專(zhuān)利名稱(chēng)：從雞蛋清中提取核黃素結(jié)合蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從雞蛋清中提取核黃素結(jié)合蛋白的方法。
背景技術(shù)：
研究發(fā)現(xiàn)雞蛋中含有大量生物活性成分，如卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、免疫球蛋白、卵粘蛋白、溶菌酶等。核黃素結(jié)合蛋白(riboflavin binding protein, RBP)又叫卵黃素蛋白或核黃素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)核黃素(維生素B2)，在雞胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。此夕卜，核黃素結(jié)合蛋白還具有多種生理功能，如作為毛細(xì)管電泳和高效液相色譜手性選擇物、甜味和苦味抑制劑、儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)運(yùn)銅離子等。因此，核黃素結(jié)合蛋白在食品和醫(yī)藥行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景。 1958 年 Rhodes 等米用 DEAE-CelIulose 和 CM-Cellulose 離子交換層析第一次從蛋清中分離獲得核黃素結(jié)合蛋白。此后多種方法應(yīng)用于蛋清核黃素結(jié)合蛋白的分離純化，如Miller等采用鹽沉淀和多步離子交換層析從蛋清中分離該蛋白；Piskarev等人采用鹽沉淀和有機(jī)溶劑沉淀進(jìn)行粗提，陽(yáng)離子交換(TSK SP-5P)高效液相色譜制備獲得核黃素結(jié)合蛋白；李永茂等采用DE-32纖維素離子交換層析、CM-Sephadex C_25陽(yáng)離子交換層析和Sephadex G-100凝膠過(guò)濾也從蛋清中純化獲得了該蛋白。但這些工藝均需采用多步層析，在各步層析之間需要更換緩沖液或?qū)θ芤哼M(jìn)行濃縮，操作復(fù)雜，工藝耗時(shí)漫長(zhǎng)，可達(dá)3 5天。此外，在分離過(guò)程中，每一步驟的操作都將不可避免地導(dǎo)致目標(biāo)蛋白不同程度的損失，由于操作步驟繁多，因此產(chǎn)品得率很低，一般僅為30%以下。蛋清因含卵粘蛋白使其具有較高粘度，直接進(jìn)行離子交換層析會(huì)影響填料的使用壽命與分離效果，而核黃素結(jié)合蛋白僅占蛋清蛋白質(zhì)的0. 8%，因此必須采用適當(dāng)?shù)墓に噷?duì)雞蛋清進(jìn)行前處理和初步分離，才能使一步層析純化核黃素結(jié)合蛋白成為可能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)目前核黃素結(jié)合蛋白分離純化中存在的問(wèn)題，采用硫酸銨鹽析技術(shù)對(duì)雞蛋清溶液進(jìn)行處理，獲得富含核黃素結(jié)合蛋白的組分，并進(jìn)一步使用陰離子交換層析技術(shù)對(duì)其進(jìn)行純化，從而實(shí)現(xiàn)了核黃素結(jié)合蛋白的提取。具體技術(shù)方案如下
一種從雞蛋清中提取核黃素結(jié)合蛋白的方法，包括以下步驟
(1)蛋清預(yù)處理向蛋清稀釋液中添加核黃素，使核黃素濃度達(dá)到3-3.g/g，得到飽和核黃素的蛋清稀釋液；
(2)提取核黃素結(jié)合蛋白向飽和核黃素的蛋清稀釋液中，加入硫酸銨使其飽和度為55%，攪拌后離心，得到上清液，向上清液中繼續(xù)添加硫酸銨使其飽和度為85%，攪拌后離心，得到沉淀，將沉淀用少量水溶解，用水透析后冷凍干燥，即為核黃素結(jié)合蛋白粗品；
(3)分離純化將核黃素結(jié)合蛋白粗品用pH值為6.5、濃度為0. lmol/L的磷酸鈉緩沖液配制成濃度20mg/mL,用DEAE-Toyopearl色譜柱分離,用含0. 25mol/L氯化鈉的pH值為6. 5、濃度為0. lmol/L的磷酸鈉緩沖液洗脫，洗脫液用蒸餾水透析后冷凍干燥獲得成品。所述蛋清稀釋液是將雞蛋清與等體積水組成。本發(fā)明的有益效果是
