一種從細胞培養(yǎng)液中分離純化重組人凝血八因子的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從細胞培養(yǎng)液中分離純化重組人凝血八因子的方法，包括下列步驟：去除重組人凝血八因子細胞培養(yǎng)液中的細胞；將去除細胞的培養(yǎng)液超濾濃縮；將超濾濃縮的培養(yǎng)液經(jīng)陰離子交換層析、免疫親和層析或凝膠過濾層析中的一項或多項純化獲得純化的重組人凝血八因子；所述陰離子交換層析、免疫親和層析及凝膠過濾層析中所采用的平衡緩沖液及洗脫緩沖液中，均含有摩爾濃度為1-100mM的鈣離子及摩爾濃度為1-100mM的鋅離子。本發(fā)明通過在整個層析過程所用的緩沖液中添加鈣鋅離子的方法，有效解決了八因子的降解問題，使得整個純化操作能夠在常溫下進行，大大提高了工作效率，并且還提高了終產(chǎn)品的比活。
【專利說明】—種從細胞培養(yǎng)液中分離純化重組人凝血八因子的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物工程下游技術(shù)，尤其涉及從細胞培養(yǎng)液中分離純化重組人凝血八因子的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]凝血八因子，又稱為抗血友病因子，在內(nèi)源性凝血體系中具有十分重要的作用，是激活凝血因子IX的輔助因子。基因重組因子VDI (rFVDI)即重組人凝血八因子是第I個上市的重組凝血因子制品，1992年第一個重組人凝血八因子產(chǎn)品Baxter公司的Recombinate獲得FDA批準,后面陸續(xù)推出了 Bayer公司的Kogenate FS, Genetics Institute公司的ReFacto, 2003年FDA批準了 Baxter公司第二代產(chǎn)品Avate，2007年SFDA批準了首個國內(nèi)上市的rF VDI拜科奇。長達20年的臨床應(yīng)用表明，重組人凝血八因子與天然凝血八因子相比具有相似的生化、免疫及藥理學(xué)特性，能有效糾正血友病患者的出血傾向，具有良好的治療效果。
[0003]重組人凝血八因子的純化是八因子制備過程中的難點，主要是八因子穩(wěn)定性差，容易產(chǎn)生降解，從而失活。由于八因子的不穩(wěn)定性，早期的第一代重組人凝血八因子產(chǎn)品，Recombinate ,Kogenate FS等利用有血清培養(yǎng)基培養(yǎng),在純化中添加人血白蛋白做保護劑，防止八因子降解，第二代產(chǎn)品為了制備出無血清無蛋白的重組八因子產(chǎn)品，改進了部分純化工藝，很多文獻專利報道了在純化過程中緩沖液添加了氯化鈣，氯化鈉，組氨酸。也有一些報道添加了基礎(chǔ)氨基酸例如賴氨酸或者糖類例如蔗糖等，這些成分的添加都是為了維持無白蛋白保護的八因子的穩(wěn)定性。美國專利4877608提到了低離子強度，歐洲專利0314095緩沖液使用了高離子強度和組氨酸，美國專利5763401提到了添加蔗糖能保護八因子活性。但是，八因子的純化在添加了這些添加物后還需要在純化過程中嚴格控制低溫的環(huán)境，才可以更好的維持八因子的穩(wěn)定性。
[0004]因此，目前重組人凝血八因子的純化過程都是在低溫下進行，而且要求比較快速的處理細胞培養(yǎng)液，為了維持八因子的穩(wěn)定，一般會在層析分離純化的緩沖液中添加鈣離子等添加物用以保護八因子，防止八因子降解，但是如果八因子在純化過程中時間比較長(超過4小時)或者溫度控制不好(超過10度)，八因子會出現(xiàn)降解條帶，而且降解條帶很難通過層析的方法除去，所以從細胞培養(yǎng)液開始就維持八因子的穩(wěn)定性，防止八因子的降解就成為得到合格的重組人凝血八因子產(chǎn)品的關(guān)鍵。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供一種重組人凝血八因子的純化方法。
