專利名稱：一種辣椒ap2/erf轉(zhuǎn)錄因子基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種辣椒AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子基因及其應(yīng)用，屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
長期的進(jìn)化過程中植物形成了一套復(fù)雜的生理生化機(jī)制適應(yīng)外界環(huán)境的刺激對(duì)其生長和發(fā)育帶來的影響。在病原菌侵染時(shí)，植物可以通過內(nèi)在的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生快速的防御反應(yīng)。植物固有的免疫系統(tǒng)主要由微生物或病原相關(guān)分子模式激發(fā)的免疫反應(yīng)(MAMP-or P AMP-triggered immunity, PTI)及效應(yīng)蛋白激發(fā)的免疫反應(yīng)(effector-triggeredimmunity, ETI)構(gòu)成。PTI是通過植物細(xì)胞表面模式識(shí)別受體(pattern recognitionreceptors, PRRs)介導(dǎo)的在侵染部位產(chǎn)生快速防御反應(yīng)的應(yīng)答機(jī)制,是一種非寄主抗性。病原菌可通過分泌效應(yīng)蛋白進(jìn)入植物細(xì)胞阻斷PTI，促進(jìn)自身的侵染和增殖，導(dǎo)致植物產(chǎn)生效應(yīng)因子激活的感病性(effector triggered susceptibility, ETS)。植物又通過與病原菌協(xié)同進(jìn)化出抗性蛋白(Resistance protein, R protein)特異識(shí)別某些病原菌的效應(yīng)蛋白，激活了效應(yīng)物引發(fā)的免疫反應(yīng)ETI，產(chǎn)生了更加有效和持久的抗病性反應(yīng)。PTI和ETI介導(dǎo)的免疫應(yīng)答均伴隨有大量防御反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)的改變。研究表明，擬南芥在幾種非病原細(xì)菌作用下PAMP誘導(dǎo)表達(dá)的基因中約1/4編碼WRKY、ERF /AP2和zinc finger等轉(zhuǎn)錄因子和蛋白激酶。植物的防御反應(yīng)過程是由復(fù)雜、相互關(guān)聯(lián)的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)所調(diào)控的。植物內(nèi)源激素(SA、JA, ABA和乙烯等)，離子流，活性氧，MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)及轉(zhuǎn)錄因子在植物抗逆防御反應(yīng)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中起重要作用。植物抗病過程中特定的防御反應(yīng)基因相關(guān)抗逆途徑的啟動(dòng)或一些正常表達(dá)的基因的暫時(shí)關(guān)閉都是由復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)所調(diào)控的。植物對(duì)病原菌及各種逆境的應(yīng)答過程是以對(duì)逆境信號(hào)的感知為起始，最終信號(hào)傳遞至細(xì)胞核，在分子水平上表現(xiàn)為脅迫相關(guān)基因適時(shí)適量的誘導(dǎo)或抑制表達(dá)。這一過程中轉(zhuǎn)錄因子在信號(hào)傳遞及防御反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控過程中起重要作用。轉(zhuǎn)錄因子可以通過與特定基因啟動(dòng)子上的順式作用元件結(jié)合或與其他相關(guān)蛋白互作從而調(diào)整基因的表達(dá)。大量研究表明AP2/ERF，WRKY, NAC,bZIP/HD-ZIP等轉(zhuǎn)錄因子超家族成員參與了植物響應(yīng)包括病原菌在內(nèi)的逆境的防御反應(yīng)過程，這些轉(zhuǎn)錄因子的過量表達(dá)不僅可以顯著改善植物對(duì)特定逆境的抗性，還可以通過同時(shí)激活多個(gè)下游抗病基因、抗逆基因的表達(dá)，達(dá)到對(duì)植物綜合抗性改良的目的。因此，對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)、功能及調(diào)控機(jī)制的分析在植物抗逆基因工程中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。辣椒annuum L.)