專利名稱：用銅綠假單胞桿菌發(fā)酵、分離生產(chǎn)鼠李糖脂的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)鼠李糖脂的方法，特別涉及一種用銅綠假單胞桿菌發(fā)酵、分離生產(chǎn)鼠李糖脂的方法。
背景技術(shù)：
在石油勘探、開發(fā)、煉制及運儲過程中，由于意外事故或操作失誤，造成原油或油品從作業(yè)現(xiàn)場或儲器里外泄，溢油流向地面、水面、海灘或海面，同時由于油質(zhì)成分的不同，形成薄厚不等的一片油膜，這一現(xiàn)象稱為溢油。隨著全球經(jīng)濟一體化進程的加快，海上石油 運輸和海上石油開采量迅速增加，海上溢油事故也不斷增多，嚴重威脅著海洋及沿海陸域的生態(tài)環(huán)境。據(jù)保守估計，每年有320萬噸原油因泄漏等原因進入到海洋中。溢油分散劑俗稱“消油劑”。它是用來減少溢油與水之間的界面張力，從而使油迅速乳化分散在水中的化學(xué)藥劑。在許多不能采用機械回收或有火災(zāi)危險的緊急情況下，及時地噴灑溢油分散劑，是消除水面石油污染和防止火災(zāi)的主要措施。消油劑可分為化學(xué)消油劑和生物消油劑。由于生物消油劑的主要成分生物表面活性劑的生產(chǎn)成本居高不下，阻礙了生物消油劑的大規(guī)模應(yīng)用，目前在應(yīng)對海上溢油事故時使用的主要是化學(xué)消油劑。但化學(xué)消油劑本身具有一定的毒性，因此世界各國政府對化學(xué)消油劑的應(yīng)用，都采取慎重的態(tài)度。生物消油劑逐步取代化學(xué)消油劑是必然的趨勢。鼠李糖脂為一種陰離子表面活性劑，它們不僅溶于甲醇、氯仿和乙醚，在堿性水溶液中也表現(xiàn)出良好的溶解特性。然而鼠李糖脂最突出的特性是它的表面活性，如能顯著降低水的表面張力，改變固體表面的潤濕性，具有乳化、破乳、消泡、洗滌、分散與絮凝、抗靜電和潤滑等多種功能。鼠李糖脂對微生物、動物和人類均不會構(gòu)成危害，但可以降解類似墨西哥灣漏油事故中釋放出來的多環(huán)芳香族碳氫化合物(PAHs)，該種化合物是芳香族碳氫化合物中的一種特例，它可以致癌或誘發(fā)基因突變。鼠李糖脂在不同的溫度、酸堿度以及鹽度的環(huán)境中相對穩(wěn)定，可以有效降解原油中至少5種多環(huán)芳香族碳氫化合物。對清除環(huán)境污染物質(zhì)安全和有效方法的研究，對發(fā)現(xiàn)這種生物表面活性劑和PAHs降解微生物起到了重要的促進作用。以其為主要成分的生物消油劑是化學(xué)消油劑的良好替代品。國際上對鼠李糖脂理論研究及應(yīng)用開發(fā)已開展多年，但我國目前在該領(lǐng)域還處于起步階段。鼠李糖脂的應(yīng)用范圍非常廣闊，但是其生產(chǎn)成本居高不下，限制著鼠李糖脂大規(guī)模的商業(yè)化生產(chǎn)進程，現(xiàn)在國際、國內(nèi)范圍內(nèi)都沒有純品鼠李糖脂糖脂的公開銷售。制約鼠李糖脂工業(yè)化生產(chǎn)的因素主要包括菌種的生產(chǎn)能力、培養(yǎng)條件、生產(chǎn)方式以及分離提取方式等，其中菌種誘變工作和培養(yǎng)條件優(yōu)化研究已經(jīng)非常普遍，也發(fā)現(xiàn)了較為優(yōu)良的菌種，在適宜的培養(yǎng)條件下可達到較高且穩(wěn)定的產(chǎn)量，但總體來看，現(xiàn)有的工藝與實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)所要求的低成本還有很大的差距。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為解決公知技術(shù)中存在的技術(shù)問題而提供一種銅綠假單胞桿菌發(fā)酵、分離生產(chǎn)鼠李糖脂的方法，該方法能夠?qū)崿F(xiàn)鼠李糖脂的低成本工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明為解決公知技術(shù)中存在的技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案是一種用銅綠假單胞桿菌發(fā)酵、分離生產(chǎn)鼠李糖脂的方法，包括以下步驟 一)采用斜面接種法將銅綠假單胞桿菌菌種移入搖瓶進行擴大培養(yǎng)，獲得銅綠假單胞桿菌種子液；二)先將發(fā)酵培養(yǎng)基加入發(fā)酵罐滅菌，然后按照8% 12%的接種量將銅綠假單胞桿囷種子液接入發(fā)酵te，在接種種子液如，在培養(yǎng)基中加入1_5%。