專利名稱：一種幽門螺桿菌抗原h(huán)la限制性免疫顯性表位肽及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術領域，涉及一種幽門螺桿菌抗原HLA限制性免疫顯性表位肽及其制備方法和應用。
背景技術：
1982年，澳大利亞學者Warren和Marshall發(fā)現(xiàn)一種定植在人胃和十二指腸的微需氧、革蘭氏陰性、螺旋彎曲菌一幽門螺桿菌(Helicobacter pylori, Hp)。幽門螺桿菌是上消化道的主要致病菌，與胃炎、消化性潰瘍、胃粘膜相關淋巴組織淋巴瘤(MALT)和胃癌等疾病的發(fā)生密切相關。近幾年的研究顯示，幽門螺桿菌感染還與缺血性心臟病、動脈粥樣硬化、缺鐵性貧血等胃外疾病相關。1994年，世界衛(wèi)生組織已將其列為人群第一類致癌因子。全球50%以上人群存在幽門螺桿菌感染，特別是某些發(fā)展中國家的感染率甚至高達80%。因此，有效的治療幽門螺桿菌感染對人類的健康是非常重要的。目前，臨床上主要是通過“三聯(lián)”或“四聯(lián)”療法來對幽門螺桿菌感染的患者進行根除治療，但因藥物的副作用大，患者的依從性差，耐藥菌株的逐漸增加，使其應用受到了較大的限制。且根除治療并不能預防幽門螺桿菌的感染與根除后再感染。幽門螺桿菌疫苗能誘發(fā)機體的特異性免疫應答清除感染，又可激發(fā)機體的免疫記憶來預防再次感染，且副作用少。面對幽門螺桿菌高感染率和嚴重的致病性，國內(nèi)外已廣泛開展幽門螺桿菌疫苗研究。免疫接種是預防和控制感染性疾病最經(jīng)濟而有效的方法，鑒于幽門螺桿菌感染的高發(fā)病率及其與慢性胃炎、消化性潰瘍、胃粘膜相關淋巴組織淋巴瘤和胃癌等消化系統(tǒng)疾病的密切關系，如何通過免疫接種達到防治這些疾病的目的，一直是各國科研人員研究的重點問題。疫苗接種能有效地調(diào)動機體的免疫系統(tǒng)，克服細菌對宿主的免疫逃避來達到預防感染和消除已感染的細菌的目的，經(jīng)濟而簡便，可在人群中大規(guī)模運用，并且對耐藥細菌仍然有效，因此研究幽門螺桿菌疫苗具有重要的意義。動物實驗研究表明，疫苗接種能顯著的降低幽門螺桿菌的定植量，并減輕胃黏膜的炎癥反應，并且能產(chǎn)生抗原特異性CD4+T細胞的應答以及IgG和sIgA抗體的產(chǎn)生，起到預防和治療幽門螺桿菌感染的作用?，F(xiàn)有疫苗主要有以下幾種形式全菌滅活疫苗、重組亞單位疫苗及核酸疫苗等，其引發(fā)的免疫應答與幽門螺桿菌感染的免疫應答相似。幽門螺桿菌感染使機體內(nèi)產(chǎn)生強烈的細胞與體液免疫應答，但是感染仍慢性持續(xù)化甚至是終身感染，說明機體已經(jīng)對幽門螺桿菌的存在免疫耐受，自然感染時產(chǎn)生的免疫應答不能起到保護作用，因而通過疫苗接種的方式清除幽門螺桿菌就必須在抗原選擇以及在表位水平對抗原進行改造，激發(fā)更有效和更高效的免疫應答。隨著對抗原分子識別理論的發(fā)展和深入認識，抗原刺激機體所產(chǎn)生的特異性免疫應答的本質(zhì)就是表位特異性應答的集合。然而，機體的免疫應答不是針對整個外源物質(zhì)(抗原)，而僅僅只是抗原的一小段區(qū)域，即抗原表位。表位疫苗，就是使用抗原表位制備而成的疫苗。表位疫苗具有易于生產(chǎn)、特異性高、免疫原性強、安全性較好等特點。表位疫苗，是近年來疫苗設計的新思路，在感染性疾病，惡性腫瘤以及、自身免疫性疾病等疫苗設計的新方向，具較好的應用前景。表位的篩選和鑒定，是研制表位疫苗的第一步。研究顯示，幽門螺桿菌的免疫保護機制趨向于依賴CD4+T細胞，而并非CD8+T細胞的免疫反應。