專利名稱：旱蓮草的提取分離方法，該方法分離得到的提取物及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中草藥的提取分離，具體地，涉及一種旱蓮草的提取分離方法，該方法分離得到的提取物及用途。
背景技術(shù)：
人體的毛發(fā)約有10萬(wàn)到15萬(wàn)個(gè)，每個(gè)毛發(fā)都有不同的生長(zhǎng)周期且將反復(fù)，包含生長(zhǎng)期(anagen),退化期(catagen)和休止期(telogen)。生長(zhǎng)期的毛發(fā)生長(zhǎng)后生成角蛋白(keratin);退化期的毛發(fā)維持生長(zhǎng)期結(jié)束時(shí)的形狀漸漸的新陳代謝越來(lái)越慢；退化期的毛發(fā)不生成角蛋白，是毛囊細(xì)胞停止分離并急劇萎縮的時(shí)期。到了休止期毛囊活動(dòng)完全結(jié)束將準(zhǔn)備脫發(fā)，處于休止期的毛發(fā)被從根部生長(zhǎng)出來(lái)的處于生長(zhǎng)期的新毛發(fā)拱出并自動(dòng)脫 落，而且將反復(fù)出現(xiàn)梳頭或洗發(fā)時(shí)掉發(fā)的現(xiàn)象。此現(xiàn)象將以3 6年為周期反復(fù)出現(xiàn)，據(jù)統(tǒng)計(jì)平均每天有約100個(gè)左右的毛發(fā)正常脫落。同上所述人的毛發(fā)都有自己的周期，所以在沒有換頭發(fā)的情況下始終保持一定量的頭發(fā)數(shù)量。但是開始出現(xiàn)禿頭現(xiàn)象起毛根中的乳頭狀突起變小，毛乳頭變小引起毛發(fā)變細(xì)同時(shí)毛發(fā)周期也變短，導(dǎo)致新長(zhǎng)出來(lái)的毛發(fā)變細(xì)。因此出現(xiàn)禿頭時(shí)毛發(fā)開始變?yōu)槔w毛，毛發(fā)周期變短最終毛發(fā)生長(zhǎng)一段時(shí)間后脫落。禿頭現(xiàn)象使頭皮積滿油脂容易感染脂溢性皮膚炎，毛根上粘著的皮脂腺逐漸變大并生成大量皮脂。雖然這現(xiàn)象不是禿頭的主要原因，可以成為促進(jìn)脫發(fā)的次要原因。脫發(fā)的原因中遺傳性原因比重較大，不僅是男性越來(lái)越多的女性也出現(xiàn)脫發(fā)的現(xiàn)象，這已成為嚴(yán)重的問(wèn)題。除了遺傳因素，荷爾蒙失衡，社會(huì)生活的過(guò)度精神壓力，空氣污染，加工食品的攝入，高熱引起的疾病，營(yíng)養(yǎng)失衡，服用抗癌及抗甲狀腺藥物，口服避孕藥，洗發(fā)水，較強(qiáng)的紫外線或運(yùn)動(dòng)中流出的汗，飲食習(xí)慣，心理壓力等的多種習(xí)慣和環(huán)境成為了脫發(fā)的罪魁禍?zhǔn)?。所以市?chǎng)上有各種防脫發(fā)和生發(fā)劑銷售，但大部分產(chǎn)品的核心技術(shù)主要是通過(guò)控制男性荷爾蒙來(lái)防止脫發(fā)的，再進(jìn)一步促進(jìn)頭發(fā)的生長(zhǎng)。但由于沒有實(shí)質(zhì)性的物質(zhì)所以沒有起到效果或微不足道，從科學(xué)的角度沒能征服脫發(fā)難題。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (TGF-β)從各種不同種類的細(xì)胞和組織中被譽(yù)為初期發(fā)生的調(diào)節(jié)，細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，細(xì)胞繁殖及分解，移動(dòng)，生存，細(xì)胞外屬性的生產(chǎn)，免疫系統(tǒng)，血管生成和血球細(xì)胞生成,細(xì)胞絲誘導(dǎo),骨骼形成,傷口治愈等調(diào)節(jié)多功能細(xì)胞因子(cytokine)。