[0006]本發(fā)明提供了一種從細胞培養(yǎng)液中分離純化重組人凝血八因子的方法，包括下列步驟:
[0007]I)去除重組人凝血八因子細胞培養(yǎng)液中的細胞；[0008]2)將去除細胞的培養(yǎng)液超濾濃縮；
[0009]3)將超濾濃縮的培養(yǎng)液經(jīng)陰離子交換層析、免疫親和層析或凝膠過濾層析中的一項或多項純化獲得純化的重組人凝血八因子；
[0010]其中，步驟3)所述陰離子交換層析、免疫親和層析及凝膠過濾層析中所采用的平衡緩沖液，以及步驟3)所述陰離子交換層析和免疫親和層析的洗脫緩沖液中，均含有摩爾濃度為1-1OOmM的鈣離子及摩爾濃度為1-1OOmM的鋅離子，鈣離子與鋅離子的摩爾濃度優(yōu)選均為2-50mM，更優(yōu)選均為2-20mM，最優(yōu)選均為10mM。
[0011]其中，步驟3)在首次層析前，將超濾濃縮的培養(yǎng)液采用首次層析所用的平衡緩沖液以體積比1:2-1:50混合并再次超濾濃縮后，再進行層析。超濾濃縮的培養(yǎng)液與平衡緩沖液的體積比優(yōu)選1:5-1:50。
[0012]所述步驟I)中，
[0013]去除重組人凝血八因子的細胞培養(yǎng)液中的細胞的方法為現(xiàn)有技術(shù)，如微孔過濾、離心去除細胞等，具體如采用0.45微米膜過濾。
[0014]所述步驟2)中，
[0015]可米用截留分子量為10-300KD的超濾膜超濾濃縮，如米用截留分子量為30KD的超濾膜超濾濃縮。
[0016]所述步驟3) 中，
[0017]所述陰離子交換層析所用的層析柱可選自Q Sepharose FF陰離子交換層析柱、DEAE陰離子交換層析柱、Capto Q陰離子交換層析柱中的至少一種。優(yōu)選采用Q SepharoseFF陰離子交換層析柱和DEAE FF陰離子交換層析柱。
[0018]陰離子交換層析所用平衡緩沖液可由Tris-HCl緩沖液，磷酸鹽緩沖液，組氨酸緩沖液，HEPES緩沖液添加鈣離子源與鋅離子源獲得，優(yōu)選的配方為:含1-1OOmM的鈣離子，1-1OOmM的鋅離子，5-15mM L-組氨酸，200_400mM NaCl, pH 6.0_8.0的平衡緩沖液，如含1-1OOmM的氯化鈣，1-1OOmM的醋酸鋅，IOmM L-組氨酸，300mM NaCl，pH 7.0的平衡緩沖液。
[0019]陰離子交換層析所用洗脫緩沖液可為Tris-HCl緩沖液，磷酸鹽緩沖液，組氨酸緩沖液，HEPES緩沖液添加鈣離子源與鋅離子源獲得，優(yōu)選的配方為:含1-1OOmM的鈣離子，1-1OOmM的鋅離子，5-15mM L-組氨酸，600_800mM NaCl，pH6.0-8.0的洗脫緩沖液，如含l-100mol/L的氯化鈣，l-100mol/L的醋酸鋅，IOmM L-組氨酸，700mM NaCl, pH7.0的洗脫緩沖液。
[0020]所述陰離子交換層析的其他條件采用常規(guī)。
[0021]所述免疫親和層析所用的層析柱為偶聯(lián)有凝血八因子抗體的親和層析柱，此類層析柱可經(jīng)市售途徑獲得，如GE公司的八因子親和(V8 SELECT)層析柱。
[0022]免疫親和層析所用平衡緩沖液可為Tris-HCl緩沖液，磷酸鹽緩沖液，組氨酸緩沖液，HEPES緩沖液添加鈣離子源與鋅離子源獲得，優(yōu)選的配方為:含1-1OOmM的鈣離子，1-1OOmM 的鋅離子，5-15mM L-組氨酸，200-400mM NaCl, 0.01-0.03%(w/v
0.01-0.03g/100ml) Tween 80，ρΗ6.0-8.0 的平衡緩沖液，如含 1-1OOmM 的氯化鈣，1-1OOmM的醋酸鋅，IOmM L-組氨酸，300mM NaCl, 0.02%(w/v 0.02g/100ml) Tween 80，ρΗ7.0 的平衡緩沖液。
