專(zhuān)利名稱(chēng)：一種通過(guò)纖維形成片段來(lái)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)形成淀粉樣纖維的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和生物化學(xué)相關(guān)領(lǐng)域，涉及通過(guò)將含有纖維形成片段的多肽與目標(biāo)蛋白融合表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白質(zhì)形成淀粉樣纖維的方法。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)是具有多種生物學(xué)活性的生物大分子，能夠執(zhí)行包括催化，分子識(shí)別，抗原，抗體等功能。酶大多數(shù)由蛋白質(zhì)組成。酶的催化效率非常高，如果能夠在化工和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，將會(huì)給相關(guān)領(lǐng)域帶來(lái)非常重要的突破。但是有很多因素限制了酶的廣泛使用，其中一個(gè)很重要的因素就是酶制備成本高但是穩(wěn)定性不夠高，所以工業(yè)成本比較大。
蛋白質(zhì)工程的一個(gè)非常核心的目的就是對(duì)蛋白質(zhì)屬性的定向改造，所使用的手段包括通過(guò)基因工程的方法改變蛋白質(zhì)的氨基酸組成成分，通過(guò)共價(jià)，包埋，吸附等方法來(lái)固定化酶，通過(guò)共價(jià)修飾來(lái)改變抗體的屬性等等。然而到目前為止還沒(méi)有找到能夠廣泛使用的對(duì)蛋白質(zhì)的活性沒(méi)有影響的固定蛋白質(zhì)的方法。我們研究發(fā)現(xiàn)，將不同的纖維形成片段插入到蛋白質(zhì)中，蛋白質(zhì)會(huì)表現(xiàn)出多樣化的聚集屬性，包括聚集的濁度，分散程度和形態(tài)。也就是說(shuō)，可以通過(guò)將不同的纖維形成片段插入到蛋白質(zhì)中，來(lái)控制蛋白質(zhì)的聚集屬性。

發(fā)明內(nèi)容
本專(zhuān)利所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種誘導(dǎo)蛋白質(zhì)形成淀粉樣纖維的方法。該方法具體為選擇可以獨(dú)立生長(zhǎng)蛋白質(zhì)淀粉樣纖維的多肽序列，即纖維形成片段；用分子克隆的方法將纖維形成片段插入目標(biāo)蛋白質(zhì)的柔性結(jié)構(gòu)和溶劑可及區(qū)域，然后誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白質(zhì)形成淀粉樣纖維。所述的纖維形成片段包括但不局限于序列為SNQNNF，SSTSAA, GVATVA, SQAIIH,NHVTLS, IFQINS, DFNKFH, NNQQNY, QQQQQQ, STVITE, AAAAAA 的多聚氨基酸片段。所述目標(biāo)蛋白質(zhì)包括但不局限于酶，結(jié)構(gòu)蛋白，抗原，抗體在內(nèi)蛋白質(zhì)單體。所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的柔性結(jié)構(gòu)和溶劑可及區(qū)域是指目標(biāo)蛋白質(zhì)中的折疊或α-螺旋等規(guī)則二級(jí)結(jié)構(gòu)之間的環(huán)狀結(jié)構(gòu)區(qū)。不同的纖維形成片段具有不同的特征，這些特征包括纖維形成片段的長(zhǎng)度，帶電性，極性，疏水性，ROSETTADESIGN能量函數(shù)值，形成疏水拉鏈結(jié)構(gòu)的方向。這些特征對(duì)蛋白質(zhì)的聚集屬性有非常重要的影響。例如，將來(lái)自人溶菌酶的纖維形成片段IFQINS插入到Tau蛋白中之后，蛋白質(zhì)能夠形成很特別的纖維，這些纖維的濁度低，但是纖維所含有的β_折疊結(jié)構(gòu)比較多，纖維的形態(tài)規(guī)則，在溶液中分散得很好，難以發(fā)生沉淀。這種特性的纖維就是非常好的納米材料。纖維形成片段插入蛋白質(zhì)的位置也對(duì)融合蛋白的纖維特征有著重要的影響。將纖維形成片段插入到蛋白質(zhì)中的β_折疊或α-螺旋等規(guī)則二級(jí)結(jié)構(gòu)之間的環(huán)狀結(jié)構(gòu)區(qū)，這樣纖維形成片段就可以暴露在蛋白質(zhì)的外面，使得它們之間的相互作用成為可能。