而且，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)屬同種異性體的糖蛋白在傷口附近刺激血管生成，上皮細(xì)胞的特有促細(xì)胞分裂劑(mitogen)誘導(dǎo)上皮細(xì)胞的移動(dòng)和繁殖，增加血管的透過(guò)性，能促進(jìn)生發(fā)。退化期開始發(fā)生細(xì)胞凋亡(apoptosis)，從形態(tài)上分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)，這種物質(zhì)引發(fā)脫發(fā)現(xiàn)象。所以引誘抑制TGF-β減少正常頭發(fā)到脫發(fā)的過(guò)程，減緩脫發(fā)現(xiàn)象是非常有必要的?，F(xiàn)有技術(shù)中，有將旱蓮草作為防脫發(fā)和生發(fā)劑的一種原料，作為復(fù)方制劑用于生發(fā)和防脫發(fā)，如CN1939256，旱蓮草作為原料之一用于制備祛屑止癢、護(hù)發(fā)防脫的洗發(fā)露，該方法是采用醇水溶液浸泡提取，并未明確單一的旱蓮草也能起效，也沒有說(shuō)明其機(jī)理；CN101444469，旱蓮草作為原料之一用于制備生發(fā)育發(fā)精，也是作為復(fù)方制劑使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種旱蓮草的提取分離方法，該方法獲得的旱蓮草提取物及其活性成份能有效地抑制TGF-β的出現(xiàn)，從而可以防止脫發(fā)，并促進(jìn)生發(fā)，可以應(yīng)用于藥學(xué)組合物及化妝品中。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種旱蓮草的提取方法，該方法包含
步驟1，將旱蓮草干粉在甲醇中浸泡5 10天，旱蓮草干粉與甲醇的用量比例為按重量體積比為I :6 10，提取，過(guò)濾；重復(fù)0-10次，優(yōu)選地，重復(fù)1-3次，合并過(guò)濾液；
步驟2，將上述過(guò)濾液減壓濃縮得到旱蓮草甲醇提取物。
所述的提取可選擇常溫提取，熱提取，冷卻提取，環(huán)流冷卻提取，超聲波提取及蒸汽提取中的任意一種來(lái)執(zhí)行。上述的旱蓮草的提取方法，其中，該方法還包含
步驟3，向所述的旱蓮草甲醇提取物中，加入按重量比例計(jì)I. 5 3倍的水，再加入按重量比例計(jì)I. 5^3倍的正己烷提取，重復(fù)(Γ5次，優(yōu)選重復(fù)1-2次，合并旱蓮草的正己烷提取液，減壓濃縮得到旱蓮草正己烷提取物；
步驟4，對(duì)步驟3中提取剩余的水溶液，采用三氯甲烷萃取f 5次，優(yōu)選2-3次，合并三氯甲烷萃取液，減壓濃縮得到旱蓮草三氯甲烷提取物。本發(fā)明的提取溶劑可以是a)水；b) C1-4低級(jí)醇，如甲醇，乙醇，丁醇；c)環(huán)己烷；d)三氯甲烷；e)醋酸乙酯；f)上述任意兩種或兩種以上的混合溶劑。上述的旱蓮草的提取方法，其中，該方法還包含
步驟5，所述的旱蓮草三氯甲烷提取物通過(guò)硅膠柱層析，所采用的溶劑為三氯甲烷與甲醇的體積比100 :(Γθ 100的混合溶劑，分離得到α -三聯(lián)噻吩衍生物(I)，其結(jié)構(gòu)式為
\ / i Jh~—s/
R
I
其中，R為CHO或CH20H。上述的旱蓮草的提取方法，其中，所述的步驟5還包含
步驟5. 1，將步驟5中柱層析得到的第一個(gè)組分，通過(guò)高效液相色譜分析，得到2-甲酰
基二聯(lián)喔吩。上述的旱蓮草的提取方法，其中，所述的步驟5還包含
