專利名稱：顆粒溶解素的表達(dá)和制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及顆粒溶解素的表達(dá)和制備方法。
背景技術(shù)：
天然的顆粒溶解素(Granulysin, GNLY) 存在兩種形式，即15kDa形式和9kDa形式。目前商業(yè)化的顆粒溶解素只有15kDa形式(如ProSpec、Abnova和NovusBiologicals)，而且都含有較大的tag，可能會(huì)影響其生活學(xué)活性。ー些研究人員克服這個(gè)困難，嘗試了大腸桿菌、乳酸克魯維酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)15kDa顆粒溶解素，發(fā)現(xiàn)僅昆蟲(chóng)細(xì)胞可以表達(dá)15kDa顆粒溶解素，但是產(chǎn)量非常低(小于lmg/L)。目前研究中使用的9kDa顆粒溶解素大多來(lái)源于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，蛋白在表達(dá)過(guò)程中會(huì)易于形成包涵體，由于顆粒溶解素的蛋白序列中存在較多的ニ硫鍵，其在后續(xù)復(fù)性較為困難；此外，還可以通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄/翻譯表達(dá)系統(tǒng)和YT細(xì)胞脫顆粒提取獲得9kDa顆粒溶解素，但是得率非常低。綜上所述，目前兩種形式的顆粒溶解素的來(lái)源仍然非常有限，這可能由于顆粒溶解素蛋白對(duì)于宿主具有細(xì)胞毒作用，一些真核或病毒表達(dá)系統(tǒng)(例如釀酒酵母，昆蟲(chóng)細(xì)胞)易于受其毒性制約，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)不好，表達(dá)效率非常低。經(jīng)過(guò)對(duì)各種表達(dá)系統(tǒng)的篩選，意外地發(fā)現(xiàn)采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)顆粒溶解素蛋白，不僅表達(dá)量非常高，表達(dá)穩(wěn)定，并且蛋白可以獲得正確折疊加工，生物活性非常理想。同時(shí)，本發(fā)明人還優(yōu)化了蛋白的重組表達(dá)エ藝以及優(yōu)化了蛋白的純化工藝。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供顆粒溶解素的表達(dá)和制備方法。在本發(fā)明的第一方面，提供一種重組表達(dá)顆粒溶解素的方法，所述方法包括(I)提供表達(dá)載體，所述的表達(dá)載體中含有顆粒溶解素的表達(dá)盒；(2)將(I)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母,培養(yǎng)轉(zhuǎn)化有所述表達(dá)載體的重組畢赤酵母，從而表達(dá)顆粒溶解素。在另ー優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體線性化后轉(zhuǎn)化畢赤酵母。在另ー優(yōu)選例中，所述的表達(dá)盒包括以下操作性連接的元件A0X I啟動(dòng)子，釀酒酵母a-Factor信號(hào)肽編碼基因，顆粒溶解素，終止子。在另ー優(yōu)選例中，所述的顆粒溶解素選自全長(zhǎng)顆粒溶解素(即15kDa顆粒溶解素)，或在全長(zhǎng)顆粒溶解素首尾兩端截短的片段；較佳地，所述的首尾兩端截短的片段分子量為9kDa (即9kDa顆粒溶解素)。在另ー優(yōu)選例中，在釀酒酵母a-Factor信號(hào)肽編碼基因與顆粒溶解素基因之間,還包括蛋白酶酶切位點(diǎn)；或在顆粒溶解素的基因與終止子之間，還包括蛋白純化標(biāo)簽的編碼基因。在另ー優(yōu)選例中，所述的蛋白酶酶切位點(diǎn)是kex2蛋白酶酶切位點(diǎn)。在另ー優(yōu)選例中，所述的蛋白純化標(biāo)簽是HIS標(biāo)簽。
在另ー優(yōu)選例中，所述的顆粒溶解素的基因具有SEQ ID NO: I或SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列。在另ー優(yōu)選例中，步驟(2)中，表達(dá)顆粒溶解素時(shí)，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH在3.0-8. 0 ;和/或調(diào)節(jié)溫度為10-32で。在另ー優(yōu)選例中，表達(dá)顆粒溶解素時(shí)，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基(包括初始培養(yǎng)基以及表達(dá)過(guò)程中培養(yǎng)基)的PH在3. 8-5. 5 ;更佳地為4-5。在另ー優(yōu)選例中，表達(dá)顆粒溶解素時(shí)，調(diào)節(jié)溫度為23_31°C ;最佳地，調(diào)節(jié)溫度為25-30 °C。在另ー優(yōu)選例中，步驟(2)中，表達(dá)顆粒溶解素時(shí)，先以甘油為碳源進(jìn)行重組畢赤酵母的培養(yǎng)，待重組畢赤酵母濕重超過(guò)150g/L(較佳地180g/L)時(shí)，加入甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程持續(xù)60-100小時(shí)(較佳地70-90小時(shí)；更佳地80小時(shí))。在另ー優(yōu)選例中，步驟(2)中，表達(dá)顆粒溶解素時(shí)，首先使用含有4%(w/v)甘油且PH5的BSM培養(yǎng)基培養(yǎng)重組畢赤酵母菌體，培養(yǎng)溫度30°C ;等到溶氧急劇上升時(shí)，進(jìn)行甘油流加(較佳地，流加量是18±3ml/hr/升；更佳地,流加量是18. 15ml/hr/升)，待重組畢赤酵母濕重超過(guò)150g/L(較佳地180g/L)時(shí)停止流加甘油；隨后加入甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。在另ー優(yōu)選例中，流加的甘油中，每升50%w/v甘油溶液含有12ml的PTM1，PTM1成分為硫酸銅-5H206. 0g，碘化鈉0. 08g，硫酸錳-H2O 3. 0g，鑰酸鈉_2H20 0. 2g，硼酸0. 02g,氯化鈷0. 5g，氯化鋅20. 0g，硫酸亞鐵-7H2065. Og,生物素0. 2g，硫磺酸5. Oml0在另ー優(yōu)選例中，在顆粒溶解素的表達(dá)盒中，所述的顆粒溶解素的基因(5’或3’端)還連接ー純化標(biāo)簽的編碼基因；且，步驟(2)之后，還包括從培養(yǎng)基中分離顆粒溶解素的步驟，包括先采用親和層析柱(與純化標(biāo)簽相應(yīng)的親和層析柱，例如純化標(biāo)簽6XHIS對(duì)應(yīng)Ni柱)對(duì)培養(yǎng)上清進(jìn)行純化；之后采用陽(yáng)離子交換柱進(jìn)行純化。在另ー優(yōu)選例中，所述的純化標(biāo)簽是HIS標(biāo)簽(如包含6-12個(gè)HIS的標(biāo)簽);所述的親和層析柱是Ni柱；所述的陽(yáng)離子交換柱選自(但不限干)陽(yáng)離子交換柱S、SP、CM、MMC、adhere o在另ー優(yōu)選例中，所述的陽(yáng)離子交換柱是CM柱；更佳地，為HiTrap CM FF柱。在另ー優(yōu)選例中，在親和層析柱純化與陽(yáng)離子交換柱純化之間，還包括除鹽的步驟；較佳地，使用膜過(guò)濾系統(tǒng)超濾除鹽(例如應(yīng)用Labscale TFF system和Pellicon XL 50進(jìn)行除鹽)。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。