因此，在幽門螺桿菌表位疫苗的設計中加入CD4+T細胞表位(及輔助T細胞表位)尤為重要。此外，使用全長蛋白作為疫苗研究的抗原，存在抗原表位組成成分復雜、特異性不高、免疫應答不強等局限性。只有免疫顯性表位才能激發(fā)機體較強的免疫應答,亞顯性表位引起的免疫應答遠遠弱于顯性表位，因此，免疫顯性CD4+T細胞表位才是幽門螺桿菌表位疫苗所需要的。目前，已報道的幽門螺桿菌抗原⑶4+T細胞表位均為小鼠H-2限制性Th表位，由于小鼠和人MHC分子之間存在著明顯的差別，H-2限制性表位可能不適用于人類疫苗設計，因此需要篩選鑒定HLA限制性表位。此外，現(xiàn)有報道的幽門螺桿菌表位多采用生物信息學軟件預測而來，準確率不高，雖能通過實驗加以驗證，但是仍不能避免表位漏篩現(xiàn)象。此外，軟件預測方法篩選表位難以解決表位的免疫顯性問題，而免疫顯性表位才是幽門螺桿菌表位疫苗最佳的候選表位。本發(fā)明利用抗原特異性T細胞及步移重疊合成肽，篩選鑒定得到了兩個幽門螺桿菌抗原HLA限制性免疫顯性輔助T細胞(Th細胞)表位SEQ ID NO:63和74。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種幽門螺桿菌抗原HLA限制性免疫顯性表位肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0:63、74、95和、105所示。所述表位肽具有HLA-DR亞型限制性，所述SEQID NO: 63和95所示的表位肽的HLA-DR亞型為HLA-DRBI* 1404，SEQ ID NO: 74和105所示的表位肽的HLA-DR亞型為HLA-DRB1*0803。本發(fā)明進一步提供了所述表位肽的制備方法，包含以下步驟I)從蛋白數(shù)據(jù)庫中獲取幽門螺桿菌來源的UreB蛋白質(zhì)序列；2)從步驟I)獲取的UreB蛋白質(zhì)序列的第I號氨基酸開始，每次步移6個氨基酸，以步移重疊的18個氨基酸為一個多肽段，形成第一多肽庫，和/或在獲得的第一多肽中每次步移2個氨基酸，以步移重疊的至少13個氨基酸為一個多肽段，形成第二多肽庫；和/或通過分別在核心序列FFGVKPWI和匪IIKGGFI的基礎上進行逐個氨基酸的增加而合成多肽，形成第三多肽庫；3)利用抗原特異性⑶4+T細胞從步驟2)所述的第一多肽庫和/或第二多肽庫和/或第三多肽庫中篩選免疫顯性表位肽；4)利用HLA- II類分子抗體阻斷實驗初步確定步驟3)篩選的免疫顯性表位肽的HLA限制性；5)利用不同HLA- II類分子亞型的B淋巴母細胞系對表位的遞呈實驗確定步驟3)篩選的免疫顯性表位肽的HLA限制性的具體亞型；6)通過抗原遞呈實驗驗證所篩選的免疫顯性表位肽。本發(fā)明還提供了所述表位肽用于預防或治療幽門螺桿菌感染的制劑中的應用。由于本發(fā)明所提供的免疫顯性表位肽具有高免疫原性，可引發(fā)強烈的免疫反應。另外所述免疫顯性表位肽不含有不必要甚至有害的部分，從而降低由其所制備的疫苗的使用風險。本免疫顯性表位肽可以與其他疫苗成分進行優(yōu)勢組合，從而擴大免疫應答的寬度。由本免疫顯性多肽制備的疫苗對幽門螺桿菌感染不僅有預防作用，還可以作為治療性疫苗使用。、
為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，并配合附圖，作詳細說明如下。