1、本發(fā)明采用硫酸銨鹽析法提取核黃素結(jié)合蛋白，通過(guò)分級(jí)沉淀，能去除蛋清中幾乎所有的卵黏蛋白及部分卵白蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白，降低了蛋清粘度，從而使后續(xù)的陰離子交換層析僅需采用一種層析填料即可獲得高純度的核黃素結(jié)合蛋白，無(wú)需更換填料，提高了填料的利用率，同時(shí)還簡(jiǎn)化了操作步驟，縮短了提取時(shí)間；
2、本發(fā)明提取的核黃素結(jié)合蛋白產(chǎn)品純度高，回收率好。



圖I為不同飽和度(NH4)2SO4對(duì)核黃素結(jié)合蛋白鹽析效果的影響試驗(yàn)結(jié)果 圖2為不同PH值的磷酸鈉緩沖液離子交換層析圖譜；
圖3為不同PH值的磷酸鈉緩沖液層析后各洗脫峰樣品的的SDS-PAGE電泳 圖4為不同濃度的磷酸鈉緩沖液離子交換層析圖譜；
圖5為不同濃度的磷酸鈉緩沖液層析后各洗脫峰的SDS-PAGE電泳 圖6為不同濃度NaCl洗脫對(duì)核黃素結(jié)合蛋白純化效果的影響；
圖7為不同上樣量對(duì)核黃素結(jié)合蛋白純化回收率和純度影響試驗(yàn)結(jié)果 圖8為核黃素結(jié)合蛋白樣品(A)和其標(biāo)準(zhǔn)品(B)的高效液相色譜圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。實(shí)施例I
一種從雞蛋清中提取核黃素結(jié)合蛋白的方法，包括以下步驟
I、蛋清預(yù)處理
(1)將新鮮的雞蛋打蛋，使用蛋黃分離器分離蛋清和蛋黃，收集蛋清；
(2)取500g蛋清，邊攪拌邊向蛋清中加入等體積的蒸餾水稀釋?zhuān)?
(3)添加濃度為25ii g/mL核黃素溶液125mL使核黃素結(jié)合蛋白結(jié)合核黃素達(dá)飽和狀態(tài)，磁力攪拌30min，得到飽和核黃素的蛋清稀釋液。2、提取核黃素結(jié)合蛋白
向飽和核黃素的蛋清稀釋液中分別添加(NH4)2SO4至飽和度為40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%，攪拌 lh，4°C、10000 r/min 離心 30min。將沉淀用蒸餾水溶解后透析24h (更換4次透析水),定容至1250mL,以相同條件離心,取上清液于455nm處測(cè)吸光值，以蒸餾水為空白，結(jié)果如圖I所示。由圖I可知，核黃素結(jié)合蛋白主要存在于559^85%的(NH4)2S04沉淀中，因此通過(guò)55%/85%兩步鹽析可以較大程度地保留核黃素結(jié)合蛋白，同時(shí)去除大部分的卵白蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和幾乎所有的卵粘蛋白，利于后續(xù)試驗(yàn)的順利開(kāi)展。3、分離純化
DEAE-Toyopearl 650M(70mL)預(yù)先用磷酸鈉緩沖液平衡。取一定質(zhì)量鹽析凍干粗品，用pH值為6. 5、濃度為0. lmol/L的磷酸鈉緩沖液配制成濃度20mg/mL，采用恒流泵注入200mL于離子交換柱(I. 6cmX40cm)中。磷酸鈉緩沖液沖洗去除與填料未結(jié)合的蛋白，至280nm處吸光值基線趨于平穩(wěn)，再用含0. 25mol/L氯化鈉的pH值為6. 5、濃度為0. lmol/L的磷酸鈉緩沖液洗脫，最后用含lmol/L NaCl的磷酸鈉緩沖液進(jìn)行填料再生，流速均為lmL/min。收集洗脫峰對(duì)應(yīng)洗脫液，蒸餾水透析24h (更換4次透析水)后，冷凍干燥獲得核黃素結(jié)合蛋白。實(shí)施例2陰離子交換層析純化條件的確定
I、緩沖液pH 0. 05mol/L磷酸鈉緩沖液，pH值分別為4. 5,5. 5和6. 5，上樣量50mL。不同pH層析效果如圖2所示，各洗脫峰對(duì)應(yīng)的電泳條帶如圖3所示。由圖3可知，A-a、B_a和C-a樣品的分子量在35 kDa 80 kDa之間，主要為卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和卵清蛋白；A_b、B_b和C_b樣品的分子量約為38 kDa，應(yīng)為卵清蛋白；A-c、B-c和C-c樣品的分子量約為28 kDa,與核黃素結(jié)合蛋白的一致，為目標(biāo)蛋白。由上分析可知，pH4. 5、5. 5、6. 5圖中峰a、b主要為卵轉(zhuǎn)鐵蛋白(OTf)和卵白蛋白(0VA)、峰c為核黃素結(jié)合蛋白。根據(jù)層析圖峰型分析得出，隨PH升高，峰b面積逐漸減小，峰c面積增加，說(shuō)明隨pH升高，填料對(duì)OTf和OVA結(jié)合能力 減弱，對(duì)核黃素結(jié)合蛋白結(jié)合能力增強(qiáng)。