[0023]免疫親和層析所用洗脫緩沖液可為Tris-HCl緩沖液，磷酸鹽緩沖液，組氨酸緩沖液，HEPES緩沖液添加鈣離子源與鋅離子源獲得，優(yōu)選的配方為:含1-1OOmM的鈣離子，1-1OOmM 的鋅離子，5-15mM L-組氨酸，L 0-2.0M NaCl, 0.01-0.03%(w/V 0.01-0.03g/100ml) Tween 80，40-60%(v/v)乙二醇，ρΗ5.5-7.5 的洗脫緩沖液，如含 1-1OOmM 的氯化鈣，1-1OOmM 的醋酸鋅，20mM L-組氨酸，1.5M NaCl, 0.02%(w/v
0.02g/100ml) Tween 80，50%(v/v)乙二醇，ρΗ6.5 的洗脫緩沖液。
[0024]所述免疫親和層析的其他條件采用常規(guī)。
[0025]所述凝膠過濾層析所用的層析柱可選自Superdex 200HR, Sephacryl S-300 HR和Sephacryl S-400 HR,優(yōu)選GE公司的Sephacryl S-300 HR凝膠過濾層析柱。
[0026]凝膠過濾層析析所用平衡緩沖液可為Tris-HCl緩沖液，磷酸鹽緩沖液，組氨酸緩沖液，HEPES緩沖液添加鈣離子源與鋅離子源獲得，優(yōu)選的配方為:含1-1OOmM的鈣離子，1-1OOmM 的鋅離子，100-200mM NaCl, 1-3%(w/v l_3g/100ml)蔗糖，ρΗ5.8-7.8 的 10_30mM磷酸鹽緩沖液，如含1-1OOmM的氯化鈣，1-1OOmM的醋酸鋅，150mM NaCl, 2%(w/v 2g/100ml)蔗糖，pH6.8的20mM磷酸鹽緩沖液。
[0027]所述凝膠過濾層析的其他條件采用常規(guī)。
[0028]所述平衡緩沖液及洗脫緩沖液中所含鈣離子的鈣離子源可選自:氯化鈣、硫酸鈣，碳酸鈣中的至少一種；所述平衡緩沖液及洗脫緩沖液中所含的鋅離子的鋅離子源可選自:醋酸鋅、硫酸鋅、碳酸鋅中的至少一種。
[0029]優(yōu)選的，步驟3)將步驟2)獲得的超濾濃縮液進行Q Sepharose FF陰離子交換層析并收集洗脫液；將經(jīng)Q Sepharose FF陰離子交換層析獲得的洗脫液進行免疫親和層析并收集洗脫液；將經(jīng)免疫親和層析獲得的洗脫液進行DEAE FF陰離子交換層析并收集洗脫液；再將經(jīng)DEAE FF陰離子交換層析獲得的洗脫液進行凝膠過濾層析并收集凝膠過濾主峰，最終獲得純化的重組人凝血八因子。該優(yōu)選方法可以獲得純度為98%以上的終產(chǎn)品。
[0030]進一步的，本發(fā)明純化重組人凝血八因子的層析步驟前還包括病毒滅活步驟，層析后還包括凍干步驟。[0031]本發(fā)明的方法可適用于采用有血清培養(yǎng)基培養(yǎng)或無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的重組人凝血八因子細胞培養(yǎng)液的純化。細胞表達重組人凝血八因子已是成熟技術(shù)，如采用中國倉鼠卵巢細胞CHO細胞，幼鼠腎細胞BHK細胞，239細胞，HEK細胞等細胞株表達重組人凝血八因子，根據(jù)工程細胞株的種類不同，可采用各種常用的培養(yǎng)基培養(yǎng)，如DMEM，IMDM, 1640等添加(Tl5%牛血清的培養(yǎng)基，或無血清培養(yǎng)基如，SIGMA公司的SFMII302，HYCL0NE公司的適合CHO細胞的無血清培養(yǎng)基以及invitogen公司的無血清培養(yǎng)基產(chǎn)品進行培養(yǎng)表達。本發(fā)明的方法普遍適用于各種細胞表達并胞外分泌重組人凝血八因子的細胞培養(yǎng)液的純化。
