專利名稱：一種家蠶天然膜蛋白prmc2的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種家蠶天然膜蛋白PRMC2的純化方法,屬于蛋白質(zhì)純化技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
膜蛋白(特別是膜內(nèi)在蛋白)在生物體與外界環(huán)境進行物質(zhì)和能量的交換以及信號傳遞等方面起著非常重要的作用。并且大部分膜蛋白是研究新藥的潛在靶點，是新藥研發(fā)的重要領(lǐng)域之一。常規(guī)研究的膜蛋白大部分都是原核表達后獲取的，所以不具有翻譯后修飾，天然蛋白具有最真實的糖基化修飾和空間結(jié)構(gòu)， 是最接近該蛋白的生物活性的，因此純化天然膜蛋白具有重要意義。但是純化天然膜蛋白有三個難點，第一個是富集大量膜蛋白，第二個是有效地溶解膜蛋白，第三個是有效地純化方法。我們利用細胞膜表面HA活性標(biāo)記可以拿到大量的膜蛋白組分，篩選出有效地去垢劑及其濃度去溶解膜蛋白，最后用一系列色譜柱分級純化目的蛋白。整個方案對膜蛋白的純化方法起到一定的推進作用。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的是提供一種家蠶天然膜蛋白PRMC2的純化方法，其利用細胞膜表面HA活性標(biāo)記可以獲取膜蛋白含量高的組分，并利用各種層析技術(shù)進一歩富集我イ丨]的目標(biāo)蛋白。為達到上述目的，本發(fā)明提供一種家蠶天然膜蛋白PRMC2，其氨基酸序列如SEQ IDNO. I所示。上述家蠶天然膜蛋白PRMC2的純化方法，包括以下步驟
(1)制備家蠶生物膜組分將500g蠶蛹粉(保存于4°C)與1500ml (4°C預(yù)冷)的滅菌ddH20混合勻衆(zhòng)2 min,停2 min,置于冰上冷卻，重復(fù)9次；8000 rpm 4°C離心60min,重復(fù)3次；上清15000 rpm 4°C離心60 min,重復(fù)3次，最后一次4層紗布過濾；過濾上清液進行
O.I μ m膜包超濾(料液比1:1)，重復(fù)10次，恢復(fù)到原體積；上清液50000rpm 10°C離心40分鐘。上清密度梯度離心；鋪制蔗糖密度PB (150ml)，樣品(350ml), 30 wt% (400ml), 40wt%(400ml)，55%充滿，30000rpm密度梯度離心3 h ;用56%蔗糖溶液下樣，按30ml/管收集(取樣3ml)，做比活測定；將區(qū)帶離心后收集的樣品進行測活；將活性高的膜組分混合，分別用超濾液IOOkD膜包超濾10次脫糖；
(2)利用去垢劑提取家蠶天然膜蛋白將脫好糖的細胞膜組分與膜蛋白提取液(含1%的去垢劑CHAPS)按體積比1:2的比例混合，4°C輕微攪拌8小時左右；將提取好的膜蛋白混合液于8000 rpm離心20分鐘后取上清，準備裝柱過陰離子交換；
(3)分級純化家蠶天然膜蛋白PRMC2:將準備好的蛋白樣品600ml在4度與280mlDEAE填料緩慢均勻攪拌混合，每隔10分鐘攪拌一次，共混合2小吋，毎次裝柱前都應(yīng)將填料攪拌均勻，同時將柱子下方出樣ロ打開，并收集流出液，直到柱子全部裝好(特別要注意整個裝柱過程禁止填料干掉)；將裝好的DEAE柱連接到AKTA液相色譜儀上后，用20mMTris平衡600ml,平衡好后，用梯度提高NaCl濃度的方法進行分布洗脫；共出現(xiàn)4個大峰，并對每個峰走電泳檢測；將含有目的蛋白的峰收集濃縮，用SuperdexTM 200 (分子篩層析)進ー步分離，并對每個峰走電泳檢測；將含有目的蛋白的峰收集濃縮，用RESCOURCE Q(分子篩層祈)，I mL進ー步梯度洗脫分離，共分得7個峰，并對每個峰走電泳檢測，以獲得較純的家蠶天然膜蛋白PRMC2。本發(fā)明利用家蠶桿狀病毒在細胞的感染初期以出芽病毒的方式穿過細胞膜，被病毒穿膜后的破碎細胞膜融合后形成各種囊泡 ，經(jīng)過低速離心，超速離心，密度梯度離心等一系列操作，可以有效地分離細胞膜成分，同時以HA活性為Marker標(biāo)定細胞膜，從而有效獲得膜蛋白質(zhì)；也為我們更好的拿到高含量膜蛋白組分提供了很好的解決方法，這是ー種全新的有效的膜蛋白分離技術(shù)，具有重要的意義。