據(jù)Becvar等人報(bào)道，通過(guò)測(cè)定核黃素飽和核黃素結(jié)合蛋白(Holo-RBP)在276nm和455nm吸光度的比值(A276/A455)可判定Holo-RBP樣品的相對(duì)純度，比值越小表明樣品純度越高，對(duì)A、B、C圖中峰c對(duì)應(yīng)的洗脫液進(jìn)行紫外掃描測(cè)得A276/A455比值分別為6. 74,7. 03和5. 17，可知緩沖液pH值為6. 5時(shí)，樣品純度最高，故緩沖液PH值選擇6. 5為宜。2、緩沖液濃度磷酸鈉緩沖液濃度分別為0. 05mol/L和0. lmol/L,上樣量50mL。圖4中A、B分別為0. 05mol/L、0. lmol/L磷酸鈉緩沖液離子交換層析圖譜，由圖可知，采用0. 05mol/L緩沖液時(shí)出現(xiàn)了兩個(gè)洗脫峰A-b和A_c，而采用0. lmol/L緩沖液時(shí)僅有一個(gè)洗脫峰B-c。對(duì)各峰樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果如圖5所示。由圖分析可知，峰A_c和B-c分子量約28 kDa,與核黃素結(jié)合蛋白分子量一致，且兩個(gè)樣品均顯示為單一條帶，表明純度均較高。進(jìn)一步A-c和B-c樣品溶液進(jìn)行紫外掃描，得A276A455比值分別為5. 26和4. 84，說(shuō)明采用0. lmol/L緩沖液層析分離獲得樣品的純度較高。以上結(jié)果表明，采用
0.lmol/L緩沖液沖洗時(shí)，分離的核黃素結(jié)合蛋白純度更高，且高濃度的緩沖液具有較高的緩沖能力，可減少平衡所需要的時(shí)間。因此，緩沖液濃度以選擇0. lmol/L為宜。3,NaCl 洗脫液濃度上樣量均為 50mL，分別采用 0. 05mol/L、0. 10mol/L、0. 15mol/L、0. 20mol/L、0. 25mol/L、0. 30mol/L NaCl進(jìn)行洗脫。對(duì)不同濃度NaCl洗脫層析圖譜和目標(biāo)洗脫峰溶液進(jìn)行分析，計(jì)算目標(biāo)洗脫峰的峰面積并計(jì)算其溶液的A276A455比值，結(jié)果如圖6所示隨著NaCl濃度升高，洗脫獲得樣品量增加，當(dāng)濃度上升至0. 25mol/L時(shí)洗脫峰面積不再變化。此外，隨著NaCl濃度升高，洗脫獲得樣品A276A455比值呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明高濃度鹽洗脫獲得產(chǎn)物的純度較高，可能是由于使用低濃度NaCl可將少量雜蛋白全部洗脫下來(lái)，卻只能洗脫部分核黃素結(jié)合蛋白，導(dǎo)致分離獲得樣品中核黃素結(jié)合蛋白的相對(duì)含量降低，從而導(dǎo)致其純度降低。當(dāng)NaCl濃度達(dá)0. 25mol/L時(shí)，樣品純度和峰面積基本不再發(fā)生變化。因此，NaCl洗脫濃度以選擇0. 25mol/L為宜。4、上樣量分別設(shè)置上樣量為 50mL、100mL、150mL、200mL、250mL、300mL、350mL、400mL，對(duì)不同上樣量下的洗脫層析圖譜和目標(biāo)洗脫峰溶液進(jìn)行分析，計(jì)算目標(biāo)洗脫峰的峰面積并計(jì)算其溶液的A276A455比值，結(jié)果如圖7所示。由圖分析可知，上樣量彡200mL，產(chǎn)品回收率基本處于55%左右，當(dāng)上樣量> 200mL，樣品回收率快速下降，說(shuō)明隨著上樣量的增力口，填料對(duì)核黃素結(jié)合蛋白結(jié)合效率下降。此外，上樣量< 200mL，A276A455比值稍有升高，當(dāng)上樣量> 200mL，A276A455比值也急劇增大，說(shuō)明樣品的純度降低。因此，上樣量以選擇200mL為宜。5、SDS-聚丙酰胺凝膠電泳鑒定濃縮膠濃度5%，分離膠濃度12%。樣品(2mg/mL)溶于上樣緩沖液，上樣量10 U L，濃縮膠電泳恒壓80V，分離膠電泳恒壓120V。凝膠用50%乙醇和10%冰醋酸固定30min，0. 1%考馬斯亮藍(lán)R-250染色30min，溫度40°C，25%乙醇和8%冰醋酸混合液進(jìn)行脫色。實(shí)施例3核黃素結(jié)合蛋白純度測(cè)定及回收率計(jì)算