[0032]本發(fā)明在純化過程中添加了鈣離子和鋅離子，發(fā)現(xiàn)它們同時作用能很好的增加八因子的穩(wěn)定性，保護八因子使得八因子不會降解，因此本發(fā)明通過在整個層析過程所用的緩沖液中添加鈣鋅離子的方法，有效解決了八因子的降解問題，使得整個純化操作能夠在常溫下進行，大大提高了工作效率，并且還提高了終產(chǎn)品的比活。這樣比添加白蛋白等添加物更經(jīng)濟，有效，常溫下純化制備出合格的重組人凝血八因子使得八因子的制備更加簡單，經(jīng)濟。
【專利附圖】

【附圖說明】[0033]圖1，顯示為實施例1方法的工藝流程圖
[0034]圖2，重組人凝血八因子最終產(chǎn)品Western Bloting檢測結(jié)果
[0035]M代表蛋白質(zhì)分子量標準，“ + ”是最新的惠氏公司的重組八因子產(chǎn)品Xyntha
【具體實施方式】
[0036]以下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的【具體實施方式】加以實施或應(yīng)用，本說明書中的各項細節(jié)也可以基于不同觀點與應(yīng)用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進行各種修飾或改變。
[0037]須知，下列實施例中未具體注明的工藝設(shè)備或裝置均采用本領(lǐng)域內(nèi)的常規(guī)設(shè)備或裝置；所有壓力值和范圍都是指絕對壓力。如無特別說明，本發(fā)明所述緩沖液的溶劑均為水。
[0038]此外應(yīng)理解，本發(fā)明中提到的一個或多個方法步驟并不排斥在所述組合步驟前后還可以存在其他方法步驟或在這些明確提到的步驟之間還可以插入其他方法步驟。
[0039]當(dāng)實施例給出數(shù)值范圍時，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本【技術(shù)領(lǐng)域】技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實現(xiàn)本發(fā)明。
[0040]實施例1
[0041]1.試驗?zāi)康?
[0042]考查二價金屬離子尤其是鈣離子和鋅離子在八因子純化過程中對八因子穩(wěn)性的影響。
[0043]實驗設(shè)計考察了在八因子純化階段單獨添加鈣離子，單獨添加鋅離子和鈣離子鋅離子同時添加的條件下八因子的穩(wěn)定性情況。
[0044]2.主要材料:
[0045]重組人凝血八因子細胞培養(yǎng)液:重組人凝血八因子CHO工程細胞(根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)制備)采用SFMII302培養(yǎng)液(SIGMA公司提供)培養(yǎng)獲得。
[0046]Q Sepharose FF離子交換層析柱:美國GE公司
[0047]八因子親和(V8 SELECT)層析柱:GE公司
[0048]DEAE FF離子交換柱:美國GE公司
[0049]Sephacryl S-300 HR 凝膠過濾層析:GE 公司
[0050]3.實驗步驟:具體工藝流程如圖1所示
[0051]共采用A、B、C、D四個純化方案。
[0052]3.1純化方案A
[0053]a.重組人凝血八因子細胞培養(yǎng)液10L，0.45微米膜過濾后通過30KD的超濾膜超濾濃縮到 1L，然后利用5升第一步Q平衡緩沖液(IOmM L-histidine, 300mM NaCl，pH7.0)置換，最后超濾到I升。[0054]b.Q FF離子交換層析柱預(yù)先用Q平衡緩沖液平衡5個柱體積)，步驟a超濾后的溶液常溫下直接上Q FF離子交換層析柱，上樣后利用IOmM L-histidine, 700mM NaCl, pH7.0洗脫，收集洗脫的樣品(即Q柱洗脫液)約300毫升上樣八因子親和(V8 SELECT)層析柱。