的泡敵；所述發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分的濃度為(g/L):大豆油40 120 ；KH2P04 3 7 ；K2HP046 10 ；NaN03 2 4 ；NaCl O. 5 2 ；KC1 O. 5 2 ；MgS04 · 7H20 O. Γ ；無水 CaC12O. 01" . 5 ;微量元素溶液2"l0mL/L ;微量元素溶液的pH :7. (Γ8. 5,所述微量元素溶液中各溶質(zhì)的濃度為(g/U FeS04 · 7H20 12 ；ZnS04 · 7H20 3. O ；CoS04 · 7H20 I. 0 ；MnS04 · 2H203. 0 ；銅綠假單胞桿菌種子液在發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵至120小時，獲得糊狀發(fā)酵液；三)使用分離設(shè)備對糊狀發(fā)酵液進行兩次萃取蒸餾I)先將糊狀發(fā)酵液的pH調(diào)節(jié)至f 3，然后靜置，待自然沉降后，加入乙酸乙酯進行萃取，收集上層萃取液；2)蒸餾步驟I)中獲得的上層萃取液，將其中的乙酸乙酯蒸餾去除，獲得膏狀鼠李糖脂混合物；3)將步驟2)中獲得的膏狀鼠李糖脂混合物重溶在乙酸乙酯內(nèi)，對其進行二次萃取，收集位于上層的二次萃取液；4)蒸餾步驟3)中獲得的二次萃取液，將其中的乙酸乙酯蒸餾去除，獲得純度為80% 90%的膏狀鼠李糖脂。還包括步驟四)，將純度為80°/Γ90%的膏狀鼠李糖脂烘干，獲得純度95%以上的鼠李糖脂。所述發(fā)酵罐為消泡式發(fā)酵罐，所述消泡式發(fā)酵罐包括罐體和由電機驅(qū)動的攪拌軸，在所述攪拌軸的上部從上至下依次裝有長臂消泡漿和短臂消泡漿，在所述長臂消泡漿和所述短臂消泡漿之間設(shè)有外圓周面與所述罐體固接的環(huán)形貼壁擋板。所述分離設(shè)備包括儲藏罐、粗餾罐、重溶罐、蒸餾罐和回收罐；所述儲藏罐上設(shè)有加料口、出料閥和排料閥，所述加料口設(shè)置在儲藏罐的上部，所述出料閥設(shè)置在儲藏罐的側(cè)部，所述排料閥設(shè)置在儲藏罐的底部；所述粗餾罐設(shè)有頂部出口、底部出口、側(cè)部進口和罐體加熱套，所述粗餾罐的側(cè)部進口通過連接管與所述儲藏罐的出料閥連接；所述重溶罐設(shè)有側(cè)部進口、側(cè)部出口和底部出料閥，所述重溶罐的側(cè)部進口與所述粗餾罐的底部出口連接；所述蒸餾罐設(shè)有側(cè)部進口、頂部出口、底部出口和罐體加熱套，所述蒸餾罐的側(cè)部進口與所述重溶罐的側(cè)部出口連接；所述回收罐包括頂部入口和底部出料閥，所述回收罐的頂部入口通過冷凝管與所述蒸餾罐的頂部出口和所述粗餾罐的頂部出口連接，所述冷凝管上設(shè)有冷凝套。本發(fā)明具有的優(yōu)點和積極效果是采用大豆油作為培養(yǎng)基的主要成分，同時采用一次發(fā)酵、調(diào)酸后兩次萃取蒸餾的工藝，能夠滿足純度為80%以上的鼠李糖脂低成本大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的需要。進一步地，通過采用消泡式發(fā)酵罐，減少了發(fā)泡的產(chǎn)生，提高了培養(yǎng)基的利用率和鼠李糖脂的產(chǎn)量，進一步降低了鼠李糖脂的生產(chǎn)成本。本發(fā)明整個工藝生產(chǎn)流程完整，操作步驟簡單，設(shè)備容易控制。