I、蛋白質(zhì)產(chǎn)品純度測(cè)定
核黃素結(jié)合蛋白樣品和標(biāo)準(zhǔn)品濃度均為lmg/mL，色譜柱為賽分SRT SEC-300柱·(4. 6mmX 300mm, 5 u m),柱溫 25。。,流動(dòng)相為 0. 15mol/L 磷酸鈉 pH 7. 0 緩沖液，流速 0. 4mL/1^11，進(jìn)樣量101^，運(yùn)行時(shí)間15111111，檢測(cè)波長(zhǎng)28011111。結(jié)果如圖8所示。其中A為本試驗(yàn)分離獲得的核黃素結(jié)合蛋白樣品的高效液相色譜圖，B為核黃素結(jié)合蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖，由圖可知，樣品與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間一致，進(jìn)一步說(shuō)明了獲得的蛋白確為核黃素結(jié)合蛋白。進(jìn)一步由軟件對(duì)峰面積進(jìn)行積分，根據(jù)峰面積比對(duì)核黃素結(jié)合蛋白產(chǎn)品純度進(jìn)行定量計(jì)算，計(jì)算結(jié)果為95. 32%。2、蛋白質(zhì)產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)含量測(cè)定
采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定蛋白含量。分離獲得的蛋白產(chǎn)品中的蛋白含量測(cè)定結(jié)果為 42. 99%o3、回收率計(jì)算
根據(jù)從100 g雞蛋清中純化所得核黃素結(jié)合蛋白的質(zhì)量、蛋白含量和純度，使用以下公式計(jì)算所得的各個(gè)蛋白質(zhì)的回收率，
權(quán)利要求
1.一種從雞蛋清中提取核黃素結(jié)合蛋白的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)蛋清預(yù)處理向蛋清稀釋液中加入核黃素，使核黃素濃度為3-3.g/g，得到飽和核黃素的蛋清稀釋液； (2)提取核黃素結(jié)合蛋白向飽和核黃素的蛋清稀釋液中加入硫酸銨，使硫酸銨飽和度為55%，攪拌后離心，得到上清液，向上清液中繼續(xù)添加硫酸銨，使硫酸銨飽和度為85%，攪拌后離心，得到沉淀，將沉淀用少量水溶解，透析后冷凍干燥，即為核黃素結(jié)合蛋白粗品； (3)分離純化將核黃素結(jié)合蛋白粗品用pH值為6.5、濃度為0. lmol/L的磷酸鈉緩沖液配制成濃度為20mg/mL,用DEAE-Toyopearl色譜柱分離,用含0. 25mol/L氯化鈉的pH值為6. 5、濃度為0. lmol/L的磷酸鈉緩沖液洗脫，洗脫液用蒸餾水透析后冷凍干燥獲得成品。
2.如權(quán)利要求I所述的從雞蛋清中提取核黃素結(jié)合蛋白的方法，其特征在于，所述蛋清稀釋液是由雞蛋清與等體積水組成。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種從雞蛋清中提取核黃素結(jié)合蛋白的方法，通過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀蛋白質(zhì)，然后采用DEAE-Toyopearl650M陰離子交換層析進(jìn)行分離。本發(fā)明獲得的核黃素結(jié)合蛋白純度高，回收率較好，通過(guò)分級(jí)沉淀，能去除蛋清中幾乎所有的卵黏蛋白及部分卵白蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白，降低了蛋清粘度，從而使后續(xù)的陰離子交換層析僅需采用一種層析填料即可獲得高純度的核黃素結(jié)合蛋白，無(wú)需更換填料，提高了填料的利用率，同時(shí)還簡(jiǎn)化了操作步驟，縮短了提取時(shí)間。
文檔編號(hào)C07K1/30GK102796190SQ20121026086
公開(kāi)日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2012年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月26日
發(fā)明者馬美湖, 武小芬, 邱寧, 黃西 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)