用多肽鏈將纖維形成片段 和目標(biāo)蛋白偶聯(lián)到一起，這種起連接作用的多肽不能具有強(qiáng)烈的形成β_折疊和α-螺旋結(jié)構(gòu)的趨向，從而保證纖維形成片段能夠暴露在溶液的外圍，有比較多的相互接觸，形成疏水拉鏈結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)聚集誘導(dǎo)的方式的選擇。不同的蛋白質(zhì)聚集的溶液條件是不相同的。例如，Tau蛋白需要在肝素、核酸或者其他帶負(fù)電的分子存在的情況下形成纖維狀聚集。本發(fā)明的有益效果在于蛋白質(zhì)淀粉樣纖維是一種良好的納米材料，是有序重復(fù)排列的蛋白質(zhì)分子，它非常穩(wěn)定，能抗酸，抗堿，抗蛋白酶消化，能穩(wěn)定存在比較長(zhǎng)的時(shí)間；淀粉樣纖維能夠攜帶其他生物大分子，使之聚集在其表面，形成超級(jí)高的局部濃度，有放大酶聯(lián)反應(yīng)信號(hào)等優(yōu)勢(shì)；蛋白質(zhì)纖維通過(guò)分子生物學(xué)的方法很容易編輯和構(gòu)建，也可以方便地與其他具有生物活性的蛋白質(zhì)偶聯(lián)在一起；蛋白質(zhì)纖維的聚集是很容易控制的，如果沒(méi)有添加適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)劑，蛋白質(zhì)纖維是不能夠形成的。本發(fā)明方法是在醫(yī)學(xué)，化工等領(lǐng)域有比較重要的應(yīng)用前景。


圖I為插入IFQINS后Tau蛋白形成的一種長(zhǎng)而且彎曲的蛋白質(zhì)淀粉樣纖維。圖2為插入GVATVA后Tau蛋白形成的一種長(zhǎng)而且分支的蛋白質(zhì)淀粉樣纖維。圖3為插入NNQQNY后Tau蛋白形成的一種長(zhǎng)而且成束的蛋白質(zhì)淀粉樣纖維。圖4為插入QQQQQQ后Tau蛋白形成的一種短的蛋白質(zhì)淀粉樣纖維。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :使用IFQINS來(lái)使Tau蛋白形成長(zhǎng)而且彎曲的蛋白質(zhì)淀粉樣纖維。I、利用分子克隆方法將纖維形成片段IFQINS插入到Tau244_372/ Δ PHF6/ Δ PHF6*的PHF6的位置上。2、蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化將構(gòu)建好的突變的質(zhì)粒，加入到200 μ I的BL21感受態(tài)細(xì)胞中去，冰浴30分鐘，42°C熱擊90秒，加800 μ I LB培養(yǎng)基培養(yǎng)I個(gè)小時(shí)，涂平板，在37°C條件下培養(yǎng)過(guò)夜。次日挑單菌落于5ml含終濃度為100 μ M氨卞青霉素的LB管中在37°C、200轉(zhuǎn)/分鐘的震蕩速率中活化過(guò)夜。接種至2L每瓶體積為250ml含終濃度為100 μ M氨卞青霉素的LB培養(yǎng)基中。于37°C、200轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速的搖床中培養(yǎng)至OD6tltl = O. 6-1. 0，加入終濃度為O. 4mM IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，同樣的條件下培養(yǎng)3小時(shí)，12000g離心10分鐘，棄上清，收集沉淀為菌體。用80ml的buffer A (含有2mM DTT的50mM磷酸緩沖液pH 6. 8)重懸后，用250W超聲波處理30分鐘。加入NaCl至終濃度為500mM，沸水煮10分鐘。此時(shí)，由于Tau蛋白及其突變體具有耐熱性，因此仍然存在于溶液中，其他的雜蛋白經(jīng)過(guò)變性，沉淀下來(lái)。17000g 4°C離30min,溫度為4°C,取上清過(guò)濾,裝入透析袋中，用磷酸緩沖液(bufferA)在4°C環(huán)境下攪拌充分透析過(guò)夜，中途換一次透析液。15000g、4°C，離心30min，取上清，過(guò)濾，上樣至陽(yáng)離子交換色譜(SP sepharose)。用3 5床體積的buffe A洗去非特異蛋白以及核酸，直到紫外信號(hào)穩(wěn)定在O. 01以下。之后用超過(guò)6倍體積的含NaCl梯度(O 400mM)的buffer A洗脫目的蛋白。用SDS-PAGE檢測(cè)蛋白質(zhì)純化情況。