專利名稱：一種抗凝血多肽的制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于藥物化學技術領域，涉及一種抗凝血多肽的制備方法，尤其涉及一種比伐盧定的制備方法。
背景技術：
比伐盧定(Bival irudin, Angiomax)是人工合成抗凝藥物,其抗凝成分為水蛭素衍生物C端20個氨基酸殘基的肽，結(jié)構(gòu)序列為D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OHo 比伐盧定屬于強有力的凝血酶直接抑制劑，可通過結(jié)合于催化劑位點和循環(huán)及凝血酶血塊的陰離子輸出位點而直接抑制凝血酶。早期的臨床研究表明比伐盧定抗凝治療效果確切，且出血事件的發(fā)生率較低，和傳統(tǒng)的 肝素抗凝治療相比使用更為安全，是近年來臨床應用較廣的凝血酶抑制劑。目前關于比伐盧定的制備方法，國內(nèi)外已有大量報道。中國專利200910028793. 7報道了采用全液相方法合成比伐盧定，首先逐步合成三個全保護片段N-端全保護6肽、中間全保護6肽、C-端全保護8肽，然后將三個片段一次偶聯(lián)，脫除保護基后得到比伐盧定粗品，再經(jīng)過高效液相色譜純化，得到比伐盧定純品。中國專利200910051311公開了一種比伐盧定的Fmoc固相順序合成方法，采用王樹脂為起始樹脂，依次接入保護氨基酸，所得肽樹脂采用三氟乙酸酸解得到比伐盧定粗品。US20070093423報道了一種比伐盧定的制備方法，其采用的是片段縮合方法得到粗品，經(jīng)HPLC純化得到比伐盧定精肽的純度大于98. 5%，總雜小于I. 5%，單雜小于I. 0%，[Asp9-比伐盧定]小于O. 5%。但上述專利都難以解決比伐盧定合成過程中固有的、難以去除的雜質(zhì)問題。比伐盧定結(jié)構(gòu)中含有一個-Gly-Gly-Gly-Gly片段，在依次偶聯(lián)-Gly過程中，由于Gly自身特性，極易在主峰前后產(chǎn)生Bivalirudin-Gly和Bivalirudin+Gly的雜質(zhì),這兩個雜質(zhì)在后續(xù) 分離時很難去除。同時，由于Asn-Gly結(jié)構(gòu)的存在，Asn在堿性條件下(脫除Fmoc基團)易變構(gòu)成為Asp。中國專利201110170669和中國專利201110144317均采用了Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH作為反應原料來解決上述Gly雜質(zhì)的問題。但是,上述專利方法不能解決Asn的變構(gòu)問題，而且，反應原料需要自制，步驟繁瑣，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。據(jù)報道，現(xiàn)階段不管采用何種合成技術，合成得到的粗品中或多或少含有難除去的 Bivalirudin-Gly> Bivalirudin+Gly、Asp9_Bivalirudin、D-Phe 12-Bivalirudin 和D-Tyrl9-Bivalirudin等雜質(zhì)，均無法達到藥品要求的純度，因而需要進行精制純化。目前報道或公開的純化方法較少。中國專利201110144317. 9公開一個兩步純化加一步轉(zhuǎn)鹽的HPLC純化方法，但該方法純化步驟多，成本較高；US20070093423報道的比伐盧定的制備方法經(jīng)HPLC純化得到比伐盧定精肽的純度僅大于98. 5 %，Asp9-Bivalirudin也僅小于O. 5%，結(jié)果都不理想。因此比伐盧定的純化是制備工藝中的難點，尤其公斤級以上大規(guī)模制備純化已成為制約比伐盧定產(chǎn)業(yè)化的瓶頸之一。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術的缺陷，提供一種成本低廉、工藝過程簡單、樣品雜質(zhì)少且穩(wěn)定可控的比伐盧定的制備方法，所述制備方法制得的比伐盧定精肽的收率高、純度高,適合于比伐盧定的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術方案一種比伐盧定的制備方法，采用反相/弱陽離子交換混合模式HPLC方法純化比伐盧定粗肽，然后采用反相HPLC方法轉(zhuǎn)鹽，收集溶液凍干即得到比伐盧定。