[0055]c.親和層析利用 IOmM L-histidine, 300mM NaCl, 0.02%(w/v) Tween80, pH7.0平衡，300 毫升 Q 柱洗脫液上樣后利用 20mM L-histidine, 1.5M NaCl, 0.02%(w/v)Tween80, 50% (v/v) ethylene glycol, pH6.5 洗脫,洗脫收集約 100 毫升準備做下一步 DEAEFF離子交換。
[0056]d.DEAE FF 離子交換柱利用 IOmM L-histidine, 300mM NaCl, ρΗ7.0 平衡，平衡后100毫升親和洗脫液上樣，上樣結(jié)束后用IOmM L-histidine, 700mM NaCl，pH7.0洗脫收集約
20毫升。
[0057]e.凝膠過濾層析使用GE公司Sephacryl S-300HR純化,層析柱使用20mM磷酸鹽緩沖液PH6.8，150mM NaCl, 2%蔗糖平衡，平衡后20毫升DEAE FF層析洗脫液上樣，用同樣的緩沖液洗脫，最后收集凝膠過濾主峰約15毫升，此為純度合格的重組人凝血八因子。
[0058]3.2 純化方案 B、C、D:
[0059]純化過程同方案A，不同點在于所有緩沖液中利用不同的方案添加了 2mM氯化鈣和2mM醋酸鋅，見表1。
[0060]表1重組人凝血八因子在純化過程中不同金屬離子添加方案
[0061]+/-代表氯化鈣 和醋酸鋅在純化過程中的添加情況，“ + ”為所有純化過程中均添加，代表所有純化過程中均不添加。
[0062]4.結(jié)果檢驗:
[0063]
八因子純化過程中不同金屬離子添加方案2mM氯化鈣2mM醋酸鋅
~ ~ ~
~ ~
C~+
~ + +
[0064]通過四種實驗方案純化出的重組人凝血八因子進行了活性檢測(參考Influenceof Buffer Components Used in Immunoaffinity Chromatography for Purification ofFactor VIII/νοη Willebrand Factor.Thromb.Res.1994，74，347-354 文獻記載的方法進行)和 Western Bloting.。
[0065]5.結(jié)果
[0066]Western Bloting.結(jié)果如圖2,活性檢測數(shù)據(jù)見表2。
[0067]表2不同實驗方案純化的重組人凝血八因子活性及比活
[0068]圖2顯示了不同實驗方案八因子的降解情況，可以看到D即同時添加了鋅離子和鈣
[0069]
【權(quán)利要求】
1.一種從細胞培養(yǎng)液中分離純化重組人凝血八因子的方法，包括下列步驟: 1)去除重組人凝血八因子細胞培養(yǎng)液中的細胞； 2)將去除細胞的培養(yǎng)液超濾濃縮； 3)將超濾濃縮的培養(yǎng)液經(jīng)陰離子交換層析、免疫親和層析或凝膠過濾層析中的一項或多項純化獲得純化的重組人凝血八因子； 其中，步驟3)所述陰離子交換層析、免疫親和層析及凝膠過濾層析中所采用的平衡緩沖液，以及步驟3)所述陰離子交換層析和免疫親和層析中所采用的洗脫緩沖液中，均含有摩爾濃度為1-1OOmM的鈣離子及摩爾濃度為1-1OOmM的鋅離子。
2.如權(quán)利要求1所述從細胞培養(yǎng)液中分離純化重組人凝血八因子的方法，其特征在于，鈣離子的摩爾濃度及鋅離子的摩爾濃度均為2-50mM。
3.如權(quán)利要求1所述從細胞培養(yǎng)液中分離純化重組人凝血八因子的方法，其特征在于，步驟3)在首次層析前，將超濾濃縮的培養(yǎng)液采用首次層析所用的平衡緩沖液以體積比I=2-1:50混合并再次超濾濃縮后，再進行層析。
4.如權(quán)利要求1所述從細胞培養(yǎng)液中分離純化重組人凝血八因子的方法，其特征在于，所述步驟I)中，采用0.45微米膜過濾去除重組人凝血八因子的細胞培養(yǎng)液中的細胞。