圖1是將區(qū)帶離心后收集的樣品進行測活，1，2，3，4，5，6，7，8:區(qū)帶后收集的樣品，9為區(qū)帶前的樣品，并倍比稀釋8個孔，NC為陰性對照，結(jié)果顯示1，2，3，5，6，7樣品HA活性較高；
圖2是家蠶天然膜蛋白PRMC2的DEAE(300ml)離子交換初步分離色譜 圖3是DEAE (300ml)分離天然膜蛋白PRMC2的電泳分析圖；M:低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)標(biāo)準；I:原樣(膜蛋白提取液提取后的蛋白組分)；2 :穿透液；4 :第4管產(chǎn)物；5 :第5管產(chǎn)物；17:第17管產(chǎn)物；21 :第21管產(chǎn)物；25:第25管產(chǎn)物；32 :第32管產(chǎn)物；其中家蠶天然膜蛋白PRMC2在第17管中；
圖4是家蠶天然膜蛋白PRMC2的Superdex 200進ー步分離色譜 圖5是Superdex 200進ー步分離家蠶天然膜蛋白PRMC2的電泳分析圖；20:第20管產(chǎn)物；21 第21管產(chǎn)物；M:低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)標(biāo)準；23:第23管產(chǎn)物；24 第24管產(chǎn)物；25:第25管產(chǎn)物；26 :第26管產(chǎn)物；27:第27管產(chǎn)物；其中家蠶天然膜蛋白PRMC2在第26管中；
圖6是家蠶天然膜蛋白PRMC2的RESCOURCE Q，I mL進ー步分離色譜 圖7是RESCOURCE Q，I mL進ー步分離家蠶天然膜蛋白PRMC2的電泳分析圖；M:低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)標(biāo)準；第5峰濃縮液；第5峰濾出液；第6峰濃縮液；第6峰濾出液(家蠶天然膜蛋白PRMC2所在峰)；第7峰濃縮液；第7峰濾出液；第8峰濃縮液；第8峰濾出液；
圖8是家蠶天然膜蛋白的PRMC2質(zhì)譜鑒定圖。
具體實施例方式應(yīng)該指出，以下具體說明都是例示性的，g在對本發(fā)明提供進ー步的說明。在本說明書中，除非特別指明，否則所用技術(shù)術(shù)語為本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員常用術(shù)語；本說明書中未注明具體條件的實驗方法是按常規(guī)實驗方法；本說明書中所用的試驗材料如無特別說明均為市售購買產(chǎn)品，各種試劑和培養(yǎng)基的成分和配制方法可參見常規(guī)實驗手冊中的操作。下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做進ー步說明。
實施例I :制備家蠶生物膜組分
(1)500g蠶蛹粉(購于浙江中奇生物藥業(yè)股份有限公司，保存于4°C)與1500ml(4°C預(yù)冷)的滅菌ddH20混合勻漿2 min,停2 min,置于冰上冷卻，重復(fù)9次；
(2)8000印111、4°(1|離心60111；[11,重復(fù)3次；
(3)上清于15000rpm、4°C離心60 min，重復(fù)3次，最后一次4層紗布過濾；
(4)過濾上清液進行O.I μ m膜包超濾(料液體積比1:1),重復(fù)10次,恢復(fù)到過濾前體積；
(5)上清液于50000rpm>10°C離心 40分鐘；
(6)上清密度梯度離心鋪制蔗糖密度PB(150ml)，樣品(350ml)，30% (400ml)，40% (400ml)，55%充滿，30000rpm密度梯度離心3 h (PB是ー種配制蔗糖溶液的緩沖液不含蔗糖，也可以說是0%的蔗糖);
