一種高產(chǎn)率制備單葡萄糖醛酸甘草次酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種高產(chǎn)率制備單葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，屬于生物化學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明利用產(chǎn)生特異性葡萄糖醛酸酶的菌株為催化劑，以甘草酸為底物，在不斷攪拌通氣轉(zhuǎn)化反應(yīng)過(guò)程中，以某種大孔樹(shù)脂為分離介質(zhì)，移走產(chǎn)物單葡萄糖醛酸甘草次酸，釋放樹(shù)脂中吸附的底物甘草酸，與發(fā)酵液中未反應(yīng)的甘草酸一起流出樹(shù)脂柱，流回發(fā)酵罐繼續(xù)發(fā)酵。實(shí)現(xiàn)發(fā)酵、補(bǔ)料和產(chǎn)物分離三個(gè)過(guò)程同時(shí)耦合。通過(guò)維持發(fā)酵過(guò)程中適當(dāng)?shù)牡孜餄舛群洼^低的產(chǎn)物濃度，從而解除產(chǎn)物負(fù)反饋抑制及因產(chǎn)物和底物發(fā)酵液粘度過(guò)高不利于發(fā)酵的難題，顯著提高了底物的利用效率和單葡萄糖醛酸甘草次酸發(fā)酵產(chǎn)率，同時(shí)自動(dòng)化程度高。
【專利說(shuō)明】一種高產(chǎn)率制備單葡萄糖醛酸甘草次酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)率制備單葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，更具體涉及一種發(fā)酵與樹(shù)脂分離耦合制備單葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，屬于生物化學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]甘草酸是中國(guó)傳統(tǒng)藥材甘草中的主要藥理活性成分。國(guó)內(nèi)外對(duì)該中藥單體的研究始于19世紀(jì)，其具有抗炎癥、抗病毒、抗腫瘤、抗過(guò)敏等作用。而且它是一種甜味劑，甜度約是蔗糖的170倍。隨著研究的深入，上世紀(jì)80年代學(xué)者們發(fā)現(xiàn)不同生物中的β-葡萄糖醛酸苷酶作為催化劑在甘草酸的轉(zhuǎn)化中具有以下4種催化特性:(I)甘草酸一甘草次酸；(2)甘草酸一單葡萄糖醛酸甘草次酸一甘草次酸；(3)甘草酸一單葡萄糖醛酸甘草次酸:(4)單葡萄糖醛酸甘草次酸一甘草次酸。
[0003]其中單葡萄糖醛酸甘草次酸(GAMG)是利用葡萄糖醛酸苷酶催化甘草酸分子結(jié)構(gòu)中的末端糖苷鍵裂解，水解去一個(gè)葡萄糖醛酸分子而得到的。單葡萄糖醛酸甘草次酸極性介于甘草酸和甘草次酸之間，因此作為藥物其具有更好的跨膜運(yùn)輸能力，其在抗炎和抗過(guò)敏活性上等同或超甘草酸，還具有顯著的抗癌作用，并可以合成比甘草酸更具藥用價(jià)值的甘草次酸類(lèi)衍生物。同時(shí)單葡萄糖醛酸甘草次酸的甜度是甘草酸的5倍多(蔗糖的1000多倍)，目前市場(chǎng)上作為高端甜味劑開(kāi)發(fā)。綜上所述單葡萄糖醛酸甘草次酸具有比甘草酸更優(yōu)的生理和藥理活性。開(kāi)發(fā)出高產(chǎn)的單葡萄糖醛酸甘草次酸生產(chǎn)工藝具有良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)意義。
[0004]利用強(qiáng)酸強(qiáng)堿化學(xué)水解甘草酸制備單葡萄糖醛酸甘草次酸，收率低，酸堿溶劑消耗量大，產(chǎn)生的廢液、廢渣嚴(yán)重污染環(huán)境，運(yùn)行成本高，未見(jiàn)工業(yè)化應(yīng)用的報(bào)道。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)能夠轉(zhuǎn)化甘草酸為單葡萄糖醛酸甘草次酸的葡萄糖醛酸苷酶存在于腸道細(xì)菌、真菌和動(dòng)物組織等。國(guó)內(nèi)有魚(yú)紅閃、馮世江等人先后報(bào)道利用篩選得到的霉菌轉(zhuǎn)化獲得單葡萄糖醛酸甘草次酸，宋占科等克隆了產(chǎn)紫青霉(P.purpurogenum Li_3) β -葡萄糖醒酸苷酶,并在大腸桿菌中表達(dá)進(jìn)行轉(zhuǎn)化單葡萄糖醒酸甘草次酸；國(guó)外報(bào)道有采用微生物Sreptococcus LJ-22和Cryptococcus magnus MG-27進(jìn)行轉(zhuǎn)化單葡萄糖醒酸甘草次酸。也有利用純化獲得的葡萄糖醛酸苷酶來(lái)轉(zhuǎn)化單葡萄糖醛酸甘草次酸的報(bào)道，但步驟繁瑣，周期長(zhǎng)。