步驟5. 2，將步驟5中柱層析得到的第三個(gè)組分采用己烷/醋酸按體積比為10 Γ0 :10的混合溶劑，柱層析得到α-三聯(lián)噻吩甲醇。本發(fā)明還提供了一種根據(jù)上述的旱蓮草的提取方法得到的旱蓮草甲醇提取物。
本發(fā)明還提供了一種根據(jù)上述的旱蓮草的提取方法得到的旱蓮草甲醇提取物的用途，其中，該旱蓮草甲醇提取物用于防止脫發(fā)及促進(jìn)生發(fā)。本發(fā)明還提供了一種根據(jù)上述的旱蓮草的提取方法得到的旱蓮草三氯甲烷提取物。本發(fā)明還提供了一種根據(jù)上述的旱蓮草的提取方法得到的旱蓮草三氯甲烷提取物的用途，其中，該旱蓮草三氯甲烷提取物用于防止脫發(fā)及促進(jìn)生發(fā)。本發(fā)明還提供了一種上述的旱蓮草的提取方法得到的α -三聯(lián)噻吩衍生物(I)的用途，其中，該α -三聯(lián)噻吩衍生物(I)用于防止脫發(fā)及促進(jìn)生發(fā)。本發(fā)明的旱蓮草提取物及其活性成份可以用于藥學(xué)組合物，醫(yī)藥用品組合物，化 妝品組合物或食品組合物中。本發(fā)明的提取物可以利用涂抹或散布的方法用于毛發(fā)或頭皮，該毛發(fā)是指頭發(fā)的的毛根及毛囊，頭發(fā)及眼睫毛和眉毛，胡子，腋下，陰毛，身體所有毛根及毛囊部位。本發(fā)明的α -三聯(lián)噻吩衍生物可使用于藥學(xué)允許的鹽形態(tài)。而且本發(fā)明的提取物還可單獨(dú)或與其他藥學(xué)活性化合物混合或匯總后使用。本發(fā)明使用的“藥學(xué)允許的鹽”是指本領(lǐng)域通常使用的方法提煉出的鹽，此類提煉方法在業(yè)界已公布。本發(fā)明所述的藥學(xué)組合物可以通過(guò)口服或非口服等多種形式進(jìn)行用藥，但這里適合非口服用藥，局部涂布(topical application)用藥方式。本發(fā)明所述的藥學(xué)組合物可選擇適量用藥，可以根據(jù)患者的狀態(tài)及體重，疾病程度，藥物形態(tài)，用藥途徑及期間而有所不同，也可以根據(jù)當(dāng)事者情況來(lái)調(diào)整。本發(fā)明的旱蓮草提取物及活性成份的用藥量根據(jù)承認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)O. 001 100 mg/kg, O. 01 10 mg/kg可取。而且，本發(fā)明的α-三聯(lián)噻吩衍生物或其藥學(xué)允許的鹽一般取O. 001 500mg/kg的量，也可取O. 01至10 mg/kg的量用藥。用藥可每天一次,也可分?jǐn)?shù)次用藥。上述用藥量不限定本發(fā)明范圍。本發(fā)明所述的藥學(xué)組合物可利用業(yè)界熟知的載體及/或賦形劑來(lái)完成。此時(shí)劑型可以是精煉，丸藥，顆粒，粉末，香囊(sachet),酏劑(elixir),懸池液，乳狀液，溶液，糖漿(Syrup)，噴霧劑，軟質(zhì)或硬質(zhì)凝膠膠囊，滅菌注射溶液，滅菌粉末等形態(tài)。本發(fā)明的旱蓮草提取物及其活性成份用于化妝品時(shí)，除了旱蓮草提取物，其活性成份，α -三聯(lián)噻吩衍生物或其藥學(xué)允許的鹽，還添加有通常用于化妝品的補(bǔ)助劑，例如還可含有親水性或親脂性膠凝劑，親水性或親脂性催化劑，防腐劑，抗氧化劑，溶媒，芳香劑，填充劑，遮段劑，色素及顏料。上述防脫發(fā)及促進(jìn)生發(fā)作用的化妝品及藥用品劑型可與發(fā)乳，頭發(fā)洗劑，洗發(fā)劑，洗發(fā)香波，護(hù)發(fā)素，噴發(fā)膠，頭發(fā)噴霧劑，潤(rùn)發(fā)脂，粉末，發(fā)膠，發(fā)膜，頭發(fā)修護(hù)，眉毛生發(fā)水，睫毛生發(fā)水，睫毛營(yíng)養(yǎng)劑，或?qū)櫸锵窗l(fā)水及寵物香波等一起制造出溶液，溶膠，溶劑，油，蠟，氣溶劑等多種形態(tài)的產(chǎn)品。