比伐盧·定為等電點約3. 7的兩性物質(zhì)，粗肽中含有Bivalirudin-Gly、Bivalirudin+Gly、Asp9-Bivalirudin> D-Phe 12-Bivalirudin 和 D-Tyrl9_Bivalirudin 等難分離雜質(zhì)。本發(fā)明通過采用反相/弱陽離子交換混合模式HPLC方法純化，可以一次性利用疏水性和帶電性差異將粗肽中的雜質(zhì)很好的分離而去除。然后利用反相HPLC方法轉(zhuǎn)成三氟乙酸鹽API，提高了產(chǎn)品的收率和純度，同時操作簡便，有利于實現(xiàn)規(guī)?；闹苽洹Ｗ鳛閮?yōu)選，本發(fā)明所述反相/弱陽離子交換混合模式HPLC方法的固定相為表面同時鍵合有十八烷基和弱陽離子交換基團的色譜填料。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述反相/弱陽離子交換混合模式HPLC方法的流動相A為含有5-10v/v%乙腈的10-50mmol/L磷酸鹽緩沖溶液。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述反相/弱陽離子交換混合模式HPLC方法的流動相B為含有30-50v/v%乙腈的10-50mmol/L磷酸鹽和200_500mmol/L堿金屬鹽的緩沖溶液。其中，作為優(yōu)選，所述磷酸鹽為磷酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸銨或磷酸二氫銨中的一種或幾種。進一步的，作為優(yōu)選，所述堿金屬鹽為鈉鹽或鉀鹽。更優(yōu)選的，為氯化鈉、氯化鉀、醋酸鈉、醋酸鉀、磷酸鈉或磷酸鉀中的一種或幾種。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述反相/弱陽離子交換混合模式HPLC方法的流動相A的緩沖溶液 pH 為 I. 5-3. 5。。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述反相/弱陽離子交換混合模式HPLC方法的流動相B的緩沖溶液 pH 為 6. 0-8.0。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述反相HPLC方法轉(zhuǎn)鹽的固定相為十八烷基硅烷或八烷基硅烷鍵合硅膠。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述反相HPLC方法轉(zhuǎn)鹽的流動相A為O. 05-0. 20v/v%H氟乙酸溶液。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述反相HPLC方法轉(zhuǎn)鹽的流動相B為色譜純乙腈。在一些實施例中，本發(fā)明所述比伐盧定的制備方法，所述比伐盧定粗肽的制備方法包括以下步驟I)采用固相合成方法制備肽樹脂片段A :Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-樹脂；2)采用固相合成方法制備肽樹脂片段B NH2-Asn (Trt) -Gly-Asp (OtBu) -Phe-Glu(OtBu) -Glu (OtBu) -Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-樹脂；3)裂解肽樹脂片段A，得到全保護肽片段后，采用固相方法與片段B偶聯(lián)，得到比伐盧定肽樹脂片段；