是一種重要的爺科蔬菜和工業(yè)原料作物,在我國其種植面積僅次于大白菜，但產(chǎn)值卻最高。在南方地區(qū)由于多見高溫高濕天氣，包括青枯病在內(nèi)的毀滅性土傳病害發(fā)生特別嚴(yán)重，并且具有發(fā)病速度快、防治困難、為害嚴(yán)重的特點(diǎn)，對(duì)辣椒的產(chǎn)量和質(zhì)量造成極大影響，輕則減產(chǎn)，重則絕收。僅利用常規(guī)育種手段選育品種耗時(shí)較長，效率較低，而且育成抗病品種的抗性喪失快，而培育和推廣應(yīng)用廣譜、高效、持久抗性的抗病品種是生產(chǎn)中解決辣椒病害問題最為經(jīng)濟(jì)有效的對(duì)策，開展辣椒抗病分子機(jī)制研究則是有效開展辣椒抗性遺傳改良的重要基礎(chǔ)。APETALA2/ETHYLENE RESPONSE FACTOR (AP2/ERF)轉(zhuǎn)錄因子在植物中以多基因家族的形式存在，不同成員在植物生長發(fā)育、對(duì)激素及生物和非生物逆境的應(yīng)答過程起重要的調(diào)控作用。所有的ERF (Ethylene response factor)轉(zhuǎn)錄因子均包含一個(gè)由58 70個(gè)氨基酸殘基組成的AP2/ERF保守功能域。根據(jù)保守功能域的相似性，sakuma等人將擬南芥AP2/ERF超家族劃分為五個(gè)亞家族，DREB，ERF, AP2, RAV及其它，其中ERF亞族65個(gè)成員包括了所有與植物抗病相關(guān)的AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子。當(dāng)病原菌侵染時(shí)，ERF轉(zhuǎn)錄因子可以以單體的方式同GCC-box結(jié)合激活防御反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)。GCC-box包含有保守的A￡CC￡C￡C基序，最早發(fā)現(xiàn)于乙烯誘導(dǎo)的PR基因啟動(dòng)子區(qū)域的乙烯響應(yīng)元件(ethylene response element, ERE)中。隨后,在大量病程相 關(guān)基因、SA、ET或JA誘導(dǎo)表達(dá)的基因啟動(dòng)子區(qū)域均發(fā)現(xiàn)有相應(yīng)的基序。部分ERF類轉(zhuǎn)錄因子還可以同冷、高鹽、和干旱誘導(dǎo)基因啟動(dòng)子區(qū)域的CRT/DRE元件(CRT: C repeat, DRE:dehydration-responsive element,保守核心序列為A/GCCGAC)結(jié)合調(diào)節(jié)相應(yīng)基因的表汰。與順式作用元件結(jié)合的特點(diǎn)表明該轉(zhuǎn)錄因子家族成員可能單獨(dú)或同時(shí)參與植物對(duì)生物及非生物逆境的脅迫應(yīng)答過程。例如，番茄ERF轉(zhuǎn)錄因子TSRF1、煙草NtERF5結(jié)合GCC-box，轉(zhuǎn)基因植株分別增強(qiáng)了對(duì)細(xì)菌性病原菌和病毒的抗性。辣椒CaPFl，CaERFLPl可以同時(shí)與GCC-box及CRT/DRE順式作用元件結(jié)合，兩個(gè)基因的過量表達(dá)可增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)病原菌侵染和非生物逆境的抗性[26，36]。大量研究表明植物內(nèi)源激素如水楊酸(salicylic acid, SA)、茉莉酸(jasmonicacid, JA)及乙烯(ethylene，ET)等防御反應(yīng)相關(guān)信號(hào)分子在植物抗逆信號(hào)網(wǎng)絡(luò)起重要作用。ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員在各種植物激素介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑網(wǎng)絡(luò)中起重要調(diào)控作用。研究表明，ERF轉(zhuǎn)錄因子可以同時(shí)受ET和JA誘導(dǎo)，參與植物對(duì)病原菌的廣譜抗性。部分ERF轉(zhuǎn)錄因子還同時(shí)參與了 SA，JA/ET信號(hào)途徑。如A汾 /7，番茄汾F基因竹#及7ii7同時(shí)受SA，JA, ET的誘導(dǎo)，作為正調(diào)節(jié)子參與相應(yīng)的信號(hào)通路。此外，ERF轉(zhuǎn)錄因子還參與了一條未知的抗病信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。過量表達(dá)煙草植株顯著增強(qiáng)了對(duì)煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)的抗性,而該基因的表達(dá)水平不受SA, JA, ET影響。