專利名稱：一種分離水牛奶中酪蛋白組分的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分離水牛奶中酪蛋白組分的方法，尤其是一種通過簡單エ藝同時(shí)將a S-酪蛋白、酪蛋白和K -酪蛋白分離的方法。
背景技術(shù)：
水牛奶中乳蛋白主要由酪蛋白和乳清蛋白組成，其中以雜交高代為例，asl-酪蛋白、a s2-酪蛋白、β -酪蛋白、K -酪蛋白分別占酪蛋白的35. 30%、16. 97%、33. 88%、13. 85%，a -乳清蛋白、β -乳球蛋白分別占乳清蛋白的30. 95%、48. 49%。酪 蛋白以酪蛋白膠束結(jié)合磷酸鈣形成的復(fù)合體形式存在，稱為“酪蛋白酸鈣-磷酸鈣復(fù)合體”(Ca-phosphocaseinate或 Ca-caseinate-phospnhate-complate)0近幾十年來，為了研究酪蛋白膠束體系的穩(wěn)定機(jī)制，以及各酪蛋白組分的結(jié)構(gòu)功能特性，分離純化酪蛋白組分是開展上述研究的基礎(chǔ)，分離純化的效率和質(zhì)量直接關(guān)系后續(xù)多項(xiàng)工作的成敗，因此成為研究的熱點(diǎn)。目前酪蛋白組分的分離方法主要包括沉淀分離、層析分離、膜分離以及酶法分離等，其中，層析分離主要用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，而膜分離以及酶法分離一般都需要結(jié)合其他方法共同完成分離步驟，應(yīng)用最為廣泛的是沉淀分離，主要是利用各酪蛋白組分在不同溫度、離子強(qiáng)度，鈣濃度的溶液中溶解性的不同進(jìn)行分離，分離過程主要關(guān)注目標(biāo)產(chǎn)物的得率以及純度，但對(duì)其分離過程的系統(tǒng)研究較少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種分離水牛奶中酪蛋白組分的方法，能夠同時(shí)分離as-酪蛋白、β_酪蛋白和K-酪蛋白，并且操作簡單，分離效果明顯，適宜エ業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種分離水牛奶中酪蛋白組分的方法，包括以下步驟①新鮮水牛奶，于8000g、4°C下離心脫脂20 30min后，采用等電點(diǎn)緩慢酸沉的方法，用酸溶液緩慢調(diào)節(jié)脫脂后牛奶的PH至4. 5^4. 7，于8000g、4°C下離心20 30min保留沉淀，蒸餾水洗滌2次，即得到粗制酪蛋白粉末，凍干備用；②將等電點(diǎn)緩慢酸沉，凍干后得到的酪蛋白粉末配制成2%的酪蛋白溶液，采用堿溶液緩慢調(diào)節(jié)酪蛋白溶液的PH至7. (Γ7. 5 ；③按照O. 06mol的Ca2+濃度在步驟②酪蛋白溶液中加入ニ價(jià)可溶性鈣鹽，在8000g下離心20 30min，保留上清液和沉淀，將沉淀溶于こニ胺四こ酸ニ鈉溶液中，透析后凍干即獲得質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)91. 6%的a s-酪蛋白；④在步驟③離心保留的上清液中繼續(xù)加入ニ價(jià)可溶性鈣鹽，使Ca2+濃度終濃度到達(dá)O. 3mol，再次離心，保留上清液和沉淀，上清液透析凍干后獲得質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)43. 3%的K -酪蛋白，將沉淀溶于こニ胺四こ酸ニ鈉溶液中，透析后凍干即獲得質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)100%的β-酪蛋白。所述酪蛋白為水牛奶及水牛奶制品的酪蛋白。
