕, 徐磊, 曹軍, 王兆慧, 金大勇 申請人:南通大學(xué)