還可用于假發(fā)等頭皮或用于毛發(fā)的機(jī)械制造或加工，不僅限于此。上述防脫發(fā)的組合物也可含有各種劑型及符合最終目標(biāo)的防脫發(fā)組合物所需的成分。例如洗發(fā)精劑型可含有洗凈成分合成界面活性劑和防腐劑，漸增劑，粘度調(diào)節(jié)劑，PH調(diào)節(jié)劑，香料，顏料，護(hù)發(fā)劑及水中包含一個(gè)或以上的成分。上述合成界面活性劑中合成陰離子界面活性劑是烷基及烷基乙醚硫酸鹽，代表性例子有月桂基磺酸鈉(Sodium Lauryl Sulfate),硫酸銨(ammonium sulfate),三乙醇胺月桂基硫酸鹽(triethanolamine Lauryl Sulfate),聚乙烯月桂基硫酸鹽(polyethylene LaurylSulfate), 聚乙烯硫酸銨(polyethylene ammonium Sulfate)等。本發(fā)明的防脫發(fā)組合物根據(jù)劑形不同可以給寵物使用。也可用含有本發(fā)明提取物的洗發(fā)水，加入對(duì)寵物皮膚刺激少保濕力強(qiáng)的中性洗劑制成。
本發(fā)明提供的旱蓮草提取物的分離方法簡(jiǎn)單，所得到的旱蓮草提取物及進(jìn)一步分離得到的活性成份能有效抑制TGF-β的出現(xiàn)，從而可以防止脫發(fā)，并促進(jìn)生發(fā)，可以應(yīng)用于藥學(xué)組合物及化妝品中。


圖I為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例I所得的旱蓮草提取物抑制TGF-β出現(xiàn)效果的測(cè)試結(jié)
果O圖2是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例2所得的旱蓮草三氯甲烷提取物的第三個(gè)組分對(duì)VEGF活性的測(cè)試結(jié)果。圖3是根據(jù)本發(fā)明的旱蓮草提取物在TNF-α誘導(dǎo)下，抑制TGF-β出現(xiàn)效果的測(cè)試結(jié)果。圖4是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，表示抑制TGF- β出現(xiàn)效果的旱蓮草提取物最少濃度的測(cè)試結(jié)果。圖5是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，表示旱蓮草提取物抑制TGF- β效果所需要的時(shí)間的測(cè)
試結(jié)果。圖6a為正常胚子長(zhǎng)出的CRL2076細(xì)胞的形體圖，圖6b為加入2 /ml的旱蓮草提取物處理的CRL2076細(xì)胞形體圖。圖7是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，α-三聯(lián)噻吩-2-醛對(duì)于抑制TGF-β效果的測(cè)試結(jié)
果O圖8是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，α-三聯(lián)噻吩-甲醇對(duì)于抑制TGF-β效果的測(cè)試結(jié)
果O
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步地說(shuō)明。實(shí)施例I旱蓮草提取物制造