所述水牛奶為摩拉純種水牛奶、摩拉雜交一代水牛奶、摩拉雜交高代水牛奶；所述水牛奶制品為水牛奶酸乳、水牛奶干酪、水牛奶乳粉。所述ニ價(jià)可溶性鈣鹽為氯化鈣。所述こニ胺四こ酸ニ鈉溶液為こニ胺四こ酸ニ鈉配制成O. 06 O. 3mol溶液。所述酸溶液為冰こ酸或鹽酸配制成O. 05 O. Imol溶液。所述堿溶液為氫氧化鈉或氨水配制成O. I O. 2mol溶液。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)I.本發(fā)明采用分級(jí)鈣沉對(duì)a S-酪蛋白、β-酪蛋白和K-酪蛋白三種酪蛋白組分進(jìn)行了同步分離，操作エ藝簡單，為較大規(guī)模分離酪蛋白組分提供一種簡單可行的方法，一方面為實(shí)驗(yàn)室制備樣品提供了參考，同時(shí)對(duì)大規(guī)模エ業(yè)化制備也具有一定的借鑒意義，為后續(xù)エ業(yè)應(yīng)用提供了便利。2.本發(fā)明制取的as-酪蛋白、β-酪蛋白和K-酪蛋白純度高，為試劑型a s-酪蛋白、β -酪蛋白的生產(chǎn)提供了方法，同時(shí)該エ藝采用的試劑很少，節(jié)約了制備成本。3.本發(fā)明制取的a S-酪蛋白、β-酪蛋白和K -酪蛋白得率均較高，能夠有效利用資源。


圖I為等電點(diǎn)緩慢酸沉后得到的酪蛋白電泳圖。I-低分子量蛋白標(biāo)品2-脫脂后的水牛奶全蛋白3-等電點(diǎn)緩慢酸除去酪蛋白后的乳清蛋白4-等電點(diǎn)緩慢酸沉得到的酪蛋白，上樣濃度均稀釋至lOOOyg/mL，上樣量
10 μし圖2為分級(jí)鈣沉后得到的酪蛋白電泳圖。I-低分子量蛋白標(biāo)品，2-、3_、4-、5-、6-、7_ 分別為 O. 30mol、0. 25mol、O. 20mol、O. 15mol,0. 10mol、0.06molCa2+處理酪蛋白后沉淀溶解液，8-、9-、10_、11_、12_、13-分別為 O. 30mol、0. 25mol、0. 20mol、0. 15mol、0. IOmol>0. 06mol Ca2+處通釀蛋白后上清液，上樣濃度均稀釋至1000 μ g/mL,上樣量10 μし圖3為采用考馬斯亮藍(lán)法得到的蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)驗(yàn)對(duì)酪蛋白組分的分離效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。I、等電點(diǎn)緩慢酸沉粗分酪蛋白效果的評(píng)價(jià)為了評(píng)價(jià)等電點(diǎn)緩慢酸沉后酪蛋白的純度，我們采用SDS-PAGE對(duì)脫脂后牛乳中的蛋白組成及等電點(diǎn)緩慢酸沉后沉淀及上清液中的蛋白組成進(jìn)行了對(duì)比分析。結(jié)果見圖I。由圖I可知，圖I中泳道2的全蛋白經(jīng)等電點(diǎn)緩慢酸沉后，基本上可以將水牛奶中的牛血清蛋白及乳清蛋白全部除去，得到如圖I中泳道4的粗酪蛋白，而牛血清蛋白和乳清蛋白等雜質(zhì)留在酸沉酪蛋白后的如圖I中泳道3的酸乳清中。該方法操作簡單，分離效果良好，適宜規(guī)?；a(chǎn)。2、分級(jí)鈣沉酪蛋白組分效果的評(píng)價(jià)為了評(píng)價(jià)各種鈣鹽濃度下酪蛋白組分的分離情況，我們采用SDS-PAGE和考馬斯、亮藍(lán)法對(duì) O. 06mol、0. IOmol、0· 15mol、0. 20mol、0. 25mol、0. 30molCa2+ 處通后的釀蛋白組分進(jìn)行了純度和得率分析。結(jié)果見圖2、圖3和表I。從圖2中可以看出，Ca2+濃度達(dá)到O. 06mol時(shí)，酪蛋白中的as-酪蛋白已完全沉淀，并有β_酪蛋白也同時(shí)發(fā)生沉淀，且沉淀物中除了以上兩種酪蛋白組分外，牛血清蛋白也發(fā)生完全沉淀。同時(shí)，在0.06mol-0. 30mol Ca2+濃度處理酪蛋白沉淀溶解液的電泳條帶中，O. 06molCa2+濃度出現(xiàn)微弱的κ -酪蛋白條帶，隨著Ca2+濃度不斷加大，κ -酪蛋白條帶反而不斷減弱，尤其是當(dāng)Ca2+濃度達(dá)到O. 20mol時(shí)，κ-酪蛋白條帶幾乎消失。在O. 06mol-0. 