圖l、9_kD和15-kD GNLY蛋白的結(jié)構(gòu)以及用于畢赤酵母(P. pastoris)表達(dá)的pPIC9K-GNLYs-His表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。其中，(A)9_kD和15-kD GNLY蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖。(B) GNLY表達(dá)載體部分結(jié)構(gòu)的示意圖。圖2、9_kD GNLY搖瓶培養(yǎng)和優(yōu)化表達(dá)。(A)篩選高表達(dá)克隆，其中，1-8 :克隆編號(hào)，ctr :GS115/pPIC9K対照。、
(B)利用BMMY培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)，pH值的優(yōu)化。(C)利用BMMY培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)，溫度的優(yōu)化。(D)利用BMMY培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)，甲醇誘導(dǎo)濃度的優(yōu)化。圖3、9_kD GNLY P. pastoris 的發(fā)酵過(guò)程曲線。⑷培養(yǎng)過(guò)程中，發(fā)酵體系中溶氧、甲醇流加量、溫度、pH的變化。(B)培養(yǎng)過(guò)程中，菌體濕重(WCW)和0D600值的變化。(C)培養(yǎng)過(guò)程中，隨著誘導(dǎo)時(shí)間增加，蛋白表達(dá)情況。圖4、9_kD GNLY 的純化。 (A)從發(fā)酵上清液中純化9-kD GNLY。CS :澄清的上清，F(xiàn)T :流出液(flowthought)；E :洗脫液，M :蛋白分子量標(biāo)記。(B)使用梯度緩沖液B從CM-FF中洗脫9_kD GNLY。(C)應(yīng)用SDS-PAGE比較還原與非還原狀態(tài)下的9_kD和15_kD GNLY。圖5、15-kD GNLY的潛在的0_糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)。(A) 5-kD GNLY的潛在的O-糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)。87S、89S、142T :潛在0-糖基化位點(diǎn)。(B)利用LC-MS搜索肽段。圖6、GNLY的殺傷大腸桿菌XL-10和革蘭氏陽(yáng)性金黃色葡萄球菌NCTC8325的生物學(xué)活性測(cè)試。(A) 9-kD GNLY 的 CFU 測(cè)試；(B) 15-kD GNLY 的 CFU 測(cè)試；(C)9-kD GNLY的上下兩條電泳條帶所對(duì)應(yīng)蛋白的抑菌活性比較；以不同量的GNLY處理后，進(jìn)行細(xì)菌克隆的計(jì)數(shù)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入的研究，通過(guò)在多種宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)研究，發(fā)現(xiàn)采用畢赤酵母來(lái)表達(dá)顆粒溶解素蛋白或蛋白片段，可實(shí)現(xiàn)蛋白的高表達(dá)，且良好地保留蛋白的生物活性。本發(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)解決了現(xiàn)有技術(shù)中難以高效表達(dá)顆粒溶解素蛋白的技術(shù)難題，并為顆粒溶解素的生產(chǎn)提供了一種簡(jiǎn)單而穩(wěn)健的發(fā)酵エ藝。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。由于目前研究中使用的9kDa顆粒溶解素大多以大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行重組表達(dá)，蛋白在表達(dá)過(guò)程中會(huì)易于形成包涵體，由于顆粒溶解素的蛋白序列中存在較多的ニ硫鍵，其在后續(xù)復(fù)性較為困難；由于顆粒溶解素蛋白對(duì)于細(xì)胞具有毒性，一些真核或病毒表達(dá)系統(tǒng)(例如釀酒酵母，昆蟲(chóng)細(xì)胞)易于受其毒性制約，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)不好，表達(dá)效率非常低。經(jīng)過(guò)對(duì)各種細(xì)胞的表達(dá)篩選，意外地發(fā)現(xiàn)采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)顆粒溶解素蛋白，不僅表達(dá)量非常高，表達(dá)穩(wěn)定，并且蛋白可以獲得正確折疊加工，生物活性非常理想。同吋，本發(fā)明人還優(yōu)化了蛋白的重組表達(dá)エ藝以及優(yōu)化了蛋白的純化工藝。顆粒溶解素顆粒溶解素(GNLY蛋白)是ー種毒性分子，具有廣譜的抗病原微生物及殺傷腫瘤細(xì)胞作用，其作用機(jī)制涉及神經(jīng)酰氨和Caspase依賴和非依賴途徑,并與其ニ級(jí)結(jié)構(gòu)及所帶正電荷氨基酸相關(guān)。由于其廣譜的抗病原微生物作用及對(duì)正常宿主細(xì)胞的低毒性，它在消除耐藥性病原微生物方面是ー種很有吸引力的生物制劑。
作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的顆粒溶解素或其活性片段的核苷酸序列可以與SEQ ID NO: I或SEQ ID N0:2所示的序列基本上相同。編碼顆粒溶解素或其活性片段的編碼序列也可以是SEQ ID NO: I (表達(dá)15kDa形式的顆粒溶解素)或SEQ ID NO: 2 (表達(dá)9kDa形式的顆粒溶解素活性片段)所示的編碼區(qū)序列的簡(jiǎn)并的變異體。如本文所用，“簡(jiǎn) 并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列與SEQ ID NO: I或SEQ ID N0:2所編碼的氨基酸序列相同，但核苷酸序列與SEQ IDNO: I或SEQ ID NO:2所示序列有差別的核酸序列。例如，可以對(duì)SEQ ID NO: I或SEQ IDNO: 2進(jìn)行酵母細(xì)胞偏好的密碼子優(yōu)化，更佳地，進(jìn)行畢赤酵母細(xì)胞偏好的密碼子優(yōu)化。這些密碼子優(yōu)化的序列也被包含在本發(fā)明中。本發(fā)明的顆粒溶解素或其活性片段的核苷酸序列通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。還可用人工合成的方法來(lái)合成有關(guān)序列。目前，已經(jīng)可以完全通過(guò)化學(xué)合成法來(lái)得到編碼本顆粒溶解素(或其活性片段)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入表達(dá)載體和細(xì)胞中。表達(dá)系統(tǒng)本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的顆粒溶解素或其活性片段的編碼基因的表達(dá)載體，以及用本發(fā)明的載體經(jīng)基因工程轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的宿主細(xì)胞。本發(fā)明所述的表達(dá)載體是適用于畢赤酵母細(xì)胞表達(dá)的表達(dá)載體，其中含有顆粒溶解素的表達(dá)盒。如本文所用，所述的“表達(dá)盒”是指包含有表達(dá)目的多肽(本發(fā)明中為顆粒溶解素或其活性片段)所需的所有必要元件的基因表達(dá)系統(tǒng)，通常其包括一下元件啟動(dòng)子、編碼多肽的基因序列，終止子；此外還可選擇性包括信號(hào)肽編碼序列等；這些元件是操作性相連的。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的表達(dá)盒包括以下操作性連接的元件A0X I啟動(dòng)子，釀酒酵母a-Factor信號(hào)肽編碼基因，顆粒溶解素或其活性片段的基因，終止子。