但是迄今為止，對(duì)ERF轉(zhuǎn)錄因子的功能和作用機(jī)制的研究還主要集中在水稻、擬南芥、煙草等少數(shù)模式植物上，對(duì)于非模式植物辣椒中ERF轉(zhuǎn)錄因子參與的植物抗病過程及調(diào)節(jié)機(jī)制的研究還相當(dāng)有限，僅有少量的基因被報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種辣椒AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子基因及其在煙草抗青枯病基因工程中的應(yīng)用，將大力促進(jìn)包括煙草在內(nèi)的茄科植物抗青枯病基因工程的發(fā)展。本發(fā)明人從SA處理的辣椒均一化cDNA文庫中分離獲得了一個(gè)ERF陽性克隆，為編碼AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的基因，將其命名為CaERF105基因，CaERF105 C端含有兩個(gè)特殊的MAP激酶磷酸化位點(diǎn)。熒光定量PCR分析表明該基因的表達(dá)水平受SA、乙烯利、茉莉酸甲酯和青枯菌的誘導(dǎo)。本發(fā)明提供的辣椒AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子基因，其CDNA序列如SEQ ID No. I所示。所述基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示。
所述的辣椒AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子基因在煙草抗青枯病基因工程中的應(yīng)用。序列表中的序列I由1052個(gè)核苷酸組成，自5’端第I至111位核苷酸為5’端非編碼區(qū)(5’ -UTR)，第112位至927位核苷酸為編碼序列，第928至930位核苷酸為終止密碼子，第931至1052位核苷酸為3，端非編碼區(qū)(3’ -UTR)。序列表中的序列2由292個(gè)氨基酸殘基組成，包含一個(gè)AP2/ERF結(jié)構(gòu)域(自序列2的氨基末端第123至181氨基酸殘基，一個(gè)ERF家族IX b亞族特有CMIX2基序(自序列2的氨基末端第I至19氨基酸殘基)及兩個(gè)MAP激酶磷酸化位點(diǎn)(CMIX5和CMIX6)(分別為自序列2的羧基末端第255至262氨基酸殘基及自第235至238氨基酸殘基)。含有上述基因的重組表達(dá)載體也屬于本發(fā)明的包含內(nèi)容。本發(fā)明提供的辣椒CaERF105基因表達(dá)水平受青枯菌侵染及包括SA，JA, ETH在內(nèi)植物激素誘導(dǎo)表達(dá)。 本發(fā)明提供的重組表達(dá)載體是經(jīng)Gateway技術(shù)獲得的。具體是將辣椒CaERF105基因經(jīng)BP反應(yīng)轉(zhuǎn)入pDONR 入門載體后再經(jīng)LR反應(yīng)導(dǎo)入pK7WG2質(zhì)粒所獲得的。將所述超表達(dá)載體轉(zhuǎn)化EHA105農(nóng)桿菌，采用葉盤遺傳轉(zhuǎn)化法侵染煙草得到轉(zhuǎn)基因煙草，可提高轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)青枯病侵染的抗性。本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)
與野生型煙草相比，本發(fā)明的辣椒基因在煙草中的超表達(dá)可顯著提高轉(zhuǎn)基因煙草的抗青枯病能力，在茄科植物抗青枯病基因工程中具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值。


圖I為辣椒CaERF105的序列分析；辣椒CaERF105與煙草NtERF5 (Q40478. I)，番茄 S1ERF5 (AAS72389),擬南芥 AtERF5 (BAA97I5Ll)及 AtERF105 (Q8VY90. I)氨基酸序列的比較，其中雙上劃線表示保守的DAN結(jié)合域(AP2/ERF domain);上劃線氨基酸殘基PKKRSF所示為推定的核定位信號(hào)；星號(hào)所示為ERF家族特有的丙氨酸和天冬氨酸；點(diǎn)所示為保守的WLG基序；方框所示為ERF家族IX b亞族特有CMIX2，CMIX5，CMIX6保守序列。圖2為CaERF105在包括SA’ MeJA, ETH在內(nèi)植物激素及青枯菌侵染后的表達(dá)模式分析；
圖3為CaERF105與GCC-box順式作用元件的瞬間表達(dá)分析；
圖4為CaERF105的亞細(xì)胞定位分析；
1，2為熒光檢測(cè)；3，4為明場(chǎng)圖片；5，6為疊加圖片。圖5為植物表達(dá)載體pK7WG2- CaERF105 ；
圖6為35S:: CaERF105與野生型植株對(duì)青枯菌抗性的比較；
