專利名稱：定點突變和定點修飾的病毒膜蛋白、其制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
發(fā)明涉及在水泡性口炎病毒的包膜蛋白G (VSV G)基因的特定位點引入琥珀密碼子TAG，利用正交的氨酰tRNA合成酶-tRNA將具有光交聯(lián)性質(zhì)的非天然氨基酸DiZPK定點突變到VSV G的特定位點。在病毒與宿主細胞相互作用過程中，用365nm紫外光引發(fā)DiZPK的光交聯(lián)反應(yīng)，在VSV G與相互作用蛋白間形成共價鍵，避免了相互作用的解離，為病毒與宿主間蛋白相互作用的研究提供有力的手段。
背景技術(shù)：
水泡件口炎病毒及其臘蛋白VSVG水泡性口炎病毒(VSV)是彈狀病毒科(Rhabdoviridae)的一種，其是單負鏈RNA包 膜病毒，基因組大小在11，000-12，000個堿基；編碼5個蛋白質(zhì)分子L蛋白，磷酸蛋白，M蛋白，N蛋白，G蛋白；這五種蛋白的組成VSV結(jié)構(gòu)如圖I所示。其中G蛋白(VSV G)被命名為III型病毒融合蛋白，在病毒表面形成釘狀三聚體結(jié)構(gòu)，介導(dǎo)病毒與宿主細胞受體的識別和宿主細胞對病毒的內(nèi)吞，以及病毒包膜與宿主細胞膜的融合，在VSV的感染過程中起到首要作用。VSV G (Indiana)共有495個氨基酸殘基，其中N端的446個氨基酸殘基在病毒膜外，該部分也是病毒抗體的識別區(qū)域。編碼VSVG基因的序列AAGTTCACCATAGTTTTTCCACACAACCAAAAAGGAAACTGGAAAAATGTTCCTTCTAATTACCATTATTGCCCGTCAAGCTCAGATTTAAATTGGCATAATGACTTAATAGGCACAGCCTTACAAGTCAAAATGCCCAAGAGTCACAAGGCTATTCAAGCAGACGGTTGGATGTGTCATGCTTCCAAATGGGTCACTACTTGTGATTTCCGCTGGTATGGACCGAAGTATATAACACATTCCATCCGATCCTTCACTCCATCTGTAGAACAATGCAAGGAAAGCATTGAACAAACGAAACAAGGAACTTGGCTGAATCCAGGCTTCCCTCCTCAAAGTTGTGGATATGCAACTGTGACGGATGCCGAAGCAGTGATTGTCCAGGTGACTCCTCACCATGTGCTGGTTGATGAATACACAGGAGAATGGGTTGATTCACAGTTCATCAACGGAAAATGCAGCAATTACATATGCCCCACTGTCCATAACTCTACAACCTGGCATTCTGACTATAAGGTCAAAGGGCTATGTGATTCTAACCTCATTTCCATGGACATCACCTTCTTCTCAGAGGACGGAGAGCTATCATCCCTGGGAAAGGAGGGCACAGGGTTCAGAAGTAACTACTTTGCTTATGAAACTGGAGGCAAGGCCTGCAAAATGCAATACTGCAAGCATTGGGGAGTCAGACTCCCATCAGGTGTCTGGTTCGAGATGGCTGATAAGGATCTCTTTGCTGCAGCCAGATTCCCTGAATGCCCAGAAGGGTCAAGTATCTCTGCTCCATCTCAGACCTCAGTGGATGTAAGTCTAATTCAGGACGTTGAGAGGATCTTGGATTATTCCCTCTGCCAAGAAACCTGGAGCAAAATCAGAGCGGGTCTTCCAATCTCTCCAGTGGATCTCAGCTATCTTGCTCCTAAAAACCCAGGAACCGGTCCTGCTTTCACCATAATCAATGGTACCCTAAAATACTTTGAGACCAGATACATCAGAGTCGATATTGCTGCTCCAATCCTCTCAAGAATGGTCGGAATGATCAGTGGAACTACCACAGAAAGGGAACTGTGGGATGACTGGGCACCATATGAAGACGTGGAAATTGGACCCAATGGAGTTCTGAGGACCAGTTCAGGATATAAGTTTCCTTTATACATGATTGGACATGGTATGTTGGACTCCGATCTTCATCTTAGCTCAAAGGCTCAGGTGTTCGAACATCCTCACATTCAAGACGCTGCTTCGCAACTTCCTGATGATGAGAGTTTATTTTTTGGTGATACTGGGCTATCCAAAAATCCAATCGAGCTTGTAGAAGGTTGGTTCAGTAGTTGGAAAAGCTCTATTGCCTCTTTTTTCTTTATCATAGGGTTAATCATTGGACTATTCTTGGTTCTCCGAGTTGGTATCCATCTTTGCATTAAATTAAAGCACACCAAGAAAAGACAGATTTATACAGACATAGAGATGAACCGACTTGGAAAGTGA (SEQ ID NO :1)VSVG蛋白氨基酸序列MKCLLYLAFLFIGVNCKFTIVFPHNQKGNWKNVPSNYHYCPSSSDLNWHNDLIGTALQVKMPKSHKAIQADGWMCHASKWVTTCDFRWYGPKYITHSIRSFTPSVEQCKESIEQTKQGTWLNPGFPPQSCGYATVTDAEAVIVQVTPHHVLVDEYTGEWVDSQFINGKCSNYICPTVHNSTTWHSDYKVKGLCDSNLISMDITFFSEDGELSSLGKEGTGFRSNYFAYETGGKACKMQYCKHWGVRLPSGVWFEMADKDLFAAARFPECPEGSSISAPSQTSVDVSLIQDVERILDYSLCQETffSKIRAGLPISPVDLSYLAPKNPGTGPAFTIINGTLKYFETRYIRVDIAAPILSRMVGMISGTTTERELffDDffAPYEDVEIGPNGVLRTSSGYKFPLYMIGHGMLDSDLHLSSKAQVFEHPHIQDAASQLPDDESLFFGDTGLSKNPIELVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK (SEQ ID NO :2)病毒蛋白相互作用病毒是人類面臨的重大威脅之一，在病毒的進化過程中，不斷產(chǎn)生基因的變異和 蛋白的改變，產(chǎn)生新的病毒亞型，從而獲得在動物和人之間傳播的能力，進而可能引發(fā)嚴重全球性傳染病。人類對病毒研究和抗病毒的實驗從未停止，病毒與宿主間蛋白相互作用是抗病毒藥物研究在重要靶點，目前，用于病毒與宿主間蛋白相互作用的研究方法大致有cDNA文庫技術(shù)；噬菌體展示技術(shù)；酵母雙雜交技術(shù)；免疫沉淀和免疫共沉淀技術(shù)；病毒蛋白鋪覆蛋白免疫印跡技術(shù)等。而以上的研究的蛋白間相互作用是以非共價鍵結(jié)合的形式存在的，例如鹽鍵、疏水作用等，在蛋白質(zhì)發(fā)揮生物功能，特別是在受體識別與信號傳遞過程中，蛋白質(zhì)間的結(jié)合是弱結(jié)合并且動態(tài)變化的，因此用傳統(tǒng)的蛋白間相互作用的研究方法，往往無法解決蛋白間瞬時作用和弱作用的難題，病毒與宿主間蛋白相互作用正是難題之
O密碼子擴展技術(shù)Lei Wang等人開發(fā)了基因密碼子擴展技術(shù)，實現(xiàn)了在活細胞內(nèi)位點特異性地將非天然氨基酸插入到蛋白質(zhì)分子中。基因密碼子擴展技術(shù)體系中包含三個要素氨酰tRNA合成酶(Aminoacyl-tRNA synthetase, aaRS)、tRNA 和非天然氨基酸(Unnatural AminoAcids, UAA)，它們?nèi)唛g是生物正交關(guān)系，即三者是一一對應(yīng)關(guān)系，編碼UAA的tRNA不能被內(nèi)源性的aaRS識別，只能被引入的aaRS識別；aaRS也不能識別內(nèi)源性的tRNA和氨基酸，只能識別引入的tRNA和UAA。引入的tRNA通過識別在目標蛋白基因上定點突變的TAG密碼子，將非天然氨基酸插入到蛋白的特異位點上(見圖2)。

發(fā)明內(nèi)容