較佳地，在釀酒酵母a-Factor信號(hào)肽編碼基因與顆粒溶解素或其活性片段的基因之間，還包括蛋白酶酶切位點(diǎn)，從而用于后續(xù)將信號(hào)肽與顆粒溶解素表達(dá)產(chǎn)物分離；或在顆粒溶解素或其活性片段的基因與終止子之間，還包括蛋白純化標(biāo)簽的編碼基因，從而有利于后續(xù)的純化操作。多種蛋白純化標(biāo)簽可應(yīng)用于本發(fā)明的方法，例如，所述的蛋白酶酶切位點(diǎn)是kex2蛋白酶酶切位點(diǎn)，或所述的蛋白純化標(biāo)簽是6XHIS。將所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化有所述表達(dá)載體的重組畢赤酵母，從而可表達(dá)顆粒溶解素。較佳地，所述的表達(dá)載體先進(jìn)行線性化，之后轉(zhuǎn)化畢赤酵母。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物如畢赤酵母時(shí)，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法電轉(zhuǎn)化、磷酸鈣共沉淀法、顯微注射、脂質(zhì)體包裝等；較佳地選用電轉(zhuǎn)化。表達(dá)和純化方法由于顆粒溶解素是ー種具有毒性的蛋白，其對(duì)宿主會(huì)產(chǎn)生傷害，因此現(xiàn)有技術(shù)中還沒(méi)有找到ー種適合于進(jìn)行高效重組表達(dá)的較佳方案。大腸桿菌的原核表達(dá)形成包涵體，這可使得顆粒溶解素對(duì)宿主的毒性較小，但是包涵體面臨后續(xù)的復(fù)性純化問(wèn)題，表達(dá)效率低、步驟復(fù)雜，且獲得的蛋白活性不理想。釀酒酵母等一些真核細(xì)胞在表達(dá)顆粒溶解素的同時(shí)，受其毒性侵害，無(wú)法獲得高的表達(dá)產(chǎn)量。因此，本發(fā)明人進(jìn)行了大量的細(xì)胞篩選，最終確定采用畢赤酵母表達(dá)，其對(duì)于顆粒溶解素有一定的耐受能力，并通過(guò)優(yōu)化表達(dá)、純化方法，使得其廣量大大提尚。為了提高顆粒溶解素或其活性片段的表達(dá)量，本發(fā)明人還進(jìn)行了エ藝條件方面的優(yōu)化。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，表達(dá)顆粒溶解素時(shí)，調(diào)節(jié)初始培養(yǎng)基以及發(fā)酵過(guò)程中培養(yǎng)基的pH在3. 0-8. 0 ;更佳地，調(diào)節(jié)初始培養(yǎng)基的pH在3. 8-5. 5，更佳地為4_5。這種弱酸性的PH值環(huán)境，可獲得較高的蛋白表達(dá)量。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，表達(dá)顆粒溶解素時(shí)，調(diào)節(jié)溫度為10_32°C ;較佳地，調(diào)節(jié)溫度為23-31°C ;最佳地，調(diào)節(jié)溫度為25-30°C。而較低的溫度可影響顆粒溶解素的表達(dá)?？紤]到顆粒溶解素是具有殺細(xì)胞毒性的蛋白這ー特性，本發(fā)明人采取了先進(jìn)行重組畢赤酵母菌體生長(zhǎng)培養(yǎng)，在菌體生長(zhǎng)到足夠多時(shí)再進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)的發(fā)酵策略，從而最大程度地降低其對(duì)宿主細(xì)胞的毒性。因此，作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，表達(dá)顆粒溶解素時(shí)，先以 甘油為碳源進(jìn)行重組畢赤酵母的培養(yǎng)，待重組畢赤酵母濕重超過(guò)150g/L(較佳地180g/L)時(shí)，加入甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程持續(xù)60-100小時(shí)；較佳地70-90小時(shí)；更佳地80小吋。更多的培養(yǎng)時(shí)間對(duì)于蛋白表達(dá)量的増加不顯著。在發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，還可包括步驟從發(fā)酵培養(yǎng)基中分離顆粒溶解素。從培養(yǎng)產(chǎn)物中分離或純化顆粒溶解素可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)。例如可采用硫酸銨沉淀、離子交換、凝膠過(guò)濾法純化；或采用親和層析法純化，這些方法均包含在本發(fā)明中。然而，為了提高純化的效率，本發(fā)明人還進(jìn)行了純化工藝的優(yōu)化。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，在顆粒溶解素的表達(dá)盒中，所述的顆粒溶解素或其活性片段的基因還連接ー純化標(biāo)簽的編碼基因；從而，在純化時(shí)包括先采用親和層析柱(與純化標(biāo)簽相應(yīng)的親和層析柱，例如純化標(biāo)簽6 X HIS對(duì)應(yīng)Ni柱)對(duì)培養(yǎng)上清進(jìn)行純化；之后采用陽(yáng)離子交換柱進(jìn)行純化。由于顆粒溶解素的等電點(diǎn)比較高，因此通過(guò)陽(yáng)離子交換柱純化之后，純度比Ni柱純化進(jìn)ー步提高。在本發(fā)明的實(shí)施例中，采用這種兩步法的純化方法，使得 9kDa GNLY56mg/L, 15kD GNLYc 純化后可達(dá) 130mg/L。純化標(biāo)簽的選擇是本領(lǐng)域技術(shù)人員易于作出的，常用的純化標(biāo)簽例如HIS-tag(如 6XHIS)，GST-Tag，F(xiàn)LAG-Tag，HA-Tag，Myc-Tag等。純化標(biāo)簽的選擇與親和層析柱中親和介質(zhì)的選擇是關(guān)聯(lián)或?qū)?yīng)的，這種關(guān)聯(lián)或?qū)?yīng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)知識(shí)。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的純化標(biāo)簽是6XHIS ;所述的親和層析柱是Ni柱；所述的陽(yáng)離子交換柱可以是S、SP、CM、MMC, adhere等，例如，陽(yáng)離子交換柱是CM柱；更佳地，為HiTrapCM FF 柱。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，在親和層析柱純化與陽(yáng)離子交換柱純化之間，還包括除鹽的步驟。較佳地,使用Labscale TFF system和Pellicon XL 50進(jìn)行除鹽。顆粒溶解素的純化的其它步驟例如上清液的獲得、樣品澄清等可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。通過(guò)親和層析柱純化與陽(yáng)離子交換柱純化，本發(fā)明人分離獲得了分子量略有不同的顆粒溶解素9kDa或15kDa蛋白。經(jīng)分析，這種分子量的差異可能體現(xiàn)在其糖基化修飾的不同。但是，這種糖基化修飾的不同并不影響蛋白的抑菌活性。
利用本發(fā)明提供的方法，顆粒溶解素表達(dá)量超過(guò)100mg/L，通過(guò)兩步純化，純度可以達(dá)到95%以上。抑菌實(shí)驗(yàn)表明，9kDa和15kDa兩種形式的顆粒溶解素都具有抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的活性，并具有劑量依賴的關(guān)系，且9kDa形式的顆粒溶解素抑菌活性遠(yuǎn)高于15kDa顆粒