常溫下，將旱蓮草干粉3. 5kg沉積于甲醇(MeOH) 25L中浸泡7天，然后，常溫下攪拌24小時(shí)后過(guò)濾浸出物，這樣反復(fù)2次。合并浸出物溶液，減壓濃縮，清除甲醇(MeOH)后得到旱蓮草甲醇(MeOH)提取物560 g。實(shí)施例2制造旱蓮草正己烷提取物和三氯甲烷提取物
將實(shí)施例I得到的旱蓮草甲醇提取物560 g與1000 mL蒸餾水懸濁混合，然后采用1000mL正己烷(hexane)萃取；反復(fù)上述操作2次，合并萃取液，減壓濃縮，得到53 g正己烷提取物。然后，將正己烷萃取后的殘留物水溶液采用1000 mL三氯甲烷提取2次，合并萃取液，減壓濃縮，得到7 g三氯甲烷萃取物。實(shí)施例3活性化合物分離及構(gòu)造研究
實(shí)施例2取得的7 g旱蓮草三氯甲烷萃取物采用三氯甲烷和甲醇的混合溶劑(100:0至0:100的體積比)進(jìn)行硅膠(80g，70至230目，購(gòu)自默克公司)柱層析得到了 8個(gè)組分組分 l(80.6mg)，組分 2(76.2mg)，組分 3 (706. 3mg)，組分 4(188. 8mg)，組分 5(641mg)，組分 6 (I. 18g)，組分 7 (3. 14g)，組分 8 (796. 6 mg)。上述組分中，對(duì)組分I進(jìn)行HPLC (高效液相色譜分析,high-performance liquidChromatography, YMC Pack Pro C18 液相色譜柱，250，20mm, 70% 乙臆水溶液)得到α -三聯(lián)噻吩-2-醛，呈黃色無(wú)晶型固體，分子式為C13H8S3O,分子量為276，ESI-質(zhì)量分析m/z-[M+Na]+, 299。對(duì)組分3采用正己烷和醋酸混合溶劑(10:1至0:10的體積比)進(jìn)行硅膠(7g， 230-400目，購(gòu)自默克公司)柱層析得到了 α-三聯(lián)噻吩-甲醇，呈黃色無(wú)晶型固體，分子式為 C13HltlS3O,分子量為 278，ESI-質(zhì)量分析m/z-[M+Na]+，301。上述α -三聯(lián)噻吩-2-醛，α -三聯(lián)噻吩-甲醇的性狀、分子量、分子式、1 H-NMR及13 C-NMR測(cè)定結(jié)果，均與文獻(xiàn)(印度化學(xué)雜志Indian journal of Chemistry, 30B:1052-1053, 1991)的報(bào)告數(shù)據(jù)一致。實(shí)施例4.旱蓮草提取物的抑制TGF-β出現(xiàn)效果
將人纖維原細(xì)胞(fibroblast)細(xì)胞株CRL2076在含有10%FBS的DMSO培養(yǎng)液中調(diào)整細(xì)胞數(shù)量到5X IO5個(gè)/ml，維持12小時(shí)，其中旱蓮草提取物濃度5 ug/ml。提取纖維原細(xì)胞的mRNA，利用提取的mRNA執(zhí)行RT-PCR。RT-PCR的實(shí)施條件為基本上是30次循環(huán)。I次循環(huán)包含溫度55°C時(shí)間30秒的退火(annealing)階段；溫度72°C時(shí)間30秒的延伸(Elongation)階段,溫度94°C,時(shí)間30秒的變性(denaturing)階段組成實(shí)施,利用電泳確認(rèn)的結(jié)果見圖I。為了分析TGF- β的出現(xiàn)使用的弓丨物如下
正向(Forward): 5’-CGTGTTGCTCTCCCGGGCAG-3’(序號(hào) I)
逆向(Reverse): 5’-GCAGTGGGCGCTAAGGCGAA-3’(序號(hào) 2)
且使用對(duì)照組的GAPDH多基因(polygene)分析的引物如下
正向(Forward): 5’-CCATCACCATCTTCCAGGAG-3’(序號(hào) 3)