野生型煙草植株及35S: : CaERF105轉(zhuǎn)基因植株在IO8 cfu/mL青枯菌浸根處理21 d后的表型分析。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例并不僅限于本發(fā)明，目的在于更好的理解本發(fā)明。下述實(shí)施例中所涉及的試劑如無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑。辣椒{Capsicum annuum L.)為福建省本地品種選育的自交系。
實(shí)施例I、CaERF 105全長cDNA的分離
以擬南芥 ERF104 (At5g61600)的氨基酸為探針，從 GenBank (www. ncbi. nlm. gov/)中比對(duì)獲得辣椒EST序列，通過DNAMAN進(jìn)行重疊群分析，分別獲得包含有ERF蛋白保守域的共有序列，應(yīng)用PRMER5軟件根據(jù)共有序列設(shè)計(jì)特異性引物。在5 mM SA處理的辣椒均一化cDNA文庫(文庫構(gòu)建以SA處理O h，l h，3 h，6 h，12 h，24 h，48 h辣椒植株總RNA等量混合為初始材料)中檢測(cè)到有目的條帶的引物如下forward -F: 5 ; -CAACGAACGCAAGCCATCT -3 ;，reverse -R:5 ; -GCCTTAGCCGCATCCAC-3 ;。擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為35個(gè)循環(huán)，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5 min，94°C變性30 s，52°C退火30 s,72°C延伸20 s,72°C延伸10 min。依據(jù)(Munroe et al. , 1995)等人的方法，基 于PCR技術(shù)利用96孔板從文庫中獲得目的基因陽性克隆。陽性克隆依據(jù)SMARTtmcDNA文庫構(gòu)建試劑盒操作說明進(jìn)行內(nèi)刪除，將λ TriplEx2噬菌體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化為pTriplEx2質(zhì)粒。以基因異性引物和載體兩側(cè)引物分別檢測(cè)克隆入pTriplEx2載體的陽性克隆的大小，并委托上海英駿生物技術(shù)公司測(cè)序。載體兩側(cè)引物如下
forward, 5' -CTCGGGAAGCGCGCCATTGTG-3'reverse, 5' -ATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGCC-3'
最終獲得序列表中序列I所示的核苷酸序列。CaERF105由1052個(gè)核苷酸組成，自5’端第I至111位核苷酸為5’端非編碼區(qū)(5’ -UTR)，第112位至927位核苷酸為編碼序列，第928至930位核苷酸為終止密碼子，第931至1052位核苷酸為3’端非編碼區(qū)(3，-UTR)ο編碼分子量為30. 54 kDa的蛋白。序列表中的序列2由292個(gè)氨基酸殘基組成，包含一個(gè)AP2/ERF結(jié)構(gòu)域(自序列2的氨基末端第123至181氨基酸殘基，一個(gè)ERF家族IX b亞族特有CMIX2基序(自序列2的氨基末端第I至19氨基酸殘基)及兩個(gè)MAP激酶磷酸化位點(diǎn)(CMIX5和CMIX6)(分別為自序列2的羧基末端第255至262氨基酸殘基及自第235至238氨基酸殘基)。利用Blastn (http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)進(jìn)行序列同源性比較，DNAMAN 軟件 SubLoc I. O(http://www. bioinfo, tsinghua. edu. cn/SubLoc/), WoLFPSORTChttp: //wolfpsort. org/)及 PredictproteinChttp: //www. predict protein, org/)對(duì)基因序列及編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。利用Mega5. 01軟件進(jìn)行分子進(jìn)化分析，采用鄰接法(Neighbor-Joining, N-J)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,使用1000次重復(fù)自展檢驗(yàn)評(píng)估系統(tǒng)發(fā)育樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。結(jié)果表明CaERF105與番茄S1ERF5 (AAS72389)同源性為67%,與煙草NtERF5 (序列號(hào)為BBA07323)同源性為65%，與擬南芥ERF105轉(zhuǎn)錄因子(序列號(hào)At5g51190)之間有52%的同源性(圖I)。實(shí)施例2、CaERF105表達(dá)模式分析