[0005]目前使用微生物細(xì)胞進(jìn)行甘草酸的生物轉(zhuǎn)化存在的主要問(wèn)題是:
[0006]1、生物催化劑主要為微生物細(xì)胞，過(guò)高的底物濃度，增加了培養(yǎng)基的滲透壓，不利于微生物的生長(zhǎng)和葡萄糖醛酸苷酶的積累 。
[0007]2、轉(zhuǎn)化產(chǎn)物單葡萄糖醛酸甘草次酸在發(fā)酵液不斷積累，對(duì)葡萄糖醛酸苷酶的反饋抑制作用增強(qiáng)，發(fā)酵液粘度增加，不利于轉(zhuǎn)化反應(yīng)的充分進(jìn)行。
[0008]因此需要?jiǎng)?chuàng)造適宜的發(fā)酵環(huán)境，既能解除產(chǎn)物的抑制又能增加底物的利用，同時(shí)保持酶轉(zhuǎn)化需要的生物量。李春等在專利號(hào)為201110344409.1名為《一種間歇補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)單葡萄醛酸基甘草次酸的方法》的發(fā)明專利中，使用分批補(bǔ)料添加底物甘草酸的間歇操作，雖然改善了底物的抑制，但底物利用率低、能耗高，而且沒(méi)有解決產(chǎn)物反饋抑制的問(wèn)題，導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)量難以進(jìn)一步提高，生產(chǎn)效率較低。
[0009]本發(fā)明提供的制備單葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，是采用產(chǎn)生特異性葡萄糖醛酸酶的菌株為催化劑，運(yùn)用發(fā)酵與樹(shù)脂分離耦合技術(shù)，獲得高產(chǎn)量的物單葡萄糖醛酸甘草次酸，具有效率高、成本低的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)重復(fù)性好，適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，目前未見(jiàn)相關(guān)專利和文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明為了解決上述問(wèn)題，提供一種高產(chǎn)率制備單葡萄糖醛酸甘草次酸的方法。本發(fā)明的技術(shù)方法包括如下步驟:
[0011](I)制備單葡萄糖醛酸甘草次酸發(fā)酵的種子培養(yǎng)液；
[0012](2)制備發(fā)酵培養(yǎng)基,在發(fā)酵罐中滅菌,冷卻后,接入步驟(1)中的種子培養(yǎng)液；
[0013](3)控制發(fā)酵罐中的發(fā)酵參數(shù)，發(fā)酵至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期；
[0014](4)將樹(shù)脂柱預(yù)先吸附一定量的甘草酸底物；
[0015](5)將發(fā)酵液在一定的流速下經(jīng)過(guò)過(guò)濾分離器過(guò)濾除菌，濾液流經(jīng)步驟(4)中的樹(shù)脂柱，再經(jīng)過(guò)無(wú)菌過(guò)濾重新流回發(fā)酵罐，繼續(xù)發(fā)酵，形成循環(huán)通路；
[0016](6)發(fā)酵結(jié)束后，將吸附了單葡萄糖醛酸甘草次酸的樹(shù)脂柱經(jīng)過(guò)洗脫，收集，濃縮，干燥，得單葡萄糖醛酸甘草次酸。
[0017]所述步驟(1)種子培養(yǎng)基制備由如下步驟組成:
[0018]①種子培養(yǎng)基為`pH5.0~7.0的含有碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽的常規(guī)液體培養(yǎng)基；斜面培養(yǎng)時(shí)添加1.8~2.5%的瓊脂，其中無(wú)機(jī)氮源包括各種銨鹽、硝酸鹽和氨水中的一種或者多種，有機(jī)氮源為蛋白胨，酵母膏，玉米漿或者牛肉膏中的一種或多種，無(wú)機(jī)鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、磷酸鹽、錳鹽中的一種或者多種；
[0019]②斜面培養(yǎng):將產(chǎn)單葡萄糖醛酸甘草次酸的菌株在斜面培養(yǎng)基中進(jìn)行劃線后，在溫度25~37°C培養(yǎng)24~360h，用于種子培養(yǎng)基接種或者菌株保存；
[0020]③發(fā)酵種子培養(yǎng):每100ml種子培養(yǎng)基接種3~5環(huán)，溫度25~37°C培養(yǎng)24~120h ；
[0021]上述培養(yǎng)基均經(jīng)過(guò)115°C，20min滅菌冷卻。
[0022]所述步驟(2)中，發(fā)酵培養(yǎng)基為pH5.0~7.0的含有底物甘草酸鹽、氮源、無(wú)機(jī)鹽的常規(guī)液體培養(yǎng)基，其中甘草酸鹽為鈉鹽，鉀鹽，鎂鹽，銨鹽中的一種或者幾種，濃度為
0.1g~80g/L ;氮源優(yōu)選無(wú)機(jī)氮源，包括各種銨鹽、硝酸鹽和氨水中的一種或者多種；發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)升溫，滅菌，然后將培養(yǎng)基冷卻，接入種子培養(yǎng)液的接種量占發(fā)酵培養(yǎng)基體積的2~10%，優(yōu)選5~8%。
[0023]所述步驟(3)中，發(fā)酵參數(shù)優(yōu)選溫度25~37°C ;發(fā)酵罐通氣量每分鐘0.1~1.5倍發(fā)酵液體積；攪拌轉(zhuǎn)速為150~300rpm。
[0024]所述步驟(4)中，使用樹(shù)脂為大孔吸附樹(shù)脂，類(lèi)別包括AB-8，NK_2，DM130中的一種；該樹(shù)脂對(duì)單葡萄糖醛酸甘草次酸的吸附力強(qiáng)于底物甘草酸，預(yù)先吸附一定量的底物甘草酸。待發(fā)酵液流入樹(shù)脂時(shí)，發(fā)酵液中產(chǎn)物單葡萄糖醛酸甘草次酸吸附上去，同時(shí)將甘草酸競(jìng)爭(zhēng)脫附流出，與未反應(yīng)底物一起流回發(fā)酵罐，繼續(xù)用于發(fā)酵轉(zhuǎn)化。樹(shù)脂用量并非量越大越好，在實(shí)際操作中，隨轉(zhuǎn)化持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)，雜菌污染幾率增大，發(fā)酵液中的固懸物增多，需要適時(shí)終止發(fā)酵，優(yōu)選樹(shù)脂與發(fā)酵液的體積比為0.9: I。本發(fā)明使用的某種大孔吸附樹(shù)月旨，是經(jīng)過(guò)大量的篩選，選擇出在多組分發(fā)酵液和一定PH條件下，能競(jìng)爭(zhēng)性吸附產(chǎn)物，取代低吸附性的甘草酸的一種大孔吸附樹(shù)脂。并非是常規(guī)的發(fā)酵后富集純化，而是在發(fā)酵過(guò)程中吸附發(fā)酵產(chǎn)物單葡萄糖醛酸甘草次酸的同時(shí)，釋放樹(shù)脂柱上吸附的甘草酸底物，作為補(bǔ)料底物，與發(fā)酵液中未反應(yīng)的甘草酸一起流出樹(shù)脂柱，流回發(fā)酵罐繼續(xù)發(fā)酵。實(shí)現(xiàn)發(fā)酵、補(bǔ)料和產(chǎn)物分離三個(gè)過(guò)程同時(shí)耦合，維持發(fā)酵過(guò)程中適當(dāng)?shù)牡孜餄舛群洼^低的產(chǎn)物濃度，從而解除產(chǎn)物負(fù)反饋抑制和因產(chǎn)物和底物發(fā)酵液粘度過(guò)高不利于發(fā)酵的難題，使得轉(zhuǎn)化持續(xù)徹底的進(jìn)行，延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，顯著提高了底物的利用效率和單葡萄糖醛酸甘草次酸發(fā)酵產(chǎn)率，同時(shí)自動(dòng)化程度高。