溶解素。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在干首次提供了 ー種簡(jiǎn)単，但是穩(wěn)健的發(fā)酵調(diào)控方式，利用畢赤酵母表達(dá)9kDa和15kDa兩種形式的顆粒溶解素，并 進(jìn)行了一系列的搖瓶表達(dá)條件優(yōu)化，并且發(fā)酵條件下表達(dá)量高達(dá)100mg/L，顯著高于之前文獻(xiàn)報(bào)道的方法。酵母表達(dá)的兩種形式的顆粒溶解素均具有良好的抑菌活性，呈現(xiàn)劑量依賴；且9kDa的抑菌活性明顯高于15kDa的顆粒溶解素；而現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)報(bào)道認(rèn)為15kDa的顆粒溶解素不具有抑菌活性。提供了一種純化方法，先通過(guò)親和層析捕獲蛋白，再使用離子交換層析的方法分離兩種不同修飾的顆粒溶解素。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)ー步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。I.材料菌株與質(zhì)粒P. pastoris 菌株 GS115、大腸桿菌 XLlO 感受態(tài)、pPIC9K 載體購(gòu)自 Invitrogen 公司；pMD18_T載體購(gòu)自Takara公司。試劑Yeast nitrogen base (YNB)購(gòu)自 BD 公司；RPMI_1640 培養(yǎng)基購(gòu)自 Hyclone 公司；胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；酵母抽提物和蛋白胨購(gòu)自0X0ID公司；BCA蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Pierce公司；d_Sorbitol、d-biotin、質(zhì)粒抽提試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、膠回收試劑盒、DNA聚合酶、T4DNA鏈接酶、限制性內(nèi)切酶、蛋白marker和PAGE配制相關(guān)試劑購(gòu)自上海生エ；細(xì)胞分離液 Ficoll-Hypaque*-購(gòu)自 Solarbio 公司；G418 和 EndoglycosidaseH (Endo H)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；EZ-ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BiologicalIndustries 公司；in his-tag mouse mAb 購(gòu)自 Abmart 公 ロ」；二手幾 anti-mouse IgG-HRP 購(gòu)自 BioLegend 公司；SV Total RNA Isolation System 購(gòu)自 Promega 公司；Turbo 逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自北進(jìn)原平皓公司；含硅泡敵購(gòu)自江蘇賽歐信越消泡劑有限公司。BMMY培養(yǎng)基、BMGY培養(yǎng)基、MGY培養(yǎng)基、BSM培養(yǎng)基等配制參見(jiàn)Invitrogen公司畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)■，幾種主要成分分別購(gòu)自Yeast Nitrogen Base (YNB)購(gòu)自BD公司；Yeastextract和Trypton購(gòu)自0X0ID公司；其他化學(xué)試劑購(gòu)自上海生エ和國(guó)藥集団。儀器電子分析天平和pH計(jì)購(gòu)自梅特勒-托利多公司；鏇潤(rùn)振蕩儀購(gòu)自ScientificIndustries公司；電泳儀，垂直電泳槽、水平電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自天能公司；半干轉(zhuǎn)膜儀、電轉(zhuǎn)儀購(gòu)自Bio-Rad公司；化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀購(gòu)自UVITEC公司；高壓滅菌鍋購(gòu)自Hirayama 公司；臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Centrifuge 5810R、Centrifuge 5415R)購(gòu)自 eppendorf公司；超凈工作臺(tái)、搖床、恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自上海智誠(chéng)公司；PCR儀購(gòu)自德國(guó)Biometra公司；微量移液器購(gòu)自法國(guó)Gilson公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自Themo公司；AKTA explorer^LabscaleTFF System 和 Pellicon XL(5kDa)購(gòu)自 Millipore 公司。BioFlo 115 Benchtop Fermentor 購(gòu)自 New Brunswick Scientific 公司；FlexStand system 矛ロ 0. 45 y m microfiltration cartridge 購(gòu)自 GE healthcare ；LTQ linearIT MS 購(gòu)自 Thermo ；EttanTM MDLC HPLC system 購(gòu)自 GE healthcare。溶液Ni 柱結(jié)合緩沖液300mM NaCl,20mM Tris-HCl, pH7. 5 ；Ni 柱洗滌緩沖液40mM 咪唑，300mM NaCl,20mM Tris-HCl, pH7. 5 ；Ni 柱洗脫緩沖液400mM 咪唑，300mM NaCl,20mM Tris-HCl, pH7. 0 ； Buffer A 20mM 憐酸，pH7. 0 ；Buffer B 1M NaCl，20mM 磷酸，pH7. 0。PTMl 液硫酸銅-5H206. Og,碘化鈉 0. 08g,硫酸錳 _H203. Og,鑰酸鈉 _2H20 0. 2g，硼酸0. 02g,氯化鈷0. 5g，氯化鋅20. Og,硫酸亞鐵-IW2O 65. Og,生物素0. 2g，硫磺酸5. Oml，用純化水定容至I升，過(guò)濾后室溫保存。引物GNLY的RT-PCR弓丨物如下PMD18T-GNLY-Fw CTCCTTGCAGCCATGCTCCTG(SEQ ID NO:3)；PMD18T-GNLY-Rv GAGGGGACCTGTAGAAGGTATAC(SEQ ID NO:4)。a-Factor 引物Pl-Fw ATGGATCCAAACGATGAGATTTC(SEQ ID NO:5)；P2-9-Rv GACAGGTCCTGTAGTCACGGCCTCTTTTCTCGAGAGATACCC(SEQ ID NO :6)；P2-15-Rv GTAGTACTCAGGGCTCAGACGTCTTTTCTCGAGAGATACCC(SEQ ID NO:7)。GNLY P3-9-Fw CTCGAGAAAAGAGGCCGTGACTACAGGACCTGTC(SEQ IDNO:8)；P3-15-Fw CTCGAGAAAAGACGTCTGAGCCCTGAGTACTAC(SEQ ID NO:9) P4-9-Rv CTGAATTCTCAATGGTGATGGTGATGATGCCTGAGGTCCTCACAGATCTGCTGGGCAG(SEQ IDNO:10)；P4_15_Rv :CTGAATTCTCAATGGTGATGGTGATGATGGAGGGGACCTGTAGAAGG(SEQ ID NO: 11)。II.實(shí)驗(yàn)方法顆粒溶解素cDNA克隆的構(gòu)建I、PBMCs 總 RNA 的提取使用Promega 的 SV Total RNA Isolation System試劑盒從PBMC 細(xì)胞中(PBMC 中含有約10%的NK細(xì)胞，含有GNLY的mRNA)抽提總RNA，具體操作步驟參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。2、RT-PCR