實(shí)驗(yàn)材料為25 d生長期一致的辣椒植株，分別以5 mM水楊酸(Salicylic acid，SA)、0. I mM茉莉酸甲酯(methyl-jasmonic acid,MeJA)溶于10%乙醇溶液噴灑葉片，(相應(yīng)的對(duì)照為10%乙醇溶液)。以10 mM乙烯利(Eth印hon)溶于水噴灑葉片，相應(yīng)對(duì)照為水。取八周大的辣椒植株以108cfu/mL青枯菌進(jìn)行灌根處理。處理植株的葉片和相應(yīng)的對(duì)照植株葉片在不同時(shí)間(0-48/96 h)采集，并立即液氮速凍置于_70°C以供后續(xù)分析。選用高質(zhì)量的等量RNA參照TaKaRa公司PrimerScript RT reagent Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄后的單鏈cDNA稀釋10倍后取I μ L作為模板。內(nèi)參基因?yàn)槔苯穉cii/ 基因。采用ABI7500熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR分析，每個(gè)樣品進(jìn)行三次重復(fù)。20 μ LPCR 擴(kuò)增體系為 10 μ L 2 X SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa，大連)，正反向引物為 O. 2 μ M,模板cDNA為5-10 ng，加入ROX Reference Dye II(50X)進(jìn)行校正。PCR反應(yīng)條件為95°C30 s，95°C 5 s，60°C 34 s，共40個(gè)循環(huán)。相對(duì)表達(dá)量采用2_ΔΔΜ (Livak)法計(jì)算。其中各種處理下每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的AACt=ACT (測(cè)定樣本)-ACT (校準(zhǔn)樣本)，ACT (測(cè)定樣本)=CT (測(cè)定樣本目標(biāo)基因)-CT (測(cè)定樣本內(nèi)參基因)，ACT (校準(zhǔn)樣本)=CT(校準(zhǔn)樣本目標(biāo)基因)-CT (校準(zhǔn)樣本內(nèi)參基因)。

如圖2所示，本發(fā)明提供的辣椒基因表達(dá)水平在青枯菌處理下24及36h表達(dá)量與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照相比顯著提高。在5mM SA處理下，基因表達(dá)水平分別在12及24 h時(shí)與對(duì)照比顯著提高。外源MeJA作用下6 h前，基因表達(dá)量與對(duì)照相比無明顯差異，在處理6 h時(shí)達(dá)到最大值，12 h時(shí)與對(duì)照相比同樣為顯著提高。與SA和MeJA處理不同，乙烯利處理下除6 h外，基因表達(dá)水平在I h至24 h間與對(duì)照相比都為顯著提高，且在處理3 h達(dá)到最大值(約為對(duì)照組的7倍)。說明本發(fā)明提供的辣椒CaERF105基因很可能參與了辣椒對(duì)青枯菌的防御反應(yīng)過程。實(shí)施例3、CaERF105與GCC-box及CRT/DRE順式作用元件的瞬間表達(dá)分析
本發(fā)明采用BiolisticPDS-1000/He (BioRad)基因槍進(jìn)行基因槍轟擊法進(jìn)行瞬間表達(dá)分析。撕取洋蔥表皮內(nèi)表皮(I cmX Icm)平鋪于固體MS上培養(yǎng)(2%瓊脂，3%蔗糖，pH5. 8)，25°C黑暗下培養(yǎng)I d。10 μ g包含有目的基因的PK7WG2質(zhì)粒與10μ g pBT10-GUS-2GCC質(zhì)粒同時(shí)轟擊洋蔥表皮，鋪于MS上黑暗下培養(yǎng)18 h后經(jīng)X-Gluc染色顯微鏡下觀察并拍照。如圖3所示，經(jīng)X-Gluc染色后，CaERF105同pBT10_GUS_2GCC共同轉(zhuǎn)化的洋蔥表皮可以檢測(cè)到⑶S基因的表達(dá)，而與ρΒΤΙΟ-GUS共同轉(zhuǎn)化的洋蔥表皮檢測(cè)不到⑶S基因的表達(dá)，表明CaERF105可結(jié)合GCC-box順式作用元件。pBT10-GUS-2GCC載體構(gòu)建方法如下
設(shè)計(jì)兩條含2XGCC盒的反向互補(bǔ)寡核苷酸鏈GCC-F 5 ; - CTAGTdO^mAAGAGGACCCAGAATG46O7( CrAAAGAGGACCCAGAATT -3 ; , GCC-R 3 ; - CTAGAATTCTGGGTCCTCTTTgg^g^tTGATTCTG GGTCCTCTTKKtKKtTGA -5 ;(下劃線為添加的SpeI和XbaI酶切位點(diǎn)，斜體所示為GCC-box或CRT/DRE核心序列)。分別將兩條寡核苷酸鏈溶于pH8. O的TE至終濃度為100 μ M，并以1:1的濃度混合，95°C變性30 s移除所有可能的二級(jí)結(jié)構(gòu)，72°C 2 min,37°C