[0025]所述步驟(5)中，發(fā)酵液經(jīng)過(guò)過(guò)濾分離器過(guò)濾的流速為每小時(shí)0.01~0.2倍發(fā)酵液體積；使用的過(guò)濾分離器可以選用的過(guò)濾介質(zhì)包括無(wú)機(jī)分離膜(材質(zhì)是莫來(lái)石、氧化鋁等)，燒結(jié)的多孔合金，不銹鋼濾網(wǎng)。在實(shí)際操作中，隨轉(zhuǎn)化持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵液中的固懸物增多，可以同時(shí)啟動(dòng)高速反沖洗泵，沖洗去除濾網(wǎng)表面截留的菌體，防止阻塞。循環(huán)通路可以采用間歇方式或者連續(xù)方式:采用間歇方式時(shí)，每隔8~20小時(shí)進(jìn)行一次操作，每次持續(xù)8~24小時(shí)，循環(huán)3~10次；采用連續(xù)方式時(shí)，持續(xù)進(jìn)行120~240h至發(fā)酵結(jié)束。
[0026]所述步驟(6)樹(shù)脂洗脫劑為一定濃度的乙醇、甲醇、丙酮的水溶液，優(yōu)選為80%~95%濃度的乙醇。
[0027]本發(fā)明提供的葡萄糖醛酸甘草次酸的技術(shù)方案，是采用產(chǎn)生特異性葡萄糖醛酸酶的菌株為催化劑，以甘草酸為 底物，在不斷攪拌通氣轉(zhuǎn)化反應(yīng)過(guò)程中，以某種大孔樹(shù)脂為分離介質(zhì)，移走產(chǎn)物單葡萄糖醛酸甘草次酸，釋放樹(shù)脂中預(yù)先吸附的底物甘草酸，維持發(fā)酵體系相對(duì)高的底物濃度和較低的底物濃度，處理后獲得高產(chǎn)量的物單葡萄糖醛酸甘草次酸。具有效率高、成本低的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)重復(fù)性好，適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0028]以下實(shí)施例中所用的甘草酸鹽類(lèi)由江蘇天晟藥業(yè)有限公司研發(fā)中心提供，含量為73.4%。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)絕不局限于此。
[0029]實(shí)施例1
[0030](I)配制種子培養(yǎng)基:葡萄糖10g/L，酵母提取物2g/L，KH2PO4 lg/L,MgSO4 0.25g/L，瓊脂20g/L，溶劑為水，pH自然。斜面培養(yǎng)基在此配方中加入20g/L的瓊脂。以上培養(yǎng)基均在115°C滅菌20min。從冰箱保存的菌種斜面挑滿環(huán)菌苔，接種于新鮮斜面培養(yǎng)基，于30°C培養(yǎng)48h后，得到活化的種子斜面。將活化的斜面挑2環(huán)接種裝有40ml種子培養(yǎng)基的250ml三角瓶，于30°C、200rpm震蕩培養(yǎng)24h，獲得發(fā)酵種子液。
[0031](2)配制發(fā)酵培養(yǎng)基:甘草酸濃度 55g/L，KH2PO4 lg/L，尿素 10g/L，MgSO40.8g/L，溶劑為水；用酸堿控制PH6。在115°C滅菌20min。取60ml發(fā)酵種子液接種到裝有3L轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中
[0032](3)控制發(fā)酵罐溫度30°C,攪拌轉(zhuǎn)速250rpm,通氣2vvm。
[0033](4)樹(shù)脂柱裝1600g DM130樹(shù)脂，用95 %乙醇洗3個(gè)柱體積，水洗至無(wú)醇味，上樣吸附55g甘草酸單銨鹽。
[0034](5)待發(fā)酵72h后，啟動(dòng)過(guò)濾分離器和發(fā)酵液輸送泵(控制流速3ml/min)，分離菌體和濾液；將濾液流入樹(shù)脂柱，流出液經(jīng)過(guò)無(wú)菌過(guò)濾重新流回發(fā)酵罐，形成循環(huán)通路。發(fā)酵和分離循環(huán)持續(xù)進(jìn)行20h，完成一次半連續(xù)操作。間隔20h再操作一次。