收集洗脫峰，用超濾管濃縮蛋白至為5 10mg/ml。再次用緩沖液充分透析后，通過(guò)測(cè)定214nm紫外吸收來(lái)確定Tau蛋白的濃度，分裝后于_80°C保存待用。3、用濁度法檢測(cè)Tau蛋白的聚集過(guò)程和分散程度用50mM pH 7. 5Tris_HCl緩沖液配制DTT與heparin儲(chǔ)存液，濃度分別為200mM和250 μ Μ。檢測(cè)體系為500ml體積，Tau蛋白、DTT和heparin的終濃度分別為50 μ M、2mM和2· 5 μ Μ,緩沖液為50mM pH 7. 5Tris_HCl緩沖液。紫外波長(zhǎng)為350nm，檢測(cè)溫度為37°C，檢測(cè)時(shí)間為12h。4、用透射電鏡法檢測(cè)纖維的形態(tài)配制500 μ I體積的反應(yīng)體系，其中Tau蛋白、DTT和heparin的終濃度分別為8 μ M、2mM和2. 5 μ Μ。緩沖液為50mM pH 7. 5Tris_HCl緩沖液。于37°C，220轉(zhuǎn)/分鐘的搖床中震蕩。待纖維長(zhǎng)出后，取10μ I滴于銅網(wǎng)上，吸附2分鐘，用濾紙將溶液吸干，加8 μ I醋酸雙氧鈾，染色2分鐘。置于濾紙上使其自然干燥，于透射電子顯微鏡下檢測(cè)。
實(shí)施例2 :使用GVATVA來(lái)使Tau蛋白形成長(zhǎng)而且分支的蛋白質(zhì)淀粉樣纖維。具體操作辦法與方案I的區(qū)別僅在于插入的片段是GVATVA。實(shí)施例3 :使用NNQQNY來(lái)使Tau蛋白形成長(zhǎng)而且成束的蛋白質(zhì)淀粉樣纖維。具體操作辦法與方案I的區(qū)別僅在于插入的片段是NNQQNY。實(shí)施例4 :使用QQQQQQ來(lái)使Tau蛋白形成短的蛋白質(zhì)淀粉樣纖維。具體操作辦法與方案I的區(qū)別僅在于插入的片段是QQQQQQ。
權(quán)利要求
1.一種誘導(dǎo)蛋白質(zhì)形成淀粉樣纖維的方法，其特征在于選擇可以獨(dú)立生長(zhǎng)蛋白質(zhì)淀粉樣纖維的多肽序列，即纖維形成片段；用分子克隆的方法將纖維形成片段插入目標(biāo)蛋白質(zhì)的柔性結(jié)構(gòu)和溶劑可及區(qū)域，然后誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白質(zhì)形成淀粉樣纖維。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的纖維形成片段包括序列為SNQNNF，SSTSAA, GVATVA, SQAIIH, NHVTLS, IFQINS, DFNKFH, NNQQNY, QQQQQQ, STVITE 或 AAAAAA 的多聚氨基酸片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述目標(biāo)蛋白質(zhì)包括酶、結(jié)構(gòu)蛋白、抗原或抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的柔性結(jié)構(gòu)和溶劑可及區(qū)域是目標(biāo)蛋白質(zhì)中的折疊或α-螺旋之間的環(huán)狀結(jié)構(gòu)區(qū)。
全文摘要
本專(zhuān)利書(shū)公開(kāi)了一種通過(guò)纖維形成片段來(lái)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)生長(zhǎng)淀粉樣纖維的方法。選擇可以獨(dú)立生長(zhǎng)蛋白質(zhì)淀粉樣纖維的多肽序列，即纖維形成片段；用分子克隆的方法將纖維形成片段插入目標(biāo)蛋白質(zhì)的柔性結(jié)構(gòu)和溶劑可及區(qū)域，然后誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白質(zhì)形成淀粉樣纖維。該方法在醫(yī)學(xué)，化工等領(lǐng)域有比較重要的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C07K19/00GK102719468SQ20121019062
公開(kāi)日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月11日
發(fā)明者孟生榮, 朱應(yīng)竹, 梁毅, 莫重瑛, 郭童, 陳杰 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)