逆向(Reverse) : 5’ -ACAGTCTTCTGGGTGGCAGT-3’ (序號(hào) 4)
其結(jié)果為如圖I所示，加入了本發(fā)明物旱蓮草提取物可以確認(rèn)比未進(jìn)行處理的對(duì)照群Control)和良性對(duì)照群(只加入溶劑，如甲醇)顯著地減少了 TGF-β的基因量，說(shuō)明旱蓮草提取物能有效防止脫發(fā)。實(shí)施例5旱蓮草餾分(旱蓮草三氯甲烷提取物)對(duì)VEGF多基因的促進(jìn)效果。將人纖維原細(xì)胞(fibroblast)細(xì)胞株HEK293在含有10%FBS的DMSO培養(yǎng)液中調(diào)整細(xì)胞數(shù)量到2X IO5個(gè)/ml，利用VEGF強(qiáng)活動(dòng)性遺傳基因促進(jìn)劑PGL4 vector轉(zhuǎn)換性質(zhì)，實(shí)施例3取得的旱蓮草三氯甲燒提取物中的組分3分別以100ng/ml，500 ng/ml, I ug/ml,3 ug/ml，及，5ug/ml濃度維持12小時(shí)后培養(yǎng)6小時(shí)。之后提取mRNA，再使用提取的mRNA執(zhí)行 RT-PCR。RT-PCR實(shí)施條件為30次循環(huán)，基本.I次循環(huán)包含溫度55°C時(shí)間30秒的退火階段；溫度72°C時(shí)間30秒的延伸(Elongation)階段；溫度94°C，時(shí)間30秒的變性(denaturing)階段。為了分析VEGF多基因(polygene)使用的引物如下
正向(Forward): 5’-GTACGTTGGTGCCCGCTGCT-3’(序號(hào) 5)
逆向(Reverse): 5’-TCCTTCCTCCTGCCCGGCTC-3’(序號(hào) 6)
且使用對(duì)照群的GAPDH多基因(polygene)分析引物如下
正向(Forward): 5' -CCATCTTCCAGGAG-3'(序號(hào) X)
逆向(Reverse): 5' -TCTGGGTGGCAGT-3'(序號(hào) 8)
接下去，添加溶解緩沖劑100 ul，在溫度4°C下?lián)u晃30秒。取10 ul上清液與熒光素酶制劑50ul混合測(cè)定熒光素酶劑的活性，將結(jié)果記錄到圖2 ;圖2顯示確認(rèn)了本發(fā)明的旱蓮草餾分的組分3可以增加VEGF的多基因量。實(shí)施例6旱蓮草提取物腫瘤壞死因子TNF-α誘導(dǎo)的抑制TGF-β的出現(xiàn)效果
將人纖維原細(xì)胞(fibroblast)細(xì)胞株CRL2076在含有10%FBS的DMSO培養(yǎng)液中調(diào)整細(xì)胞數(shù)量到5X105個(gè)/ml后，分別取5ml，添加旱蓮草提取物I Ug及2 Ug培養(yǎng)2個(gè)小時(shí)，再采用TNF- a IOug處理，執(zhí)行2小時(shí)RT-PCR，將其結(jié)果用電泳確認(rèn)后顯示在圖3 ;結(jié)果顯示，在只有TNF- α處理的群中增加了 TGF- β出現(xiàn)，但在TNF- α和旱蓮草提取物都被處理的群內(nèi)TGF-β出現(xiàn)被抑制了。所以細(xì)胞內(nèi)即使被TNF-α誘導(dǎo)出TGF-β出現(xiàn)，經(jīng)過(guò)本發(fā)明旱蓮草提取物處理后不受TNF-α處理過(guò)的影響，可以抑制TGF-β的出現(xiàn)，也就是說(shuō)本發(fā)明的旱蓮草提取物能防止人體脫發(fā)。實(shí)施例7 :旱蓮草提取物濃度對(duì)抑制TGF-β出現(xiàn)效果的影響