圖IA表示(樣本編號為4529)經(jīng)ICS方法檢測到的幽門螺桿菌感染陽性者外周血單個核細胞中抗原特異性⑶4+T細胞頻率，可見DMSO對照組和肽庫刺激組之間有顯著差別；圖IB表示(樣本編號4493)經(jīng)ICS方法檢測到的幽門螺桿菌感染陽性者外周血單個核細胞中抗原特異性⑶4+T細胞頻率，可見DMSO對照組和肽庫刺激組之間有顯著差別；圖2A表示(樣本編號為4529)利用抗原特異性⑶4+T細胞和步移重疊合成肽對18氨基酸(18-mer)免疫顯性表位進行篩選，其中第63條肽段(P63，U373-390)為免疫顯性肽段，第68 (P68, U403-420)和第93 (P93, U553-569)條肽段免疫亞顯性肽段；圖2B表示(樣本編號4493)利用抗原特異性⑶4+T細胞和步移重疊合成肽對18氨基酸(18-mer)免疫顯性表位進行篩選，其中第74條肽段(P74，U439-456)為免疫顯性肽段，第44 (P44, U259-276)和第81 (P81, U481-498)條肽段免疫亞顯性肽段；圖3A表示(樣本編號為4529)利用抗原特異性⑶4+T細胞和步移重疊合成肽對13-mer免疫顯性表位進行篩選，其中63-2 (U373-385)為免疫顯性肽段；圖3B1表示(樣本編號4493)利用抗原特異性⑶4+T細胞和步移重疊合成肽對13-mer免疫顯性表位進行篩選,結果發(fā)現(xiàn)合成的13_mer肽太短；圖3B2表示(樣本編號4493)利用DD30抗原特異性⑶4+T細胞和合成相關氨基酸短肽對其免疫顯性表位進行篩選，其中74-3 (U438-452)為免疫顯性肽段；圖4A表示(樣本編號為4529)利用HLA- II類分子抗體阻斷實驗初步確定免疫顯性肽 P63-2(U373-385)是 HLA-DR 限制性的；圖4B表示(樣本編號為4493)利用HLA- II類分子抗體阻斷實驗初步確定免疫顯性肽 P74-3 (U438-452)是 HLA-DR 限制性的；圖5A1表示(樣本編號為4529)利用B淋巴細胞系(BLCL)遞呈實驗確定免疫顯性肽 P63-2 (U373-385)的 HLA 限制性是 HLA_DRB1*1404 ；圖5A2表示(樣本編號為4529) HLA-DRBI* 1454與HLA_DRB1*1404的基因序列比對圖；圖5B表示(樣本編號為4493)利用B淋巴細胞系遞呈實驗確定免疫顯性肽P74-3(U438-452)的 HLA 限制性是 HLA_DRB1*0803 ；圖6表示(樣本編號為4529)利用自然遞呈實驗確定所篩選到的18_mer短肽P63，能夠被自然遞呈，為真正的免疫顯性表位。
具體實施例方式為了使本發(fā)明目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，下面結合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。材料與方法、
(一)蛋白和肽段重組幽門螺桿菌尿素酶B亞單位(rUreB)蛋白為本單位重組構建(吳超幽門螺桿菌尿素酶B亞單位基因克隆表達及臨床應用中華檢驗醫(yī)學雜志2001年5期)；多肽肽段通過化學方法合成(由上海吉爾生化公司合成)，用二甲亞砜(DMSO)溶解至IOmM的濃度，在_70°C保存，臨用時用RPMI-1640完全培養(yǎng)基稀釋到ImM的濃度。(二)主要溶液及試劑配制I. RPMI-1640不完全培養(yǎng)基分別稱取10. 4g RPMI-1640粉末，2. 4g Ifepes和2g NaHCO3，加入去離子水至IOOmL,攪勻過濾除菌，分裝凍存。
2. RPMI-1640 完全培養(yǎng)基分別量取950mL RPMI-1640不完全培養(yǎng)基和50mL人AB血清，加入20萬單位/mL的青霉素和鏈霉素雙抗各0. 5mL (終濃度為100U/mL)。3.凍存液將胎牛血清與DMSO按照9 I的比例混合，然后分裝凍存。(三)所使用的主要試劑及其來源