[0035](6)完成5次發(fā)酵和分離循環(huán)后，用80% (v/v)的乙醇洗脫單葡萄糖醛酸甘草次酸，收集，濃縮，干燥，一共得到含量90.5%的單葡萄糖醛酸甘草次酸120.lg，摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到86.2%。發(fā)酵產(chǎn)率達(dá)到36.4g/L。
[0036]實(shí)施例2
[0037](I)配制種子培養(yǎng)基:葡萄糖20g/L，酵母提取物2g/L，KH2PO4 lg/L, MgSO4 0.8g/L，溶劑為水，pH自然。斜面培養(yǎng)基在此配方中加入20g/L的瓊脂。以上培養(yǎng)基均在115°C滅菌20min。先從冰箱保存的菌種斜面挑滿環(huán)菌苔，接種于新鮮斜面培養(yǎng)基，于28°C培養(yǎng)240h后，得到活化的種子斜面。將活化的斜面挑2環(huán)接種裝有40ml種子培養(yǎng)基的250ml三角瓶，于30°C、200rpm震蕩培養(yǎng)72h，獲得一級(jí)種子。用無(wú)菌吸管吸取5ml —級(jí)種子液接種到裝有80ml種子液的500ml搖瓶，于30°C、250rpm震蕩培養(yǎng)48h，獲得二級(jí)種子液。
[0038](2)配制發(fā)酵培養(yǎng)基:甘草酸濃度27g/L，KH2PO4 lg/L,氯化銨30g/L，MgSO40.8g/L，溶劑為水；用酸堿控制pH5.5。在115°C滅菌20min。取80ml發(fā)酵種子液接種到裝有3L轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中
[0039](3)控制發(fā)酵罐溫度28°C,攪拌轉(zhuǎn)速250rpm,通氣3vvm。
[0040](4)樹(shù)脂柱裝1200g NK-2樹(shù)脂，用95 %乙醇洗3個(gè)柱體積，水洗至無(wú)醇味，上樣吸附55g甘草酸單銨鹽。
[0041](5)待發(fā)酵48h后，啟動(dòng)過(guò)濾分離器和發(fā)酵液輸送泵(控制流速2.5ml/min)，分離菌體和濾液；將濾液流入樹(shù)脂柱，流出液經(jīng)過(guò)無(wú)菌過(guò)濾重新流回發(fā)酵罐，形成循環(huán)通路。連續(xù)發(fā)酵和分離耦合操作持續(xù)進(jìn)行120h。
[0042](6)發(fā)酵結(jié)束，用85% (v/v)的乙醇洗脫單葡萄糖醛酸甘草次酸，收集，濃縮，干燥，一共得到含量93.2 %的單葡萄糖醛酸甘草次酸77.1g,摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到91.6%。發(fā)酵產(chǎn)率達(dá)到24.lg/L。
[0043]實(shí)施例3
[0044](I)配制種子培養(yǎng)基:葡萄糖10g/L，酵母提取物2g/L，KH2PO4 lg/L, MgSO40.25g/L，瓊脂20g/L，溶劑為水，pH自然。斜面培養(yǎng)基在此配方中加入20g/L的瓊脂。以上培養(yǎng)基均在1151:滅菌201^11。先從冰箱保存的菌種斜面挑滿環(huán)菌苔，接種于新鮮斜面培養(yǎng)基，于28°C培養(yǎng)240h后，得到活化的種子斜面。將活化的斜面挑2環(huán)接種裝有40ml種子培養(yǎng)基的250ml三角瓶，于28°C、200rpm震蕩培養(yǎng)72h，獲得一級(jí)種子。用無(wú)菌吸管吸取5ml —級(jí)種子液接種到裝有80ml種子液的500ml搖瓶，于28°C、250rpm震蕩培養(yǎng)48h，獲得二級(jí)種子液。
[0045](2)配制發(fā)酵培養(yǎng)基:甘草酸濃度55g/L，葡萄糖20/L，KH2PO4 lg/L,尿素20g/L，MgSO40.8g/L，溶劑為水；用酸堿控制pH5.5。在115°C滅菌20min。取80ml發(fā)酵種子液接種到裝有3.5L轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中
[0046](3)控制發(fā)酵罐溫度28°C,攪拌轉(zhuǎn)速250rpm,通氣3vvm。
[0047](4)樹(shù)脂柱裝3100g NK-2樹(shù)脂，用95%乙醇洗3個(gè)柱體積，水洗至無(wú)醇味，上樣吸附220g甘草酸單銨鹽。