2min，25°C 2 min，緩慢降至室溫，冰上儲(chǔ)存，即為帶有粘性末端的雙鏈DNA。以TE 1/100稀釋至0.5 4 11后與及^ !11，油<31雙酶切后的？81'10-6^載體連接。連接體系為lyL雙酶切后的 ρΒΤΙΟ-GUS 載體(50 ng/yL),l μ L 退火稀釋的雙鏈 DNA(0. 5 μ Μ), I. 5 μ LlOXT4DNA ligase buffer,0. 5 μ L BSA (10 mg/mL),10. 4 μ L nuclease-free H2O,O. 6 μ L T4DNA ligase (350 U/yL)。之后將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH10B感受態(tài)。以所得質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR驗(yàn)證。經(jīng)測(cè)序無誤后提取質(zhì)粒用于瞬間表達(dá)分析。實(shí)施例4、CaERF105亞細(xì)胞定位分析
本發(fā)明采用實(shí)施例3中所述方法。將10 Ug包含有目的基因的pMDC83-GFP質(zhì)粒與10mg/mL鎢粉包埋轉(zhuǎn)化洋蔥下表皮細(xì)胞。GFP熒光波長為488 nm，取白光與藍(lán)色激發(fā)光的同一視野下細(xì)胞進(jìn)行圖像采集，并以PMDC83空載體作為陰性對(duì)照。如圖4所示pMDC83-GFP質(zhì)粒單獨(dú)轉(zhuǎn)化時(shí)在藍(lán)色激發(fā)光下GFP熒光彌散的分布與整個(gè)胞質(zhì)和細(xì)胞核，相反35S::CaERF105-GFP準(zhǔn)確的定位于的細(xì)胞核中，表明基因表達(dá)產(chǎn)物定位于細(xì)胞核。含仏汾的防基因的pMDC83-GFP質(zhì)粒具體實(shí)施方案同實(shí)施例4。實(shí)施例5、植物表達(dá)載體pK7WG2- CaERF105的構(gòu)建
本發(fā)明采用gateway技術(shù)(Walhout et al. , 2000),構(gòu)建雙子葉植物轉(zhuǎn)基因用超表達(dá)載體。雙子葉植物過量表達(dá)載體采用PD0NR207作為入門載體，目的載體為帶有2 X CaMV35S啟動(dòng)子的pK7WG2載體(實(shí)施例4中為pMDC83質(zhì)粒)，擴(kuò)增CaERF105 ORF區(qū)域采用的引物為
forward, 5' - AAAAAGCAGGCT TCATG GGTTCCCCACAAGAGAA -3/ ;reverse, 5' - AGAAAGCTGGGTCTT ATATCATGACAAGCTGAG -3/
外側(cè)接頭引物為
attBl: 5 ; - GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3 ;attB2: 5 ; - GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT -3 ;
以篩選獲得的陽性克隆質(zhì)粒為模板，以forward/reverse為引物(10 μ M),通過Primer STAR HS DNA polymerase (Takara)進(jìn)行擴(kuò)增，在目的基因兩側(cè)加入attB接頭。25 μ LPCR體系擴(kuò)增程序?yàn)?5°C預(yù)變性2 min，94°C變性15 s，55°C退火30 s，68°C延伸60s/90 s，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為10個(gè)循環(huán)。取第一輪擴(kuò)增的產(chǎn)物10 μ L為模板，以attBl/attB2接頭引物進(jìn)行第二套擴(kuò)增程序，50 μ LPCR體系擴(kuò)增程序?yàn)?5°C預(yù)變性I min，94°C變性15 s,45°C退火30 s，68°C延伸60 s/90 s，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為5個(gè)循環(huán)；94°C變性15 s，55°C退火30s，68°C延伸60 s/90 s，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為20個(gè)循環(huán)，68°C延伸5 min。在1%瓊脂糖凝膠上回收attB-PCR產(chǎn)物。通過BP反應(yīng)將目的基因克隆到入門載體pD0NR207。8 μ L反應(yīng)體系為attB-PCR 產(chǎn)物 15-150 ng, pD0NR207 質(zhì)粒 150 ng, BP Clonase enzyme mix 2 μ L TE 補(bǔ)至8 UL0 25°C溫浴I h過夜后加入I 4 1^蛋白酶1(，371消化10 1^11，之后將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DHlOB感受態(tài)。