本課題針對傳統(tǒng)的蛋白-蛋白相互研究方法無法有效地研究病毒與宿主間蛋白弱相互作用和瞬時相互作用這一難題，通過基因密碼子擴展技術(shù)，將非天然氨基酸DiZPK定點引入到VSV G蛋白中，并實現(xiàn)了定點突變VSVG的細胞內(nèi)表達，定點突變的非天然氨基酸DiZPK具有光交聯(lián)特性，根據(jù)這一特性可以通過光交聯(lián)技術(shù)將定點突變的VSVG蛋白上的非天然氨基酸與相互作用蛋白轉(zhuǎn)化為共價鍵結(jié)合蛋白，之后通過分離純化、質(zhì)譜鑒定，獲得潛在的與VSV G相互作用的蛋白。簡而言之，本發(fā)明提供了在VSVG蛋白上定點突變引入光敏感的非天然氨基酸，在細胞內(nèi)表達突變后的VSVG后能夠通過光照使所述突變蛋白與在細胞內(nèi)的結(jié)合蛋白以共價鍵結(jié)合，為發(fā)現(xiàn)VSVG新的結(jié)合蛋白提供了有效手段。
具體地，本發(fā)明提供了下述技術(shù)方案在本發(fā)明的一個實施方案中，結(jié)合VSV G的蛋白晶體結(jié)構(gòu)和蛋白的疏水性分析，在VSV G的膜外部分的24個不同的位點引入琥珀密碼子TAG，通過定點突變的方式構(gòu)建能夠位點特異地編碼光交聯(lián)非天然氨基酸DiZPK的VSV G表達質(zhì)粒。在本發(fā)明另外一個實施方案中，在已構(gòu)建的VSV G表達質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，進一步在VSV G的C端加入Flag標簽，為VSV G及光交聯(lián)復(fù)合物的分離純化提供親和純化手段。在本發(fā)明的一個實施方案中，使定點突變的編碼DiZPK的VSV G蛋白能夠在293T細胞中高效表達，用VSV抗體和Flag抗體同時檢測；發(fā)現(xiàn)編碼DiZPK的VSV G蛋白的高效表達，為研究與VSV G相互作用蛋白奠定了基礎(chǔ)。在本發(fā)明另外一個實施方案中，通過在293T細胞中表達位點特異性編碼DiZPK的VSV G蛋白，并通過紫外光照引發(fā)光交聯(lián)反應(yīng)，獲得VSV G與相互作用蛋白間的共價交聯(lián)產(chǎn) 物，通過蛋白免疫印跡鑒定的多個位點可以光交聯(lián)到蛋白。在本發(fā)明的一個實施方案中，通過免疫沉淀分離純化VSV G光交聯(lián)產(chǎn)物，并進行LC-MS/MS檢測。依據(jù)質(zhì)譜結(jié)果檢索到了多個蛋白分子，其中MAP4和Bip蛋白與VSV的生命周期相關(guān)，為進一步的研究提供了重要信息。在本發(fā)明另外一個實施方案中，將基因密碼子擴展技術(shù)運用到病毒包膜蛋白與宿主蛋白相互作用的研究中。更為具體地，在本發(fā)明的一個技術(shù)方案中，通過基因密碼子擴展技術(shù)成功地將DiZPK定點插入到VSV G的不同位置，用365nm紫外光引發(fā)光交聯(lián)反應(yīng)，通過對光交聯(lián)產(chǎn)物的分離純化，結(jié)合LC-MS/MS鑒定技術(shù)，發(fā)現(xiàn)4潛在的與VSV G蛋白能發(fā)生相互作用蛋白，包括Bip蛋白、MAP4蛋白、hnRNP U蛋白和NRPl蛋白，而此前已有研究表明Bip蛋白與VSVG相互作用，本發(fā)明中Bip蛋白發(fā)現(xiàn)，證明基因密碼子技術(shù)用于蛋白相互作用的研究是可行的；由研究報道MAP4蛋白、hnRNP U蛋白和NRPl蛋白分別參與病毒的生命過程，然而對于三種蛋白在VSV病毒生命周期中的作用未見報道，值得探索。更為具體地，本發(fā)明提供了下述技術(shù)方案I.定點突變的水泡性口炎病毒的VSV G蛋白，其在特定位點的I個氨基酸被突變
為非天然氨基酸，所述非天然氨基酸為
OCOOH所示的 DiZPK (也被稱之為
權(quán)利要求
1.定點突變的水泡性口炎病毒的VSVG蛋白，其在特定位點的I個氨基酸被突變?yōu)榉翘烊话被幔龇翘烊话被釣?br> 2.定點突變的VSVG蛋白，其與示于SEQ ID NO :I的序列的區(qū)別在于在SEQ ID NO I所示的序列的第N位的氨基酸被突變?yōu)長ys-diazirine，所述突變氨基酸與SEQ ID NO : I所示的序列的連接方式如下式所示
3.定點突變的VSVG蛋白，其與示于SEQ ID NO :1的序列的區(qū)別在于在SEQ ID NO:I所示的序列的第N位的氨基酸被突變?yōu)镈iZPK，所述突變氨基酸與SEQ ID NO :1所示的序列的連接方式如下式所示