30molCa2+濃度處理酪蛋白的上清液中，主要含有β-酪蛋白和κ-酪蛋白兩條帶，且隨著Ca2+濃度的逐漸増大，β_酪蛋白條帶逐漸減弱，與考馬斯亮藍(lán)測定上清液中蛋白質(zhì)含量變化趨勢(shì)相一致。根據(jù)以上現(xiàn)象，可以判斷，通過Ca2+沉淀酪蛋白三種組分的先后 次序?yàn)棣?s-酪蛋白最先I丐沉，其次是β -酪蛋白，最后是K -酪蛋白。由圖2還可看出，K-酪蛋白在極低的0.06mol Ca2+濃度存在條件下，開始發(fā)生沉淀，隨Ca2+濃度的不斷増大，K-酪蛋白反而溶解，不再沉淀析出。這與as-酪蛋白遇鈣沉淀，引起K-酪蛋白的交聯(lián)沉淀有夫。在Ca2+處理后酪蛋白上清液的所有條帶中均不含有牛血清蛋白，而都含有條帶很弱的β_乳球蛋白、α-乳白蛋白，說明牛血清蛋白對(duì)Ca2+非常敏感，很低的濃度即發(fā)生沉淀，而β_乳球蛋白和α -乳白蛋白對(duì)Ca2+卻有一定的耐受能力。表I各等級(jí)鈣沉組分中酪蛋白的質(zhì)量
Ca-濃.iHU (K Miol O,IOmol 0.15mol 12Umol 0.25mol ().3umol
酪蛋白含量上清液 0.381 0.354 0.335 0.323 0.305 0.284 Cg)沉淀 0.505 0.533 0.549 0.567 0.582 0.603
酪蛋白得率上清液 38.1 35.4 33,5 32.3 30.5 28.4 (%)沉淀 50.5 53.3 54.9 56.7 58.2 60.3
酪蛋白總回收率(％)88.6 88.7 88.4 89.0 88.7 88.7
_ 蛋白 ft 率( )=き·^^^^^^^^普!根據(jù)表1，可以明顯看出，在O. 06mol_0. 30mol Ca2+濃度處理酪蛋白的上清液中，蛋白質(zhì)質(zhì)量逐步減少，結(jié)合電泳圖譜，該過程上清液中主要組分為酪蛋白和K-酪蛋白，而沉淀中K-酪蛋白析出量小，說明該過程主要發(fā)生β-酪蛋白的沉淀反應(yīng)。據(jù)此可以提出ー種簡單分離β -酪蛋白的方法——二次鈣沉法即先采用O. 06mol Ca2+濃度處理酪蛋白，離心棄沉淀，即棄去a s-酪蛋白，保留上清液，添加ニ價(jià)可溶性鈣鹽，使Ca2+終濃度達(dá)到O. 3mol，再次離心，保留沉淀，將沉淀溶入こニ胺四こ酸ニ鈉溶液中，攪拌使其充分溶解，透析后即可得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)100%的β -酪蛋白。
為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)各鈣鹽濃度處理酪蛋白后，各酪蛋白組分中的as-酪蛋白、β -酪蛋白和K -酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，我們采用以下計(jì)算方法對(duì)其進(jìn)行估算如果忽略沉淀中的牛血清蛋白和K -酪蛋白以及上清液中的乳清蛋白，根據(jù)a s-酪蛋白、酪蛋白和K -酪蛋白在水牛奶中的比例3. 77:2. 45:1，結(jié)合分級(jí)鈣沉酪蛋白總回收率，可以估算沉淀以及上清液中各種酪蛋白組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)比例，以沉淀中a s-酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為例A1=B1 X B2 X B3式中A1為沉淀中a S-酪蛋白質(zhì)量；B1為酪蛋白總質(zhì)量；B2為酪蛋白總回收率；B3為理論上酪蛋白中a S-酪蛋白所占的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。
權(quán)利要求