(I)在一個(gè) RNase-free 的 Ep 管中加入下列試劑I ii I oligo (dT) 12-18 (500 U g/ml) ；2ng-5 u g 總 RNA ;1 y IlOmM dNTP Mix(dATP, dGTP, dCTP 和 dTTP 均為 IOmM)；加入RNase-free的去離子水使總體積達(dá)到12ii I。(2)將上述混合物于65°C加熱5分鐘，立即放冰上，稍稍離心。(3)加入下列試劑4 u 15 XFirst-Strand Buffer ；2 U 10. IM DTT ； I u I Turbo 逆轉(zhuǎn)錄酶(200 單位)；lul RNase OUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor(40 單位/U I)。37°C孵育50分鐘，然后70°C孵育15分鐘使體系失活，得到總cDNA。3、顆粒溶解素cDNA的PCR擴(kuò)增和pMD18_T克隆的構(gòu)建(I)以上步cDNA為模板，使用基因特異性的引物PMD18T-GNLY-FW和PMD18T-GNLY-RV來(lái)擴(kuò)增目的基因，切膠回收特異片段。
(2)使用Taq酶對(duì)上步得到片段進(jìn)行加A反應(yīng)，回收后連接到pMD18_T載體，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化XLlO感受態(tài)；(3)挑選陽(yáng)性克隆，PCR鑒定后送樣測(cè)試，所得陽(yáng)性克隆命名為PMD18-T-GNLY ;其插入片段序列與NCBI上NM_006433. I序列完全一致。顆粒溶解素酵母表達(dá)載體的構(gòu)建I、具有Kex2單ー蛋白酶酶切位點(diǎn)的a -因子(a -Factor)信號(hào)肽片段編碼序列的擴(kuò)增以pPIC9k質(zhì)粒為模板，在引物Pl-Fw和P2-9-RV的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為先94°C 2分鐘；然后94°C 30秒，55°C 40秒，72°C 30秒，共32個(gè)循環(huán)；最后72°C 10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到一條大小約255bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收目的條帶，命名為“ a-Factor-9-”。2、9kDa GNLY 基因的擴(kuò)增以質(zhì)粒pMD 18-T-GNLY 為模板，在引物 P3_9_Fw 和 P4_9_Rv (后續(xù)擴(kuò)增 15kDa GNLY基因時(shí)，采用引物P3-15-Fw和P4-15-Rv)的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為先940C 2分鐘；然后94°C 30秒，55°C 40秒，72°C 40秒，共30個(gè)循環(huán)；最后72°C 10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到一條大小約240bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收目的條帶，該片段命名為“_9kDa GNLY-”。3、含有信號(hào)肽的重組9kDa GNLY基因編碼基因的擴(kuò)增以獲得的“a -Factor-9-”和“-9kDa GNLY-”為模板，在引物 Pl-Fw 和 P4_9_Rv (后續(xù)制備含有a-Factor信號(hào)肽的重組15kD GNLY基因時(shí)，采用引物PトFw和P4_15-Rv)的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并通過(guò)引物在序列兩端分別添加上限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I識(shí)別位點(diǎn)。PCR反應(yīng)條件為94°C 2分鐘；94°C 45秒，55°C 45秒，72°C I分鐘，循環(huán)32次；最后72°C 10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到一條大小約為500bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收目的條帶，將該P(yáng)CR產(chǎn)物的基因命名為“ a -Factor-9kD GNLY-His”。4、重組9kD GNLY的畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I對(duì)上步獲得的PCR產(chǎn)物(a -Factor_9kDGNLY-His)進(jìn)行雙酶切，再將酶切片段與經(jīng)相同酶雙酶切的質(zhì)粒pPIC9K用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性重組子，提質(zhì)粒，酶切鑒定，將鑒定后的陽(yáng)性克隆命名為pPIC9K-9kD GNLY-His，并送上海生エ測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示插入PPIC9K的BamH I和EcoR I的識(shí)別位點(diǎn)間的DNA序列與預(yù)期結(jié)果完全一致。5、重組15kDa GNLY的畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建重組15kDa GNLY的畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程與上述9kDa GNLY完全一致，不同之處僅在于對(duì)應(yīng)使用引物列表中標(biāo)記“15”字樣的引物替換標(biāo)記“9”字樣的引物即可。所得測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆命名為pPIC9K-15kDa GNLY-His。重組9kDa或15kDa GNLY搖瓶表達(dá)條件優(yōu)化⑴pH優(yōu)化
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配制含有不同pH值(pH4. 0、pH5. 0、pH6. 0)的0. IM磷酸鉀緩沖液的BMMY培養(yǎng)基，誘導(dǎo)表達(dá)60h后,使用Western bloting檢測(cè),姆個(gè)pH值平行2份。(2)溫度優(yōu)化將使用BMMY培養(yǎng)基重懸的菌體均分成6份，置于20°C、25°C、30°C搖床各兩份，誘導(dǎo)表達(dá)60h后，使用Western bloting檢測(cè)。(3)甲醇濃度優(yōu)化配制含有不同初始甲醇濃度(0. 5%(v/v)、1. 0%(v/v)、1. 5%(v/v))的BMMY培養(yǎng)基，誘導(dǎo)表達(dá)60h后,使用Western bloting檢測(cè),姆個(gè)濃度平行2份。重組9kD或15kD GNLY的發(fā)酵表達(dá)(I) 一級(jí)種從凍存的工作菌種庫(kù)接種到5ml MGY培養(yǎng)基，30°C，250rpm培養(yǎng)36-48h至0D6QQ=2-6，此為發(fā)酵ー級(jí)種；(2) ニ級(jí)種從 I 級(jí)種接 Iml 到 200ml pH5. OBMGY 培養(yǎng)基中，30°C，250rpm 培養(yǎng)12-18h，至0D6QQ=2-6，此為發(fā)酵ニ級(jí)種；(3)發(fā)酵準(zhǔn)備發(fā)酵罐組裝及相關(guān)試劑準(zhǔn)備、滅菌等工作；⑷Batch階段將ニ級(jí)種接入含4L pH5. 