圖I為本發(fā)明的流程框圖；圖2為本發(fā)明所采用的消泡式發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)示意圖；圖3為本發(fā)明所采用的分離設(shè)備的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實施例方式為能進一步了解本發(fā)明的發(fā)明內(nèi)容、特點及功效，茲例舉以下實施例，并配合附圖 詳細說明如下實施例I :請參閱圖1， 一種銅綠假單胞桿菌發(fā)酵、分離生產(chǎn)鼠李糖脂的方法，包括以下步驟一)采用斜面接種法將銅綠假單胞桿菌菌種移入搖瓶進行擴大培養(yǎng)，獲得銅綠假單胞桿菌種子液。二)先將滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基加入發(fā)酵罐，然后按照8%的接種量將銅綠假單胞桿囷種子液接入發(fā)酵te，在接種種子液如，在培養(yǎng)基中加入1%。的泡敵；上述發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分的濃度為(g/L):大豆油 40 ;KH2P04 3 ；K2HP04 6 ；NaN03 2 ；NaCl 0. 5 ；KC10. 5 ；MgS04 -7H20 0. I ;無水CaCl2 0. 01 ;微量元素溶液2mL/L ;微量元素溶液的pH :7. 0，微量元素溶液中各溶質(zhì)的濃度為(g/U FeS04 · 7H20 12 ；ZnS04 · 7H20 3. O ；CoS04 · 7H20 I. 0 ；MnS04 · 2H20 3. 0。在本實施例中，上述發(fā)酵罐為消泡式發(fā)酵罐。請參見圖2，所述消泡式發(fā)酵罐包括罐體和設(shè)置在其頂端的頂蓋，罐體底端設(shè)有底座9，罐體底部設(shè)有出料口 8，罐體上設(shè)有加熱套6，罐體上設(shè)有四個電極槽7，分別用于安裝溶氧量探頭、pH探頭、溫度探頭和壓力探頭，溶氧量探頭、PH探頭、溫度探頭和壓力探頭分別通過導(dǎo)線與中控裝置連接。罐體上部設(shè)有進氣管11 ;頂蓋上設(shè)有與其轉(zhuǎn)動連接的攪拌軸、進料口 3、調(diào)酸口 13-1、調(diào)堿口 13-2、補料口 13-3和排氣管1，排氣管I上纏繞有冷卻管2，攪拌軸的上端與電機連接軸14連接，由電機驅(qū)動。攪拌軸下部裝有攪拌槳10，上部從上至下依次裝有長臂消泡漿4和短臂消泡漿5，在長臂消泡漿4和短臂消泡漿5之間設(shè)有外圓周面與罐體固接的環(huán)形貼壁擋板12。使攪拌軸保持500r/min的轉(zhuǎn)速,使溶氧量保持在30%以上。發(fā)酵依靠長、短消泡漿及環(huán)形貼壁擋板機械消泡。發(fā)酵至120h即達到下罐要求，從出料口 8獲得糊狀發(fā)酵液。三)使用分離設(shè)備對糊狀發(fā)酵液進行兩次萃取蒸餾請參見圖3，在本實施例中分離設(shè)備包括儲藏罐15、粗餾罐21、重溶罐24、蒸餾罐25和回收罐23，各個罐體之間采用耐酸鋼制管道或者耐酸粗皮管相連接。儲藏罐15上設(shè)有監(jiān)視窗17、加料口 16、出料閥19和排料閥18，監(jiān)視窗17設(shè)置在儲藏罐的中部，加料口 16設(shè)置在儲藏罐的上部，出料閥19設(shè)置在儲藏罐的側(cè)部，排料閥18設(shè)置在儲藏罐的底部；監(jiān)視窗17用于觀察罐內(nèi)的物料。打開排料閥18，可將罐內(nèi)沉淀物料全部排空。粗餾罐21設(shè)有頂部出口、底部出口、側(cè)部進口和罐體加熱套22，粗餾罐21的側(cè)部進口通過連接管20與儲藏罐15的出料閥19連接。重溶罐24設(shè)有側(cè)部進口、側(cè)部出口和底部出料閥，重溶罐24的側(cè)部進口與粗餾罐21的底部出口連接。蒸餾罐25設(shè)有側(cè)部進口、頂部出口、底部出口和罐體加熱套，蒸餾罐25的側(cè)部進口與重溶罐24的側(cè)部出口連接?；厥展?7包括頂部入口和底部出料閥，回收罐27的頂部入口通過冷凝管與蒸餾罐25的頂部出口和粗餾罐21的頂部出口連接，冷凝管上設(shè)有冷凝套26。