(7)用質(zhì)量濃度56%的蔗糖溶液下樣，按30ml/管收集(取樣3ml)，做比活測定，如圖I所示，將區(qū)帶離心后收集的樣品進行測活；
(8)將活性高的膜組分混合，分別用超濾液IOOkD膜包超濾10次脫糖(超濾液分兩種一種高鹽(含IMNaCl),—種低鹽(不含NaCl)，高鹽的超濾液用來將膜蛋白偶聯(lián)的非膜蛋白洗脫棹)。實施例2 :利用去垢劑提取家蠶天然膜蛋白
(1)將脫好糖的細胞膜組分與膜蛋白提取液(含1%的去垢劑CHAPS)按體積比1:2的比例混合，4°C輕微攪拌過夜(如果脫糖超濾液含高鹽，還需100K膜包脫鹽)；
(2)將提取好的膜蛋白混合液于8000rpm離心20分鐘后取上清，準備裝柱過陰離子交換。實施例3 :分級純化家蠶天然膜蛋白PRMC2
(1)家蠶天然膜蛋白PRMC2的DEAE)離子交換初步分離將準備好的蛋白樣品600ml在4°C與280mlDEAE填料緩慢均勻攪拌混合，每隔10分鐘攪拌一次，共混合2小吋，每次裝柱前都應(yīng)將填料攪拌均勻，同時將柱子下方出樣ロ打開，并收集流出液，直到柱子全部裝好(特別要注意整個裝柱過程禁止填料干掉)，將裝好的DEAE柱連接到AKTA液相色譜儀上后，用20mMTris鹽酸緩沖液平衡600ml，平衡好后，用梯度提高NaCl濃度的方法進行分布洗脫；共出現(xiàn)4個大峰，如圖2所示，并對每個峰走電泳檢測如圖3所示；
(2)家蠶天然膜蛋白PRMC2的Superdex 200進ー步分離將含有目的蛋白的峰收集濃縮，用Superdex 200進ー步分離，共分得6個峰，如圖4所示，并對每個峰走電泳檢測如圖5所示；
(3)家蠶天然膜蛋白PRMC2的RESCOURCEQ，I mL進ー步分離將含有目的蛋白的峰收集濃縮，用RESCOURCE Q，I mL進ー步梯度洗脫分離，共分得7個峰，如圖6所示，并對每個峰走電泳檢測如圖7所示，其中家蠶天然膜蛋白PRMC2在第6峰中。實施例4:家蠶天然膜蛋白PRMC2的質(zhì)譜鑒定 I.樣品制備主要步驟
a.將實施例3得到的目的蛋白割膠后，切成Imm3左右的小塊，裝入離心管中，水洗3
次；
b.用50%(v/v)ACN/25mM碳酸氫銨(ΙΟΟμΙ,ρΗ 8.0)脫色15分鐘，反復(fù)3次，直至將顔色脫盡；
C.蒸餾水洗滌I次；
d.將膠塊浸入30μ I、100 % ACN (こ腈)中5分鐘，脫水，膠塊變白，然后室溫抽干；
e.加8μ1 Trypsin 酶 液(O. lmg/ml), 37°C 過夜 16h 左右。2.質(zhì)譜儀操作流程
a.清洗樣品板；
b.校正儀器標(biāo)準品的配制、點樣、檢測；
c.點樣、檢測
①將O.3 μ L已酶解的樣品加O. 3 μ L的基質(zhì)點到樣品板上，室溫晾干；
②打開4000Series software,將樣品板放入質(zhì)譜儀；
③新建ー個spotset,打開校正儀器的采集方法和處理模式,校正儀器；
④打開測試未知樣品的采集方法和處理模式，進行樣品分析；一級激光強度3900，ニ級激光強度4300，檢測分子量范圍700-4000Da，選用正離子反射模式進行質(zhì)譜分析。3.質(zhì)譜結(jié)果為家蠶天然膜蛋白PRMC2，如圖8所示。該蛋白的肽指紋圖譜與西南農(nóng)大蛋白庫中的編號gi114052687的蛋白覆蓋率達27. 52%，肽段匹配數(shù)5段，并獲得其氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示，證明該蛋白即為家蠶天然膜蛋白PRMC2。以上所述，僅為本發(fā)明的實施例，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)中的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明的核心技術(shù)特征的前提下，還可以做若干的改進和潤飾，這些潤飾和改進也應(yīng)屬于本發(fā)明的專利保護范圍。
權(quán)利要求