0的BSM培養(yǎng)基(基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基)的14L發(fā)酵罐中，補(bǔ)充6ml/L的PTMl溶液，溫度控制在30°C，初始攪拌速度400rpm，通過(guò)補(bǔ)加氨水將pH維持在5. 0左右，初始DO 90%以上，隨著菌體的生長(zhǎng)DO會(huì)逐漸下降并維持平衡，將平衡控制在30-40%之間；(5)轉(zhuǎn)化期當(dāng)DO開(kāi)始急速上升時(shí)意味著原有培養(yǎng)基中甘油耗盡，需要持續(xù)補(bǔ)充含有12ml/L PTMl的50%甘油溶液，流速為12ml/h/L，這個(gè)過(guò)程維持2_3h至DO達(dá)到40或濕重在180g/L附近；(6)甲醇誘導(dǎo)階段當(dāng)濕重達(dá)到180g/L附近時(shí)，停止甘油流加，溶解氧會(huì)迅速上升，隨后開(kāi)始按“Invitoogen發(fā)酵(畢赤酵母發(fā)酵)手冊(cè)三步法”流加含有12ml/L PTMl的甲醇溶液(三步法包括三個(gè)流加速度，由先到后甲醇流加量分別是3. 6ml/hr/L、7. 3ml/hr/L、10. 9ml/hr/L)。溫度控制在25°C;攪拌速度IOOOrpm左右，DO控制在20-40%之間(平均約30%)，到發(fā)酵后期需要通純氧維持DO穩(wěn)定。發(fā)酵持續(xù)60h左右終止。重組9kD或15kD GNLY的純化(I)固液分離發(fā)酵結(jié)束之后，使用NaOH緩緩地將發(fā)酵液pH調(diào)節(jié)到7.5，IOOOOg, 20min離心，收集上清液；(2)樣品的澄清使用 Flex Stand system 和 0. 45 U m microfiltrationcartridge將上步獲得上清液進(jìn)ー步過(guò)濾；
(3)蛋白的捕獲使用XK26/20column和Ni-agarose組裝Ni-柱(親和層析柱)，結(jié)合緩沖液平衡后，直接上樣上步澄清樣品，流速700ml/h ;上樣結(jié)束之后先用結(jié)合緩沖液沖洗5個(gè)柱體積，再用洗滌緩沖液沖洗5個(gè)柱體積，最后用洗脫緩沖液洗脫目的蛋白；(4)除鹽使用Labscale TFF system和Pellicon XL50對(duì)上步洗脫下來(lái)的蛋白進(jìn)行Buffer置換,置換兩個(gè)樣品體積的Buffer A ;置換之后0. 45 y m濾膜過(guò)濾備用；(5)精細(xì)純化使用 AKTA Explorer System,將 Buffer A 平衡 HiTrap CM FF_5ml柱，直接上樣上步除鹽并過(guò)濾后的樣品，上樣完成之后，先用Buffer A沖洗，再分別用30%Buffer B、60% Buffer B、80% Buffer B 洗脫樣品，最 后用 100% Buffer B 再生柱子，并用ddH20和20%乙醇沖洗并保存柱子；(6)保存將上步各濃度Buffer B洗脫下來(lái)的蛋白，用PBS置換緩沖液之后凍存?zhèn)溆?。重組9kD或15kD GNLY的鑒定I、LC-MS 鑒定(I) SDS-PAGE在還原條件下分離上述60%B洗脫下來(lái)的GNLY，分別切膠回收上下兩條帶，還原并燒基化之后用trypsin酶切消化；(2)消化后的肽段使用 Thermo LTQ linear IT MS 和 Ettan MDLC HPLC system聯(lián)用分析；(3)相關(guān)參數(shù)LC 分離方式C18 Reversed Phase Capillary Column流動(dòng)相溶液A 0. l%(v/v)甲酸溶于ddH20 ；B :100%乙腈離子類型正離子質(zhì)譜方法Data_DependentMS/MS蛋白修飾extra57Da on Cys,及 extra 16Da on Met檢索方法SEQUEST;P印tide filter 1+, I. 9 ；2+,2. 50 ；3+,3. 752、數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)N/0-糖基化位點(diǎn)使用ExPASy SIB Bioinformatics Resource Portal 數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)軟件預(yù)測(cè)N/0-糖基化位點(diǎn)，其中N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)鏈接http://www. cbs. dtu. dk/services/NetNGlyc/ ;0_ 糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)鏈接http://www. cbs. dtu. dk/services/YinOYang/。重組9kDa或15kDa GNLY的活性檢測(cè)(l)5ml LB培養(yǎng)基大腸桿菌菌株XL-10或金黃色葡萄球菌NCTC-8325單菌落，250rpm，37°C培養(yǎng)至OD600=O. 6 0. 8 (約2_3h)，此時(shí)E. coli處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；(2)取步驟I)中的Iml菌液,于室溫1500g離心5min ；(3)棄上清，用 Iml (含 0. 03%LB 的 IOmM PPB)的重懸；(4)測(cè)量重懸菌液的0D_值，用(含0. 03%LB的IOmM PPB)調(diào)整菌液濃度至2 XlOVml (以O(shè)D600=I時(shí)，菌液濃度為5 XlOVml計(jì)算)；(5)對(duì)于每個(gè)檢測(cè)的蛋白質(zhì)濃度n，準(zhǔn)備100 U I濃度為2n的顆粒溶解素的溶液與IOOu I的稀釋后(步驟(4))的菌液混合；顆粒溶解素儲(chǔ)液濃度為270uM(2. 7mg/ml，BCA定
量)；(6) 37 °C 100_160rpm 搖菌鮮育 3h ；
(7)取30 ill孵育后的菌液用(含0. 03%LB的IOmM PPB)稀釋至300 U I,涂LB板；(8)置37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 24h，待克隆清晰可見(jiàn)；(9)統(tǒng)計(jì)各板上克隆的數(shù)目并計(jì)算CFU。III.實(shí)施例 實(shí)施例I、GNLY表達(dá)載體的構(gòu)建GNLY全長(zhǎng)145個(gè)氨基酸，其中包括預(yù)測(cè)的信號(hào)肽，位于氨基酸第1_22位。在殺傷性T細(xì)胞和NK細(xì)胞中，GNLY以15kDa的形式合成，然后首位剪切后形成9kDa的形式(如圖 1A)。
本發(fā)明人將9kDa和15kDa GNLY的編碼序列連接到釀酒酵母a -Factor信號(hào)肽3’末端，并僅保留kex2蛋白酶的酶切位點(diǎn)，最后通過(guò)BamH I和EcoR I酶切位點(diǎn)克隆到pPIC9K酵母表達(dá)載體中。這樣通過(guò)甲醇誘導(dǎo)AOX I啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)其下游蛋白的表達(dá)。GNLY表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖如圖IB所示。實(shí)施例2、GNLY表達(dá)菌株的篩選和搖瓶表達(dá)條件優(yōu)化使用Sal I將pPIC9K-GNLYs_His線性化之后，電轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115菌株。分別從培養(yǎng)9kDa和15kDa GNLY表達(dá)菌株的YPDG平板上各挑選9個(gè)克隆進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。使用Western blotting檢測(cè)這些克隆培養(yǎng)上清中GNLY表達(dá)的情況。