將糊狀發(fā)酵液從加料口 16注入儲藏罐15，并將其pH調(diào)節(jié)至I，靜置，使其自然沉 降后，加入濃度為30%的乙酸乙酯，進行萃取，打開出料閥19，使乙酸乙酯萃取液經(jīng)連接管20進入粗餾罐21進行蒸餾，乙酸乙酯萃取液經(jīng)過蒸餾后，在粗餾罐21的底部獲得膏狀鼠李糖脂混合物，采用泵抽的方法，使膏狀鼠李糖脂混合物從粗餾罐21的底部出口排出進入重溶罐24。進行重溶萃取，重溶罐24內(nèi)加注有濃度為30%的乙酸乙酯，重溶于乙酸乙酯的萃取液進入蒸餾罐25，在蒸餾罐25內(nèi)進行第二次蒸餾，在蒸餾罐25的底部獲得純度為80%的膏狀鼠李糖脂，并可通過其底部出口獲得純度為80%的膏狀鼠李糖脂產(chǎn)品。在儲藏罐15底部產(chǎn)生的沉淀物可從其底部的排料閥18排出；粗餾罐21內(nèi)蒸發(fā)后的乙酸乙酯從粗餾罐21的頂部出口排出，經(jīng)冷凝管26冷凝成液態(tài)進入回收罐27 ;在重溶罐24底部產(chǎn)生的沉淀物可從其底部的排料閥排出；蒸餾罐25內(nèi)蒸發(fā)后的乙酸乙酯從蒸餾罐25的頂部出口排出，經(jīng)冷凝管26冷凝成液態(tài)進入回收罐27，回收罐27內(nèi)回收的乙酸乙酯從其底部排料閥排出后，可重復(fù)使用。四)將純度為80%的膏狀鼠李糖脂烘干，獲得純度95%的鼠李糖脂。實施例2 與實施例I的不同之處在于一、在步驟二)中，銅綠假單胞桿菌種子液的接種量為12% ;在培養(yǎng)基中加入5%。的泡敵；發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分的濃度為(g/L):大豆油120 ;KH2P04 7 ；K2HP04 10 ；NaN03 4 ；NaCl 2 ；KC1 2 ；MgS04 · 7H20 I ;無水CaC12 0. 5 ;微量元素溶液lOmL/L ;微量元素溶液的pH 8. 5，微量元素溶液中各溶質(zhì)的濃度為(g/L) FeS04 · 7H20 12 ；ZnS04 · 7H20 3. O ；CoS04 · 7H20 I. 0 ；MnS04 · 2H20 3. 0。二、在步驟三)中，將糊狀發(fā)酵液的pH調(diào)節(jié)至3 ;首次萃取加入乙酸乙酯的濃度為60%，再次萃取加入乙酸乙酯的濃度為60% ;在蒸餾罐25的底部獲得的膏狀鼠李糖脂純度為90%。三、在步驟四)中，膏狀鼠李糖脂烘干后，獲得鼠李糖脂的純度為99%。除上述參數(shù)與實施例I不同外，本實施例所采用的工藝及設(shè)備均與實施例I相同。盡管上面結(jié)合附圖對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行了描述，但是本發(fā)明并不局限于上述的具體實施方式
，上述的具體實施方式
僅僅是示意性的，并不是限制性的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的啟示下，在不脫離本發(fā)明宗旨和權(quán)利要求所保護的范圍情況下，還可以作出很多形式，這些均屬于本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種用銅綠假單胞桿菌發(fā)酵、分離生產(chǎn)鼠李糖脂的方法，其特征在于，包括以下步驟 一)采用斜面接種法將銅綠假單胞桿菌菌種移入搖瓶進行擴大培養(yǎng)，獲得銅綠假單胞桿菌種子液； 二)先將發(fā)酵培養(yǎng)基加入發(fā)酵罐滅菌，然后按照8% 12%的接種量將銅綠假單胞桿菌種子液接入發(fā)酵罐，在接種種子液前，在培養(yǎng)基中加入1_5%。的泡敵； 所述發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分的濃度為(g/L):大豆油40 120 ；KH2P04 3 7 ;K2HP046 10 ；NaN03 2 4 ；NaCl 0. 5 2 ；KC1 0. 5 2 ；MgS04 7H20 0. I I ;無水 CaCl2 0. 01 0. 5 ;微量元素溶液2 10mL/L ;微量元素溶液的pH :7. (T8. 5，所述微量元素溶液中各溶質(zhì)的濃度為(g/L)FeS04 7H20 12 ；ZnS04 7H20 3. 0 ；CoS04 7H20 I. 0 ；MnS04 2H203. 