4)切割試劑裂解比伐盧定肽樹脂片段，得到比伐盧定粗肽。本發(fā)明通過合適的片段位點的選擇，使在堿性條件下易產(chǎn)生雜質(zhì)的氨基酸Asn處于氨基組分的末端，減少了與堿性溶液DBLK接觸的次數(shù)，有效的降低了 Asn變構(gòu)的產(chǎn)生。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述步驟I)中固相合成方法制備片段A的固相載體為CTC樹脂。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述步驟I)中片段A中-Gly-Gly-Gly-Gly-結(jié)構(gòu)米用的合成原料為Fmoc-Gly-Gly-OH。即Fmoc-Gly-Gly-OH與CTC樹脂偶聯(lián)后，然后再與Fmoc-Gly-Gly-OH 進行偶聯(lián),從而得到-Gly-Gly-Gly-Gly-結(jié)構(gòu)。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述步驟I)中Fmoc-Gly-Gly-OH與CTC樹脂偶聯(lián)后，所得的替代度范圍為O. 6 I. Ommol/go更優(yōu)選為O. 8mmol/g ；作為優(yōu)選，本發(fā)明所述步驟2)中固相合成方法制備片段B的固相載體為王樹脂； 作為優(yōu)選，本發(fā)明所述步驟2)中固相合成方法制備片段B中第一個氨基酸Leu與Wang樹脂偶聯(lián)后的替代度為0. 6 0. 8mmol/g。更優(yōu)選為0. 7mmol/g作為優(yōu)選，本發(fā)明所述步驟3)中裂解片段A的試劑為TFE與DCM體積比為1:4的混合溶液；作為優(yōu)選，本發(fā)明所述步驟3)中片段A與片段B偶聯(lián)的試劑為HATU、HOAt和DIPEA，其中 HATU, HOAt 與 DIPEA 的摩爾比 3-5:3. 15-6:6-10。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述步驟4)中的切割試劑為三氟乙酸、苯甲硫醚、三異丙基硅烷和水的混合試劑，其中所述混合試劑中三氟乙酸占88-92v/v%，苯甲硫醚占2-4v/v%、三異丙基硅烷占3-6v/v%，余量為水。更優(yōu)選為三氟乙酸、苯甲硫醚、三異丙基硅烷與水的體積比為 90:4:3:3。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明所述制備方法操作簡單、成本低、比伐盧定克收率高，適合于比伐盧定大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，并且制得的比伐盧定純度高、雜質(zhì)含量低，具有可觀的經(jīng)濟實用價值和廣泛的應用前景。


圖I示本發(fā)明總的工藝流程圖；圖2示實施例17比伐盧定固體精肽檢測色譜圖。
具體實施例方式本發(fā)明實施例公開了一種抗凝血多肽的制備方法。本領域技術人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術。為了進一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進行詳細說明。其中，Wang樹脂和2-CTC樹脂購自天津南開和成有限公司，反相/弱陽離子交換混合模式固定相購自中國科學院大連化物所，各種保護氨基酸購自吉爾生化有限公司，其它溶劑和試劑為普通市售品。說明書和權利要求書中所使用英文縮寫的含義列于下表中
權利要求
1.ー種比伐盧定的制備方法，其特征在于，采用反相/弱陽離子交換混合模式HPLC方法純化比伐盧定粗肽，然后采用反相HPLC方法轉(zhuǎn)鹽，收集溶液凍干即得到比伐盧定。
2.根據(jù)權利要求I所述制備方法，其特征在于，所述反相/弱陽離子交換混合模式HPLC方法的固定相為表面同時鍵合有十八烷基和弱陽離子交換基團的色譜填料。
3.根據(jù)權利要求I所述制備方法，其特征在于，所述反相/弱陽離子交換混合模式HPLC方法的流動相A為含有5-10v/v%こ腈的10-50mmol/L磷酸鹽緩沖溶液。
4.根據(jù)權利要求I所述制備方法，其特征在于，所述反相/弱陽離子交換混合模式HPLC方法的流動相B為含有30-50v/v%こ腈的10-50mmol/L磷酸鹽和200-500mmol/L堿金屬鹽的緩沖溶液。
5.根據(jù)權利要求3所述制備方法，其特征在于，所述反相/弱陽離子交換混合模式HPLC方法的流動相A的緩沖溶液pH為I. 5-3. 5。