以9kDa GNLY克隆表達(dá)為例，大多數(shù)的克隆均有效地表達(dá)出9_kD GNLY(如圖2A)，表達(dá)量最高的克隆命名為GS115/9kDa GNLY-His。Western blotting顯示酵母表達(dá)出來(lái)的9kDa GNLY分子量介于10_15kDa之間，且為分子量非常相近的兩條帶(15%gel)(為不同程度的糖基化修飾形式)。15kDa GNLY的表達(dá)量明顯比9kDa GNLY要高，且各表達(dá)克隆之間的差異并不明顯。為了給發(fā)酵表達(dá)提供一些基本的發(fā)酵參數(shù)指導(dǎo)，本發(fā)明人先在搖瓶水平對(duì)GNLY表達(dá)條件進(jìn)行了初步優(yōu)化，首先選用不同pH值BMMY對(duì)GS115/9kDaGNLY-His進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。由圖2B可知，在弱酸性環(huán)境下(pH4.0或pH5.0)，9kDa GNLY表達(dá)量較高。本發(fā)明人也檢測(cè)了溫度對(duì)9-kD GNLY誘導(dǎo)表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)低溫會(huì)影響9kDa GNLY的表達(dá)，溫度適宜在25-30°C，如圖2C。最后，還檢測(cè)了誘導(dǎo)的甲醇濃度對(duì)9kDa GNLY表達(dá)的影響，提高誘導(dǎo)的甲醇濃度，有利于9kDa GNLY的表達(dá)，甲醇濃度適宜在l_2%(v/v)如圖2D。實(shí)施例3、GNLY中試規(guī)模的發(fā)酵表達(dá)本發(fā)明人采用分批補(bǔ)料培養(yǎng)(fed-batch cultivation)法培養(yǎng)表達(dá)菌GS115/9_kDGNLY-His，并進(jìn)行了方法流程的優(yōu)化。本發(fā)明人首先使用含有4%(v/v)甘油的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(pH5. 0)在batch階段擴(kuò)增菌體(后續(xù)調(diào)節(jié)pH使之維持pH5. 0)，培養(yǎng)溫度30°C。等到DO急劇上升時(shí)(約培養(yǎng)22小時(shí))，batch階段結(jié)束，菌體濕重達(dá)到118. 7g/L。隨后進(jìn)入轉(zhuǎn)換期即甘油流加期(流加量是18. 15ml/hr/升，流加的甘油中，每升50%w/v甘油溶液含有12ml的PTMl，PTMl是一種酵母生長(zhǎng)需要的微量元素鹽溶液，成分為硫酸銅_5H20 6. OgJft化鈉0. 08g,硫酸錳-H2O 3. Og,鑰酸鈉-2H20 0. 2g，硼酸0. 02g,氯化鈷0. 5g，氯化鋅20. Og,硫酸亞鐵_7H20 65. Og,生物素0. 2g，硫磺酸5. Oml)，經(jīng)過(guò)約4個(gè)小時(shí)的生長(zhǎng)菌體濕重進(jìn)一步增加，達(dá)到186.6g/L。此時(shí)停止流加甘油，菌體呼吸活力下降，DO迅速上升；隨后開(kāi)始進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)，菌體呼吸活力恢復(fù)，DO開(kāi)始逐漸下降。在甲醇誘導(dǎo)階段，因?yàn)榫w對(duì)甲醇有一個(gè)適應(yīng)階段(3-4小時(shí))，因此需要逐步提高甲醇濃度，避免甲醇過(guò)量積累對(duì)菌體產(chǎn)生毒性。發(fā)酵結(jié)束之后，菌體濕重達(dá)到512. 4g/L。盡管菌體濕重在誘導(dǎo)過(guò)程中一直在增加，但是蛋白的表達(dá)量在培養(yǎng)80小時(shí)基本達(dá)到平衡，不再累計(jì)。因此，在此時(shí)結(jié)束發(fā)酵比較適合。表達(dá)菌GS115/9kDa GNLY-His整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，各參數(shù)的變化情況如圖3A-C。表達(dá)菌GS115/15kDa GNLY-His 的發(fā)酵過(guò)程基本同表達(dá)菌 GSll5/9kDaGNLY_HiS。實(shí)施例4、GNLY純化與鑒定以9-kD GNLY純化為例，發(fā)酵結(jié)束之后，經(jīng)過(guò)離心和澄清，用BCA測(cè)定發(fā)酵液中總蛋白含量為I. 6g/L，并通過(guò)SDS-PAGE估算9kDa GNLY的濃度超過(guò)100mg/L。

經(jīng)過(guò)兩步純化(Ni柱純化和HiTrap CM FF柱純化)實(shí)際獲得9kDa GNLY56mg/L，15kDa GNLYc純化后可達(dá)130mg/L，且內(nèi)毒素含量低于0. lEU/iig蛋白。由于GNLY帶有his-tag，因此，將發(fā)酵液直接上樣Ni柱。洗脫之后經(jīng)SDS-PAGE，為緊密兩連的兩條帶。同時(shí)由于9kDa和15kDa GNLY的等電點(diǎn)比較高(>9. 3)，因此通過(guò)陽(yáng)離子交換柱CM-FF純化之后，純度進(jìn)一步提高，但是依然為兩條分子量很接近的條帶，如圖4A。本發(fā)明人在用CM-FF做進(jìn)一步純化時(shí)發(fā)現(xiàn)，這兩條帶可以通過(guò)不同濃度的高鹽緩沖液進(jìn)行分離，如圖4B。通過(guò)比較還原與非還原狀態(tài)下的9kDa和15kDa GNLY發(fā)現(xiàn)，這兩條帶并非因?yàn)榉肿觾?nèi)二硫鍵錯(cuò)配產(chǎn)生的，如圖4C。經(jīng)過(guò)ExPASy數(shù)據(jù)庫(kù)N-糖基化預(yù)測(cè)軟件分析，9kDa和15kDa GNLY均沒(méi)有N-糖基化位點(diǎn)。經(jīng)過(guò)該數(shù)據(jù)庫(kù)0-glycosylation預(yù)測(cè)軟件YinOYangl. 2預(yù)測(cè)，15-kD GNLY有三個(gè)0-糖基化位點(diǎn)，如圖5A。因此提示上下兩條帶是不同程度的0-糖基化造成的。為了排除上下兩條帶可能是由于蛋白降解造成的這一因素，本發(fā)明人從SDS-PAGE中將這兩條帶分別切下，酶切消化后用LC-MS檢測(cè)。質(zhì)譜結(jié)果顯示，上下兩條帶均是GNLY。搜索到的肽段對(duì)應(yīng)15kDa GNLY全長(zhǎng)蛋白的位置如圖5B所示。幸運(yùn)的是，本發(fā)明人從上下兩條帶中均檢測(cè)到了重組GNLY首位的肽段，提示上下兩條帶并非由于蛋白降解造成的。同時(shí)，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，兩次質(zhì)譜均未檢測(cè)到由87位-117位之間的氨基酸組成的肽段，而這一段正是潛在的0-糖基化位點(diǎn)存在的地方。這一結(jié)果進(jìn)一步支持了了上下兩條帶是不同程度的0-糖基化造成的這一結(jié)論。實(shí)施例5、GNLY活性檢測(cè)為了檢測(cè)酵母表達(dá)的GNLY具有生物學(xué)活性，特別是9kDa GNLY具有廣譜的殺菌活性，本發(fā)明人分別選用了革蘭氏陰性的大腸桿菌XL-10和革蘭氏陽(yáng)性金黃色葡萄球菌NCTC-8325作為靶細(xì)胞，通過(guò)CFU法檢測(cè)GNLY的抑菌活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，9kDa GNLY在較低的濃度下就對(duì)于XL-10和NCTC-8325的生長(zhǎng)顯示出很強(qiáng)抑制效果，并具有劑量依賴的關(guān)系(如圖6A),15kDa GNLY也顯示出了一定的抑菌能力。但是9kDa GNLY抑菌能力明顯強(qiáng)于15kDaGNLY，如圖6A和6B。進(jìn)一步分析表明，9kDa GNLY的上下兩條條帶，即9kDa GNLY-上肽段和9kDa GNLY-下肽段這兩條帶所對(duì)應(yīng)的蛋白在抑菌活性上無(wú)明顯區(qū)別(如圖6C)。