0 ； 銅綠假單胞桿菌種子液在發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵至120小時，獲得糊狀發(fā)酵液； 三)使用分離設(shè)備對糊狀發(fā)酵液進行兩次萃取蒸餾 1)先將糊狀發(fā)酵液的PH調(diào)節(jié)至f3，然后靜置，待自然沉降后，加入乙酸乙酯進行萃取，收集上層萃取液； 2)蒸餾步驟I)中獲得的上層萃取液，將其中的乙酸乙酯蒸餾去除，獲得膏狀鼠李糖脂混合物； 3)將步驟2)中獲得的膏狀鼠李糖脂混合物重溶在乙酸乙酯內(nèi)，對其進行二次萃取，收集位于上層的二次萃取液； 4)蒸餾步驟3)中獲得的二次萃取液，將其中的乙酸乙酯蒸餾去除，獲得純度為80% 90%的膏狀鼠李糖脂。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用銅綠假單胞桿菌發(fā)酵、分離生產(chǎn)鼠李糖脂的方法，其特征在于，還包括步驟四)，將純度為809^90%的膏狀鼠李糖脂烘干，獲得純度95%以上的鼠李糖脂。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用銅綠假單胞桿菌發(fā)酵、分離生產(chǎn)鼠李糖脂的方法，其特征在于，所述發(fā)酵罐為消泡式發(fā)酵罐，所述消泡式發(fā)酵罐包括罐體和由電機驅(qū)動的攪拌軸，在所述攪拌軸的上部從上至下依次裝有長臂消泡漿和短臂消泡漿，在所述長臂消泡漿和所述短臂消泡漿之間設(shè)有外圓周面與所述罐體固接的環(huán)形貼壁擋板。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用銅綠假單胞桿菌發(fā)酵、分離生產(chǎn)鼠李糖脂的方法，其特征在于，所述分離設(shè)備包括儲藏罐、粗餾罐、重溶罐、蒸餾罐和回收罐； 所述儲藏罐上設(shè)有加料口、出料閥和排料閥，所述加料口設(shè)置在儲藏罐的上部，所述出料閥設(shè)置在儲藏罐的側(cè)部，所述排料閥設(shè)置在儲藏罐的底部； 所述粗餾罐設(shè)有頂部出口、底部出口、側(cè)部進口和罐體加熱套，所述粗餾罐的側(cè)部進口通過連接管與所述儲藏罐的出料閥連接； 所述重溶罐設(shè)有側(cè)部進口、側(cè)部出口和底部出料閥，所述重溶罐的側(cè)部進口與所述粗餾罐的底部出口連接； 所述蒸餾罐設(shè)有側(cè)部進口、頂部出口、底部出口和罐體加熱套，所述蒸餾罐的側(cè)部進口與所述重溶罐的側(cè)部出口連接； 所述回收罐包括頂部入口和底部出料閥，所述回收罐的頂部入口通過冷凝管與所述蒸餾罐的頂部出口和所述粗餾罐的頂部出口連接，所述冷凝管上設(shè)有冷凝套。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用銅綠假單胞桿菌發(fā)酵、分離生產(chǎn)鼠李糖脂的方法，包括以下步驟一)采用斜面接種法將銅綠假單胞桿菌菌種移入搖瓶進行擴大培養(yǎng)，獲得銅綠假單胞桿菌種子液；二)先將發(fā)酵培養(yǎng)基加入發(fā)酵罐滅菌，然后按照8%～12%的接種量將銅綠假單胞桿菌種子液接入發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵，在接種種子液前，在培養(yǎng)基中加入1-5‰的泡敵；銅綠假單胞桿菌種子液發(fā)酵至120小時，獲得糊狀發(fā)酵液；三)使用分離設(shè)備對糊狀發(fā)酵液進行兩次萃取蒸餾，獲得純度為80%~90%的膏狀鼠李糖脂。本發(fā)明能夠滿足純度為80%以上的鼠李糖脂低成本大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的需要。
文檔編號C07H15/04GK102796781SQ20121028106
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月8日
發(fā)明者曲良, 李廣茹, 李明, 陳宇, 盧文玉, 朱零青, 楊雪 申請人:中國海洋石油總公司, 中海油能源發(fā)展股份有限公司, 中海石油環(huán)保服務(wù)(天津)有限公司