權利要求
1.一種幽門螺桿菌抗原HLA限制性免疫顯性表位肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:63、74,95和105所示。
2.如權利要求I所述的幽門螺桿菌抗原HLA限制性免疫顯性表位肽，其特征在于，所述表位肽具有HLA-DR亞型限制性。
3.如權利要求2所述的幽門螺桿菌抗原HLA限制性免疫顯性表位肽，其特征在于，所述SEQ ID NO:63 和 95 所示的表位肽的 HLA-DR 亞型為 HLA-DRB1*1404，SEQ ID NO: 74 105所示的表位肽的HLA-DR亞型為HLA-DR B1*0803。
4.權利要求1-3任一項所述的幽門螺桿菌抗原HLA限制性免疫顯性表位肽在制備用于預防或治療幽門螺桿菌感染的制劑中的應用。
5.如權利要求4所述的應用，其特征在于，所述制劑為疫苗。
6.一種制備權利要求I所述的幽門螺桿菌抗原HLA限制性免疫顯性表位肽的方法，其特征在于，包含步驟 1)從蛋白數(shù)據(jù)庫中獲取幽門螺桿菌來源的UreB蛋白質(zhì)序列； 2)從步驟I)獲取的UreB蛋白質(zhì)序列的第I號氨基酸開始，每次步移6個氨基酸，以步移重疊的18個氨基酸為一個多肽段，形成第一多肽庫，和/或在獲得的第一多肽中每次步移2個氨基酸，以步移重疊的至少13個氨基酸為一個多肽段，形成第二多肽庫；和/或通過分別在核心序列FFGVKPWI和WIIKGGFI的基礎上進行逐個氨基酸的增加而合成多肽，形成第三多肽庫； 3)利用抗原特異性CD4+T細胞從步驟2)所述的第一多肽庫和/或第二多肽庫和/或第三多肽庫中篩選免疫顯性表位肽； 4)利用HLA-II類分子抗體阻斷實驗初步確定步驟3)篩選的免疫顯性表位肽的HLA限制性； 5)利用不同HLA-II類分子亞型的B淋巴母細胞系對表位的遞呈實驗確定步驟3)篩選的免疫顯性表位肽的HLA限制性的具體亞型； 6)通過抗原遞呈實驗驗證所篩選的免疫顯性表位肽。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟2)所述的第一多肽庫的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1-93所示；第二多肽庫的多肽的氨基酸序列如SEQ ID N0:94_103所示；第三多肽庫的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 104-115所示。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種幽門螺桿菌抗原HLA限制性免疫顯性表位肽及其制備方法和應用，所述顯性表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:63、74、95和105所示。本發(fā)明還提供了所述表位肽的制備方法，并進一步提供了所述表位肽用于預防或治療幽門螺桿菌感染的制劑中的應用。
文檔編號C07K7/08GK102746381SQ20121026156
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月26日 優(yōu)先權日2012年7月26日
發(fā)明者吳超, 李海波, 李濱, 楊武晨, 毛旭虎, 章金勇, 童文德, 趙 卓, 鄒全明, 郭剛, 郭紅, 陳立, 魯東水 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學