帶有目的基因的pD0NR207入門克隆經(jīng)測(cè)序確認(rèn)無誤后進(jìn)行LR反應(yīng)將目的基因克隆到目的載體PMDC32。10 μ L反應(yīng)體系為入門克隆50-150 ng，pMDC32質(zhì)粒150ng, TE 補(bǔ)至 8 μ L , LR Clonase enzyme mix 2 μ L。25°C溫浴 I h 后加入 I μ L 蛋白酶K，37°C消化10 min，之后將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH10B感受態(tài)。以所得質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR驗(yàn)證。實(shí)施例色、CMRFW5基因煙草遺傳轉(zhuǎn)化及抗性分析
采用液氨凍融法將包含有目的基因ORF區(qū)域的pK7WG2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105。采用葉盤遺傳轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化長于MS培養(yǎng)基中兩個(gè)月煙草K326 (I cmXl cm)。在含有卡那霉素(100 mg/mL)的MS篩選培養(yǎng)基(MS，6-BA1. 5 mg/L, IΑΑ0. I mg/L)上對(duì)抗性苗進(jìn)行篩選，提取正常分化的植株基因組RNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，獲得轉(zhuǎn)基因株系。所有株系均用套袋自交收獲T1代轉(zhuǎn)基因種子。利用T1代轉(zhuǎn)基因種子進(jìn)行轉(zhuǎn)基因煙草表型分析與功能鑒定。本發(fā)明應(yīng)用青枯病病原菌(取自福清地方辣椒青枯病菌)菌體經(jīng)活化后以10 mMMgCl2重懸至IXlO8 cfu/mL。野生型煙草植株及^仍.·.·轉(zhuǎn)基因植株通過浸根處理21 d后觀察表現(xiàn)發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于轉(zhuǎn)基因植株，野生型植株發(fā)生嚴(yán)重的萎焉癥狀(圖6)。
權(quán)利要求
1.一種辣椒AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子基因，其特征在于所述基因的cDNA序列如SEQ ID No. I所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的辣椒AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子基因，其特征在于所述基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示。
3.—種如權(quán)利要求I所述的辣椒AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子基因在煙草抗青枯病基因工程中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種辣椒AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子基因及其應(yīng)用，屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。所述基因的cDNA序列如SEQIDNo.1所示，所述的辣椒AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子基因在煙草抗青枯病基因工程中的應(yīng)用。與野生型煙草相比，本發(fā)明的辣椒CaERF105基因在煙草中的超表達(dá)可顯著提高轉(zhuǎn)基因煙草的抗青枯病能力，在茄科植物抗青枯病基因工程中具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值，將大力促進(jìn)包括煙草在內(nèi)的茄科植物抗青枯病基因工程的發(fā)展。
文檔編號(hào)C07K14/415GK102766639SQ20121026781
公開日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2012年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月31日
發(fā)明者何水林, 黨峰峰, 周蘆糧, 官德義, 林明, 林菁, 虞露, 賴燕 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)