討論重組9kDa GNLY有廣譜的抗菌活性，能夠殺死革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性、甚至可以在體外直接殺死結(jié)核分支桿菌。此外，GNLY還與腫瘤、瘧疾、麻風(fēng)、移植、皮膚病和生殖并發(fā)癥等有廣泛的臨床相關(guān)性。最近，還有一些研究使用GNLY作為佐劑經(jīng)行疫苗研究和開(kāi)發(fā)。越來(lái)越多的證據(jù)表明，GNLY是一個(gè)具有臨床應(yīng)用潛力和開(kāi)發(fā)價(jià)值的蛋白分子。本發(fā)明首次利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)成功地表達(dá)出了 9kDa GNLY和15kDa GNLY,并利用a-因子分泌肽，將GNLY分泌到培養(yǎng)上清中，便于后續(xù)的純化工作。搖瓶水平的表達(dá)條件優(yōu)化顯示，GNLY在偏酸性培養(yǎng)基中表達(dá)量較高，可能與其在酸性環(huán)境下細(xì)菌裂解活性較低或酸性環(huán)境下中性蛋白酶活性較低有關(guān)。在發(fā)酵研究中，本發(fā)明人首先嘗試了一種簡(jiǎn)單的發(fā)酵策略，即甘油培養(yǎng)階段和甲醇的恒定流速的誘導(dǎo)階段。整個(gè)發(fā)酵過(guò)程總體比較穩(wěn)定，菌體濕重穩(wěn)步增加，目的蛋白也在持續(xù)累積。由于本發(fā)明人手頭沒(méi)有抗GNLY的抗體， 因此為了方便前期篩選和鑒定工作，本發(fā)明人在蛋白的C端添加了 his-tag，也方便了純化工作。同時(shí)本發(fā)明人還利用GNLY等電點(diǎn)比較高的特點(diǎn)，在親和層析之后，通過(guò)陽(yáng)離子交換柱進(jìn)一步純化，純度可到95%以上(不區(qū)分上下兩條帶)，即使區(qū)分上下兩條帶也可達(dá)到90%以上純度。然而有文章報(bào)道，帶有his-tag可能會(huì)影響蛋白的活性，因此在某些的特殊情況下，本發(fā)明人完全可利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)制備不帶任何tag的重組GNLY,純化也比較簡(jiǎn)單。活性實(shí)驗(yàn)證實(shí)9kDa GNLY具有良好的抑菌活性，其對(duì)于革蘭氏陰性菌的殺傷能力強(qiáng)于革蘭氏陽(yáng)性菌，可能與革蘭氏陽(yáng)性菌具有莢膜有關(guān)，莢膜能一定程度上阻礙GNLY與細(xì)菌細(xì)胞膜接觸，降低GNLY對(duì)菌體的傷害。15kDa GNLY也顯示出一定的抑菌能力，但是明顯比9kDa GNLY要弱。這個(gè)結(jié)果與之前報(bào)道15kDa GNLY在體外沒(méi)有抑菌能力并不完全一致。已經(jīng)證實(shí)，GNLY通過(guò)電荷作用結(jié)合到細(xì)菌細(xì)胞膜上，通過(guò)改變膜的通透性殺死細(xì)菌。因此，本發(fā)明人認(rèn)為9kDa GNLY和15kDa GNLY都具有殺菌活性，只是15kDa GNLY殺菌活性明顯低于 9kDa GNLY。綜上所述，本發(fā)明人利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，成功表達(dá)出了具有生物活性的GNLY。同時(shí)利用簡(jiǎn)單穩(wěn)健的發(fā)酵策略，可大量制備高純度、低內(nèi)毒素的GNLY。為GNLY的科學(xué)研究和臨床應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種重組表達(dá)顆粒溶解素的方法，其特征在于，所述方法包括 (1)提供表達(dá)載體，所述的表達(dá)載體中含有顆粒溶解素的表達(dá)盒； (2)將(I)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化有所述表達(dá)載體的重組畢赤酵母，從而表達(dá)顆粒溶解素。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的表達(dá)盒包括以下操作性連接的元件AOX I啟動(dòng)子，釀酒酵母a-Factor信號(hào)肽編碼基因，顆粒溶解素，終止子。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，在釀酒酵母a-Factor信號(hào)肽編碼基因與顆粒溶解素基因之間，還包括蛋白酶酶切位點(diǎn)；或 在顆粒溶解素的基因與終止子之間，還包括蛋白純化標(biāo)簽的編碼基因。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的顆粒溶解素的基因具有SEQID NO: I或SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，表達(dá)顆粒溶解素時(shí)，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH在3. 0-8.0 ;和/或 調(diào)節(jié)溫度為10-32 °C。
6.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，表達(dá)顆粒溶解素時(shí)，先以甘油為碳源進(jìn)行重組畢赤酵母的培養(yǎng)，待重組畢赤酵母濕重超過(guò)150g/L時(shí)，加入甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程持續(xù)60-100小時(shí)。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，表達(dá)顆粒溶解素時(shí)，首先使用含有按照質(zhì)量體積比4%的甘油且pH5. 0的BSM培養(yǎng)基培養(yǎng)重組畢赤酵母菌體，培養(yǎng)溫度30°C;等到溶氧急劇上升時(shí)，進(jìn)行甘油流加，待重組畢赤酵母濕重超過(guò)150g/L時(shí)停止流加甘油；隨后加入甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，甘油的流加量是18±3ml/hr/升。
9.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，在顆粒溶解素的表達(dá)盒中，所述的顆粒溶解素的基因還連接一純化標(biāo)簽的編碼基因；且，步驟(2)之后，還包括從培養(yǎng)基中分離顆粒溶解素的步驟，包括先采用親和層析柱對(duì)培養(yǎng)上清進(jìn)行純化；之后采用陽(yáng)離子交換柱進(jìn)行純化。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述的純化標(biāo)簽是HIS標(biāo)簽；所述的親和層析柱是Ni柱；所述的陽(yáng)離子交換柱選自陽(yáng)離子交換柱3、5 、011、麗(、&(11^1^。
全文摘要
本發(fā)明涉及顆粒溶解素的表達(dá)和制備方法。本發(fā)明人首次采用畢赤酵母來(lái)表達(dá)顆粒溶解素蛋白或蛋白片段，可實(shí)現(xiàn)蛋白的高表達(dá)，且良好地保留蛋白的生物活性。本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)中難以高效表達(dá)顆粒溶解素蛋白的技術(shù)難題，為顆粒溶解素的生產(chǎn)提供了一種簡(jiǎn)單而穩(wěn)健的發(fā)酵工藝。
文檔編號(hào)C07K1/18GK102757977SQ20121025050
公開(kāi)日2012年10月31日 申請(qǐng)日期2012年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月19日
發(fā)明者孫潔, 李光偉, 欒淦, 肖衛(wèi)華, 郭雨剛, 鐘永軍 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)