4.編碼突變的VSVG蛋白的核酸分子，所述核酸分子與編碼SEQID NO :I的核酸分子SEQ ID NO 2的區(qū)別在于，其中編碼SEQ ID N O 1的第137位，Q42位，Y77位，Yl 16位，D121 位，V161 位，Y174 位，K242 位，R249 位，1339 位，R342 位，M346 位，N20 位，K172 位，D185位，P362位的氨基酸中的一個氨基酸的密碼子被突變?yōu)門AG。
5.核酸載體，其可操作地連接有權(quán)利要求5的核酸分子。
6.權(quán)利要求5的核酸載體，其還可操作地連接有標簽序列。
7.權(quán)利要求6的核酸載體，其中的標簽序列是Flag標簽序列。
8.宿主細胞,其中含有權(quán)利要求5- 7中任一項的核酸載體。
9.權(quán)利要求8的宿主細胞，其中還含有表達甲烷球菌的tRNA(tRNAPyl)和吡咯賴氨酰-tRNA合成酶(tRNAPyl)的質(zhì)粒。
10.權(quán)利要求8或9的宿主細胞，其為真核宿主細胞或原核宿主細胞。
11.定點修飾VSVG蛋白的方法，包括步驟 (1)選擇步驟在VSVG蛋白的氨基酸序列中選擇期望突變的一個或多個特定氨基酸位點； (2)基因突變將編碼對應(yīng)于(I)中選擇的位點的VSVG蛋白的氨基酸的密碼子用基因工程方法突變?yōu)槊艽a子TAG ； (3)表達載體構(gòu)建將(2)基因突變步驟得到的突變的VSVG蛋白的編碼序列與合適的載體可操作地連接，得到突變序列表達載體； (4)獲得pACYC-tRNA/PylRS質(zhì)粒從保藏日為2011年6月14日、保藏號為CGMCCNo 4951的大腸埃希氏菌pACYC-tRNA/PylRS中獲取質(zhì)粒pACYC-tRNA/PylRS質(zhì)粒， (5)表達將(3)得到的突變序列表達載體與(4)的pACYC-tRNA/PylRS質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染相同的宿主細胞，將轉(zhuǎn)染成功后的宿主細胞在含有DiZPK的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并在合適的條件下誘導(dǎo)表達； (6)對于能夠表達突變蛋白的宿主，對表達產(chǎn)物進行VSVG蛋白活性檢測，保留野生型VSV G蛋白80%以上活性的突變體設(shè)定為定點修飾候選物
12.使用權(quán)利要求I的定點突變VSVG蛋白的方法，其包括 (1)在細胞內(nèi)表達項目5- 7的載體，使之在合適的條件下表達項目I的定點突變VSVG蛋白； (2)所述細胞進行特定波長光照，使定點突變VSVG蛋白與胞內(nèi)的結(jié)合蛋白共價結(jié)合。
13.權(quán)利要求12的使用權(quán)利要求I的定點突變VSVG蛋白的方法，其還包括(3)分離并鑒定與定點突變VSV G蛋白共價結(jié)合的蛋白。
14.組合物或試劑盒，其中含有權(quán)利要求4的核酸分子或5-7中任一項的核酸載體。
15.權(quán)利要求4的核酸分子或者權(quán)利要求5-7中任一項的核酸載體在制備用于獲得結(jié)合蛋白的制劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明在水泡性口炎病毒的包膜蛋白G(VSV G)基因的特定位點引入琥珀密碼子TAG，利用正交的氨酰tRNA合成酶-tRNA將具有光交聯(lián)性質(zhì)的非天然氨基酸DiZPK定點突變到VSV G的特定位點。在病毒與宿主細胞相互作用過程中，用365nm紫外光引發(fā)DiZPK的光交聯(lián)反應(yīng)，在VSV G與相互作用蛋白間形成共價鍵，避免了相互作用的解離，為病毒與宿主間蛋白相互作用的研究提供有力的手段。
文檔編號C07K1/14GK102838663SQ201210214038
公開日2012年12月26日 申請日期2012年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月23日
發(fā)明者周德敏, 鄭永祥, 趙傳科, 張傳領(lǐng), 俞飛, 肖蘇龍, 張禮和 申請人:北京大學(xué)