5.如權(quán)利要求1所述從細胞培養(yǎng)液中分離純化重組人凝血八因子的方法，其特征在于，所述步驟2)中，采用截留分子量為10-300KD的超濾膜超濾濃縮。
6.如權(quán)利要求1所述從細胞培養(yǎng)液中分離純化重組人凝血八因子的方法，其特征在于，所述步驟3)中，所述陰離子交換層析所用的層析柱選自Q Sepharose FF陰離子交換層析柱、DEAE陰離子交換層析柱和Capto Q陰離子交換層析柱；所述免疫親和層析所用的層析柱為偶聯(lián)有凝血八因子抗體的親和層析柱；所述凝膠過濾層析所用的層析柱選自Superdex200HR, Sephacryl S-300HR 和 Sephacryl S-400HR。
7.如權(quán)利要求1所述從細胞培養(yǎng)液中分離純化重組人凝血八因子的方法，其特征在于，所述步驟3)中，陰離子交換層析、免疫親和層析及凝膠過濾層析所用平衡緩沖液及洗脫緩沖液由Tris-HCl緩沖液、磷酸鹽緩沖液、組氨酸緩沖液或HEPES緩沖液添加鈣離子源與鋅離子源獲得。
8.如權(quán)利要求1所述從細胞培養(yǎng)液中分離純化重組人凝血八因子的方法，其特征在于，所述步驟3)中，陰離子交換層析所用平衡緩沖液為:含1-1OOmM的鈣離子，1-1OOmM的鋅離子，5-15mM L-組氨酸，200_400mM NaCl, pH6.0-8.0的平衡緩沖液；陰離子交換層析所用洗脫緩沖液為:含1-1OOmM的鈣離子，1-1OOmM的鋅離子，5_15mM L-組氨酸，600-800mMNaCl, pH6.0-8.0的洗脫緩沖液；免疫親和層析所用平衡緩沖液為:含1-1OOmM的鈣離子，1-1OOmM 的鋅離子，5-15mM L-組氨酸，200_400mM NaCl, 0.01-0.03%Tween 80，ρΗ6.0-8.0的平衡緩沖液；免疫親和層析所用洗脫緩沖液為:含1-1OOmM的鈣離子，1-1OOmM的鋅離子，5-15mM L-組氨酸，1.0-2.0M NaCl, 0.01-0.03%Tween80, 40-60% 乙二醇，pH5.5-7.5 的洗脫緩沖液；凝膠過濾層析析所用平衡緩沖液為:含1-1OOmM的鈣離子，1-1OOmM的鋅離子，100-200mM NaCl, 1-3% 蔗糖，ρΗ5.8-7.8 的 10_30mM 磷酸鹽緩沖液。
9.如權(quán)利要求1所述從細胞培養(yǎng)液中分離純化重組人凝血八因子的方法，其特征在于，所述平衡緩沖液及洗脫緩沖液中所含鈣離子的鈣離子源選自氯化鈣、硫酸鈣和碳酸鈣；所述平衡緩沖液及洗脫緩沖液中所含的鋅離子的鋅離子源選自醋酸鋅、硫酸鋅和碳酸鋅。
10.如權(quán)利要求1-9任一權(quán)利要求所述從細胞培養(yǎng)液中分離純化重組人凝血八因子的方法，其特征在于，步驟3)的層析純化方法具體為:將超濾濃縮的培養(yǎng)液進行QSepharoseFF陰離子交換層析并收集洗脫液；將經(jīng)Q Sepharose FF陰離子交換層析獲得的洗脫液進行免疫親和層析并收集洗脫液；將經(jīng)免疫親和層析獲得的洗脫液進行DEAE FF陰離子交換層析并收集洗脫液；再將經(jīng)DEAE FF陰離子交換層析獲得的洗脫液進行凝膠過濾層析并收集凝膠過濾主峰， 最終獲得純化的重組人凝血八因子。
【文檔編號】C07K1/34GK103539852SQ201210241870
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2012年7月12日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月12日
【發(fā)明者】郭頎然, 楊松峰, 許必雄 申請人:上海泰龍生物醫(yī)藥科技有限公司