6.根據(jù)權利要求4所述制備方法，其特征在干，所述反相/弱陽離子交換混合模式HPLC方法的流動相B的緩沖溶液pH為6. 0-8. O。
7.根據(jù)權利要求I所述制備方法，其特征在于，所述反相HPLC方法轉(zhuǎn)鹽的固定相為十八烷基硅烷或八烷基硅烷鍵合硅膠。
8.根據(jù)權利要求I所述制備方法，其特征在于，所述反相HPLC方法轉(zhuǎn)鹽的流動相A為O.05-0. 20v/v%三氟こ酸溶液。
9.根據(jù)權利要求I所述制備方法，其特征在于，所述反相HPLC方法轉(zhuǎn)鹽的流動相B為色譜純こ腈。
10.根據(jù)權利要求I所述制備方法，其特征在于，所述比伐盧定粗肽的制備方法包括以下步驟 1)采用固相合成方法制備肽樹脂片段ABoc-D-Phe-Pro-Arg (Pbf) -Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-樹脂； 2)采用固相合成方法制備肽樹脂片段BNH2-Asn (Trt) -Gly-Asp (OtBu) -Phe-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-樹脂； 3)裂解肽樹脂片段A，得到全保護肽片段后，采用固相方法與片段B偶聯(lián)，得到比伐盧定肽樹脂片段； 4)切割試劑裂解比伐盧定肽樹脂片段，得到比伐盧定粗肽。
11.根據(jù)權利要求10所述制備方法，其特征在于，所述步驟I)中固相合成方法制備片段A的固相載體為CTC樹脂。
12.根據(jù)權利要求10所述制備方法，其特征在于，所述步驟I)中片段A中-Gly-Gly-Gly-Gly-結(jié)構(gòu)采用的合成原料為Fmoc-Gly-Gly-OH。
13.根據(jù)權利要求10所述制備方法,其特征在于,所述步驟I)中Fmoc-Gly-Gly-OH與CTC樹脂偶聯(lián)后，所得的替代度為O. 6 I. Ommol/g。
14.根據(jù)權利要求10所述制備方法，其特征在于，所述步驟2)中固相合成方法制備片段B的固相載體為王樹脂。
15.根據(jù)權利要求10所述制備方法，其特征在于，所述步驟2)中固相合成方法制備片段B中第一個氨基酸Leu與Wang樹脂偶聯(lián)后的替代度為O. 6 O. 8mmol/g。
16.根據(jù)權利要求10所述制備方法，其特征在于，所述步驟3)中裂解片段A的試劑為TFE與DCM體積比為1:4的混合溶液。
17.根據(jù)權利要求10所述制備方法，其特征在于，所述步驟3)中片段A與片段B偶聯(lián)的試劑為 HATU, HOAt 和 DIPEA，其中 HATU, HOAt 與 DIPEA 的摩爾比 3-5:3. 15-6:6-10。
18.根據(jù)權利要求10所述制備方法，其特征在于，所述步驟4)中的切割試劑為三氟こ酸、苯甲硫醚、三異丙基硅烷和水的混合試劑，所述混合試劑中氟こ酸占88-92v/v%，苯甲硫醚占2-4v/v%、三異丙基硅烷占3-6v/v%，余量為水。
全文摘要
本發(fā)明屬于藥物化學技術領域，涉及一種抗凝血多肽的制備方法，公開了一種比伐盧定的制備方法。該方法采用反相/弱陽離子交換混合模式HPLC方法純化比伐盧定粗肽，然后采用反相HPLC方法轉(zhuǎn)鹽，收集溶液凍干即得到比伐盧定。本發(fā)明所述制備方法操作簡單、成本低，比伐盧定克收率高，適合于比伐盧定大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，可以一次性利用疏水性和帶電性差異將粗肽中的雜質(zhì)很好的分離而去除，制得的比伐盧定純度高、雜質(zhì)含量低，具有可觀的經(jīng)濟實用價值和廣泛的應用前景。
文檔編號C07K1/20GK102702325SQ20121020314
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月19日 優(yōu)先權日2012年6月19日
發(fā)明者宓鵬程, 袁建成, 覃亮政, 馬亞平 申請人:深圳翰宇藥業(yè)股份有限公司