1.一種分離水牛奶中酪蛋白組分的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟 ①新鮮水牛奶，于8000g、4°c下離心脫脂20 30min后，采用等電點(diǎn)緩慢酸沉的方法，用酸溶液緩慢調(diào)節(jié)脫脂后牛奶的PH至4. 5^4. 7，于8000g、4°C下離心20 30min保留沉淀，蒸餾水洗滌2次，即得到粗制酪蛋白粉末，凍干備用； ②將等電點(diǎn)緩慢酸沉，凍干后得到的酪蛋白粉末配制成2%的酪蛋白溶液，采用堿溶液緩慢調(diào)節(jié)酪蛋白溶液的PH至7. (Γ7. 5 ； ③按照O.06mol的Ca2+濃度在步驟②得到的酪蛋白溶液中加入二價(jià)可溶性鈣鹽，于8000g、4°C下離心20 30min，保留上清液和沉淀，將沉淀溶于乙二胺四乙酸二鈉溶液中，透析后凍干即獲得質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)91. 6%的a s-酪蛋白； ④在步驟③離心保留的上清液中繼續(xù)加入二價(jià)可溶性鈣鹽，使Ca2+濃度終濃度到達(dá)O.3mol，再次離心，保留上清液和沉淀，上清液透析凍干后獲得質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)43. 3%的κ -酪蛋白，將沉淀溶于乙二胺四乙酸二鈉溶液中，透析后凍干即獲得質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)100%的β-酪蛋白。
2.如權(quán)利要求I所述的分離水牛奶中酪蛋白組分的方法，其特征在于所述酪蛋白為水牛奶及水牛奶制品的酪蛋白。
3.如權(quán)利要求2所述的分離水牛奶中酪蛋白組分的方法，其特征在于所述水牛奶為摩拉純種水牛奶、摩拉雜交一代水牛奶、摩拉雜交高代水牛奶；所述水牛奶制品為水牛奶酸乳、水牛奶干酪、水牛奶乳粉。
4.如權(quán)利要求2所述的分離水牛奶中酪蛋白組分的方法，其特征在于所述二價(jià)可溶性鈣鹽為氯化鈣。
5.如權(quán)利要求2所述的分離水牛奶中酪蛋白組分的方法，其特征在于所述乙二胺四乙酸二鈉溶液為乙二胺四乙酸二鈉配制成O. 06 O. 3mol溶液。
6.如權(quán)利要求2所述的分離水牛奶中酪蛋白組分的方法，其特征在于所述酸溶液為冰乙酸或鹽酸配制成O. 05 O. Imol溶液。
7.如權(quán)利要求2所述的分離水牛奶中酪蛋白組分的方法，其特征在于所述堿溶液為氫氧化鈉或氨水配制成O. I O. 2mol溶液。
全文摘要
一種分離水牛奶中酪蛋白組分的方法，以水牛奶為原料，采用等電點(diǎn)緩慢酸沉，再結(jié)合分級(jí)鈣沉的方法對(duì)水牛奶中αs-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白三種酪蛋白組分進(jìn)行了分離。分級(jí)鈣沉酪蛋白各組分的總回收率達(dá)到88%，其中分離后的αs-酪蛋白和β-酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別達(dá)到91.6%和67.8%，κ-酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)也由13.8%提高至43.3%，為進(jìn)一步純化奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)在理論上，若采用二次分級(jí)鈣沉的技術(shù)路線可將β-酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高至100%。該方法操作簡單，分離效果明顯，適宜工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07K14/47GK102675448SQ20121018739
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月8日
發(fā)明者李全陽, 李紅, 楊同香 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)