將人纖維原細(xì)胞(fibroblast)細(xì)胞株CRL2076在含有10%FBS的DMSO培養(yǎng)液中調(diào)整細(xì)胞數(shù)量到5X105個(gè)/ml后，分開取5ml，分別添加旱蓮草提取物0.2 ug，0. 5 ug, lug及2ug后，培養(yǎng)2個(gè)小時(shí)。然后觀察TGF-β出現(xiàn)程度將結(jié)果記錄到圖4。結(jié)果顯示，旱蓮草濃度越大，抑制TGF-β出現(xiàn)的效果越明顯，且旱蓮草提取物濃度為2 ug的顯著抑制了 TGF-β出現(xiàn)。實(shí)施例8 :旱蓮草提取物抑制TGF- β出現(xiàn)效果的時(shí)間
將人纖維原細(xì)胞(fibroblast)細(xì)胞株CRL2076在含有10%FBS的DMSO培養(yǎng)液中調(diào)整細(xì)胞數(shù)量到5 X IO5個(gè)/ml后，分開取5ml，添加旱蓮草提取物后，培養(yǎng)10分鐘，I小時(shí)，2小時(shí)后執(zhí)行RT-PCR，電泳確認(rèn)結(jié)果記錄圖5 ;結(jié)果顯示，TGF-β的出現(xiàn)隨著時(shí)間的推移漸漸被抑制，2小時(shí)后TGF-β出現(xiàn)完全被抑制住的效果。實(shí)施例9 :旱蓮草提取物對(duì)細(xì)胞的影響
將人纖維原細(xì)胞(fibroblast)細(xì)胞株CRL2076在含有10%FBS的DMSO培養(yǎng)液中調(diào)整細(xì)胞數(shù)量到5 X IO5個(gè)/ml后分開注入5ml，添加旱蓮草提取物2ug后24小時(shí)觀察細(xì)胞形體變化和細(xì)胞損傷程度，并將結(jié)果記錄到圖6b (未添加旱蓮草提取物觀察細(xì)胞形體如圖6a所示)，結(jié)果顯示的旱蓮草提取物處理的濃度纖維原細(xì)胞(fibroblast)與未處理旱蓮草提取物的正常細(xì)胞相同，確認(rèn)了細(xì)胞無(wú)異常。實(shí)施例10 :三聯(lián)噻吩衍生物(I)對(duì)TGF-β的抑制效果
將人纖維原細(xì)胞(fibroblast)細(xì)胞株CRL2076在含有10%FBS的DMSO培養(yǎng)液中調(diào)整細(xì)胞數(shù)量到5 X IO5個(gè)/ml后，分別取5ml。分別添加α -三聯(lián)噻吩-2-醛20 ng/ml, 200ng/ml 及 2 ug/ml,以及，添加 α -三聯(lián)噻吩-甲醇 2 ng/ml, 20 ng/ml, 200 ng/ml 及 2ug/ml，各自培養(yǎng)6小時(shí)后添加溶解緩沖劑100 ul在溫度4°C下?lián)u晃30分鐘。取10 ul上清液與熒光素酶制劑50 ul混合測(cè)定熒光素酶制劑的活性，將結(jié)果記錄到圖7和圖8;圖7確認(rèn)了隨著α -三聯(lián)噻吩-2-醛濃度的增加，TGF-β活性減少；圖8確認(rèn)了隨著α -三聯(lián)噻吩-甲醇濃度的增加，TGF-β活性減少。由此說(shuō)明，三聯(lián)噻吩衍生物(I)能抑制TGF-β的活性，從而可以用于防止脫發(fā)。盡管本發(fā)明的內(nèi)容已經(jīng)通過(guò)上述優(yōu)選實(shí)施例作了詳細(xì)介紹，但應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到上述的 描述不應(yīng)被認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明的限制。在本領(lǐng)域技術(shù)人員閱讀了上述內(nèi)容后，對(duì)于本發(fā)明的多種修改和替代都將是顯而易見的。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)由所附的權(quán)利要求來(lái)限定。