1.一種家蠶天然膜蛋白PRMC2，其氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.—種權(quán)利要求I所述的家蠶天然膜蛋白PRMC2的純化方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟 (1)制備家蠶生物膜組分； (2)利用去垢劑提取家蠶天然膜蛋白PRMC2； (3)分級純化所述家蠶天然膜蛋白PRMC2。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)具體包括將保存于_80°C的蠶蛹粉與4°C預(yù)冷的滅菌ddH20等體積混合勻漿2 min,停2 min,置于冰上冷卻，重復(fù)9次；8000 rpm、4°C離心60min,重復(fù)3次；上清于15000 rpm、4°C離心60 min,重復(fù)3次,最后一次4層紗布過濾；過濾上清液進行0. I ii m膜包超濾，其中料液體積比為1: 1，重復(fù)10次，體積恢復(fù)到過濾前體積；上清液于50000rpm，10°C離心40分鐘；上清密度梯度離心；鋪制蔗糖密度PB (150ml)，樣品(350ml) ,30wt %(400ml), 40wt %(400ml)，55% 充滿，30000rpm 密度梯度離心3 h ;用56%蔗糖溶液下樣，按30ml/管收集，取樣3ml，做比活測定；將區(qū)帶離心后收集的樣品進行測活；將活性高的膜組分混合，分別用超濾液IOOkD膜包超濾10次脫糖。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)具體包括將脫好糖的細胞膜組分與膜蛋白提取液按體積比1:2的比例混合，4°C輕微攪拌過夜至少8小時；將提取好的膜蛋白混合液于8000 rpm離心20分鐘后取上清，準備裝柱過陰離子交換。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)具體包括將準備好的蛋白樣品600ml在4°C與280mlDEAE填料緩慢均勻攪拌混合，每隔10分鐘攪拌一次，共混合2小時，每次裝柱前都應(yīng)將填料攪拌均勻，同時將柱子下方出樣口打開，并收集流出液，直到柱子全部裝好；將裝好的DEAE柱連接到AKTA液相色譜儀上后，用20mMTris平衡600ml，平衡好后，用梯度提高NaCl濃度的方法進行分布洗脫，共出現(xiàn)4個大峰，并對每個峰走電泳檢測；將含有目的蛋白的峰收集濃縮，用SuperdexTM 200進一步分離，并對每個峰走電泳檢測；將含有目的蛋白的峰收集濃縮，用RESCOURCE Q，1 mL進一步梯度洗脫分離，共分得7個峰，并對每個峰走電泳檢測，以獲得較純的家蠶天然膜蛋白PRMC2。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述膜蛋白提取液含有1%的去垢劑CHAPS。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種家蠶天然膜蛋白PRMC2的純化方法，屬于蛋白質(zhì)純化技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以發(fā)病蠶蛹作為原料，通過勻漿，差速離心，密度梯度離心，超濾，及HA活性標(biāo)定，得到膜含量高的組分，然后用去垢劑將膜蛋白提取出來，再經(jīng)三步層析分離純化，得到所述家蠶天然膜蛋白PRMC2。本發(fā)明提供的純化方法，對較難分離的天然膜蛋白的純化提出了一種全新的解決方法，具有重要意義。
文檔編號C07K14/435GK102850447SQ201210277340
公開日2013年1月2日 申請日期2012年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月6日
發(fā)明者張耀洲, 楊波, 張小蓓, 陳劍清, 舒特俊 申請人:天津耀宇生物技術(shù)有限公司