[0048](5)待發(fā)酵48h后，啟動(dòng)過(guò)濾分離器和發(fā)酵液輸送泵(控制流速3.5ml/min)，分離菌體和濾液；將濾液流入樹(shù)脂柱，流出液經(jīng)過(guò)無(wú)菌過(guò)濾重新流回發(fā)酵罐，形成循環(huán)通路。連續(xù)發(fā)酵和分離耦合操作持續(xù)進(jìn)行120h。
[0049](6)發(fā)酵結(jié)束，用85% (v/v)的乙醇洗脫單葡萄糖醛酸甘草次酸，收集，濃縮，干燥，一共得到含量88.2%單葡萄糖醛酸甘草次酸267.5g，底物的摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到86.2&。發(fā)酵產(chǎn)率達(dá)到6 7g/L。
【權(quán)利要求】
1.一種高產(chǎn)率制備單葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)制備單葡萄糖醛酸甘草次酸發(fā)酵的種子培養(yǎng)液； (2)制備發(fā)酵培養(yǎng)基,在發(fā)酵罐中滅菌,冷卻后,接入步驟(1)中的種子培養(yǎng)液； (3)控制發(fā)酵罐中的發(fā)酵參數(shù)，發(fā)酵至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期； (4)將樹(shù)脂柱預(yù)先吸附一定量的甘草酸底物； (5)將發(fā)酵液在一定的流速下經(jīng)過(guò)過(guò)濾分離器過(guò)濾除菌，濾液流經(jīng)步驟(4)中的樹(shù)脂柱，再經(jīng)過(guò)無(wú)菌過(guò)濾重新流回發(fā)酵罐，繼續(xù)發(fā)酵，形成循環(huán)通路； (6)發(fā)酵結(jié)束后，將吸附了單葡萄糖醛酸甘草次酸的樹(shù)脂柱經(jīng)過(guò)洗脫，收集，濃縮，干燥，得單葡萄糖醛酸甘草次酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(2)中發(fā)酵培養(yǎng)基的pH范圍為5.0~7.0 ;所用的甘草酸鹽為甘草酸鈉鹽、鉀鹽、銨鹽中的一種或者幾種，濃度為0.1g~80g/L ;接入種子培養(yǎng)液的接種量占發(fā)酵培養(yǎng)基體積的2~10%，優(yōu)選5~8%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(3)中的發(fā)酵參數(shù)為:溫度25~370C ;發(fā)酵罐通氣量每分鐘0.1~1.5倍發(fā)酵液體積；攪拌轉(zhuǎn)速為150~300rpm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(4)中吸附材料為大孔吸附樹(shù)脂，類(lèi)別包括AB-8，NK-2, DM130中的一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(5)中發(fā)酵液經(jīng)過(guò)過(guò)濾分離器過(guò)濾的流速為每小時(shí)0.01~0.2`倍發(fā)酵液體積；循環(huán)通路可以采用間歇方式或者連續(xù)方式:采用間歇方式時(shí)，每隔8~20小時(shí)進(jìn)行一次操作，每次持續(xù)8~24小時(shí)，循環(huán)3~10次；采用連續(xù)方式時(shí)，持續(xù)進(jìn)行120~240h至發(fā)酵結(jié)束。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的步驟(6)中采用的樹(shù)脂洗脫劑為一定濃度的乙醇、甲醇、丙酮的水溶液，優(yōu)選為80%~95%濃度的乙醇。
【文檔編號(hào)】C07H1/08GK103509843SQ201210218997
【公開(kāi)日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2012年6月29日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月29日
【發(fā)明者】魏元?jiǎng)? 楊永安, 易銘, 鐘慧, 金顯友, 袁繼文, 黃全書(shū), 季浩 申請(qǐng)人:江蘇天晟藥業(yè)有限公司