權(quán)利要求
1.一種旱蓮草的提取方法，其特征在于，該方法包含 步驟1，將旱蓮草干粉在甲醇中浸泡5 10天，旱蓮草干粉與甲醇的用量比例為按重量體積比為I :6 10，提取，過(guò)濾；重復(fù)0-10次，合并過(guò)濾液； 步驟2，將上述過(guò)濾液減壓濃縮得到旱蓮草甲醇提取物。
2.如權(quán)利要求I所述的旱蓮草的提取方法，其特征在于，該方法還包含 步驟3，向所述的旱蓮草甲醇提取物中，加入按重量比例計(jì)I. 5^3倍的水，再加入按重量比例計(jì)I. 5^3倍的正己烷提取，重復(fù)(Γ5次，合并旱蓮草的正己烷提取液，減壓濃縮得到旱蓮草正己烷提取物； 步驟4，對(duì)步驟3中提取剩余的水溶液，采用三氯甲烷萃取1飛次，合并三氯甲烷萃取液，減壓濃縮得到旱蓮草三氯甲烷提取物。
3.如權(quán)利要求2所述的旱蓮草的提取方法，其特征在于，該方法還包含 步驟5，所述的旱蓮草三氯甲烷提取物通過(guò)硅膠柱層析，所采用的溶劑為三氯甲烷與甲醇的體積比100 :(Γθ 100的混合溶劑，分離得到α -三聯(lián)噻吩衍生物(I)，其結(jié)構(gòu)式為
4.如權(quán)利要求3所述的旱蓮草的提取方法，其特征在于，所述的步驟5還包含 步驟5. 1，將步驟5中柱層析得到的第一個(gè)組分，通過(guò)高效液相色譜分析，得到2-甲?；?lián)噻吩。
5.如權(quán)利要求3所述的旱蓮草的提取方法，其特征在于，所述的步驟5還包含 步驟5. 2，將步驟5中柱層析得到的第三個(gè)組分采用己烷/醋酸按體積比為10 Γ0 :10的混合溶劑，柱層析得到α-三聯(lián)噻吩甲醇。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求I所述的旱蓮草的提取方法得到的旱蓮草甲醇提取物。
7.一種根據(jù)權(quán)利要求I所述的旱蓮草的提取方法得到的旱蓮草甲醇提取物的用途，其特征在于，該旱蓮草甲醇提取物用于防止脫發(fā)及促進(jìn)生發(fā)。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求2所述的旱蓮草的提取方法得到的旱蓮草三氯甲烷提取物。
9.一種根據(jù)權(quán)利要求2所述的旱蓮草的提取方法得到的旱蓮草三氯甲烷提取物的用途，其特征在于，該旱蓮草三氯甲烷提取物用于防止脫發(fā)及促進(jìn)生發(fā)。
10.一種根據(jù)權(quán)利要求3所述的旱蓮草的提取方法得到的α-三聯(lián)噻吩衍生物(I)的用途，其特征在于，該α-三聯(lián)噻吩衍生物(I)用于防止脫發(fā)及促進(jìn)生發(fā)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種旱蓮草的提取分離方法，該方法分離得到的提取物及用途，該方法包含步驟1，將旱蓮草干粉在甲醇中浸泡5~10天，旱蓮草干粉與甲醇的用量比例為按重量體積比為16~10，提取，過(guò)濾；重復(fù)0-10次，優(yōu)選地，重復(fù)1-3次，合并過(guò)濾液；步驟2，將上述過(guò)濾液減壓濃縮得到旱蓮草甲醇提取物。本發(fā)明提供的旱蓮草提取物能有效抑制TGF-β的出現(xiàn)，從而可以防止脫發(fā)，并促進(jìn)生發(fā)，可以應(yīng)用于藥學(xué)組合物及化妝品中。
文檔編號(hào)C07D333/22GK102716167SQ20121024252
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月13日
發(fā)明者金蓮錦 申請(qǐng)人:金蓮錦