專利名稱：一種腎靶向藥物載體及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于制藥領(lǐng)域，具體涉及人血清白蛋白多肽片段這一具有良好腎靶向效率的藥物載體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腎臟是泌尿系統(tǒng)的組成器官之一，是人體的主要排泄器官。它通過生成和排出尿液，排出體內(nèi)代謝廢物及有害物質(zhì)，重吸收有用物質(zhì)，可調(diào)節(jié)水、滲透壓及酸堿平衡維持體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。近年來，隨著亞健康生活方式增多和生活節(jié)奏加快，急慢性腎病發(fā)病率飛速增高。研究報(bào)告表明，在發(fā)達(dá)國家，約有6. 59TlO%的人群患有不同程度的腎臟疾病。而在中國，四十歲以上人群慢性腎臟病的患病率高達(dá)8°/Γ9%，比高血壓、糖尿病的發(fā)病率還高； 門診中，約有三分之一的病人出現(xiàn)明顯的腎功能下降甚至衰竭。目前，臨床上治療慢性腎臟疾病主要以透析和腎移植為主，但治療費(fèi)用高昂，治療周期較長，因此藥物治療更具優(yōu)勢。然而，普通藥物治療均存在不同程度的腎外效應(yīng)，靶向性不強(qiáng)，這樣會導(dǎo)致嚴(yán)重的毒副作用。此外，一些藥物在達(dá)到腎臟之前就被降解，即使部分藥物到達(dá)了腎臟，也不一定能被靶細(xì)胞攝取而起到治療作用；特別是當(dāng)腎臟功能異常時，藥物的傳遞也同樣會受到一定程度的影響。因此，為了增加藥物的安全性和有效性，研究具有良好腎臟靶向性的藥物很有必要。為此，各國科學(xué)家已經(jīng)對腎靶向給藥系統(tǒng)進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究。Suzuki等人報(bào)道了烷基糖苷具有腎靶向載體的潛力。他們采用不同糖分子作為載體，通過不同長度的烷基間隔基將載體和模型藥物(精氨酸抗利尿激素，AVP)結(jié)合，研究了大鼠靜注AVP-糖基復(fù)合物后的組織攝取情況，發(fā)現(xiàn)組織分布特性很大程度上取決于結(jié)合物中的糖分子葡萄糖(Glc)、甘露糖(Man)和2d-Glc-C8_AVP都顯示出良好的腎臟特異性分布。Glc-S_C8-衍生物具有明顯的腎靶向性，說明Glc-S-C8-是良好的腎靶向載體。相關(guān)專利是EP0953357。Yamamoto Y等人采用自由基聚合反應(yīng)制備乙烯基吡咯烷酮/ 二甲基馬來酸共聚物(PVD)，并考察分子量和電荷對PVD在小鼠體內(nèi)分布的影響。分子量為600(Γ8000道爾頓的PVD有很好的腎靶向性，給藥劑量80%左右的PVD被腎攝取。在國內(nèi)，張志榮等人將天然的殼聚糖進(jìn)行降解和衍生化得到低分子量殼聚糖或其衍生物，證明了其具有良好的腎靶向性，該藥物載體通過化學(xué)鍵與抗腫瘤藥物或糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑相連得到前體藥物，體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)研究顯示該前體藥物能夠在體內(nèi)到達(dá)腎臟并釋放出活性藥物。相關(guān)專利是CN200610020991. 5。然而，無論是PVD載體系統(tǒng)還是烷基糖苷載體系統(tǒng)的研究僅僅停留在體內(nèi)靶向性上，未有任何關(guān)于載體在腎臟特異性攝取機(jī)理研究、載體本身的安全性研究以及載體為基礎(chǔ)的前體藥物藥效學(xué)研究報(bào)道；低分子量殼聚糖是一系列聚合度不同的氨基酸組成的混合物，具有一定的血細(xì)胞毒性，不可注射使用。所以，尋求新的更加安全的腎靶向藥物載體是很必要的，同時只有闡明載體被腎臟特異性攝取的機(jī)理，才能為今后發(fā)展同類新型載體奠定科學(xué)基礎(chǔ)。在現(xiàn)已研究的各種腎靶向載體中，低分子量蛋白質(zhì)(LMWP)較為理想。分子量低于3000道爾頓的LMWP能被腎小球自由濾過并通過近端小管迅速吸收。LMWP被近端小管細(xì)胞內(nèi)吞后，經(jīng)內(nèi)吞體遷移至溶酶體。在溶酶體內(nèi)，LMWP被分解成小肽和單個氨基酸。研究表明約占注射劑量80%的LMWP (如溶菌酶、細(xì)胞色素C、抑肽酶等)最終被腎攝取。圍繞這方面的專利較多，如US6562371, US200321142, JP2001055343, CN200610020167. X。但低分子量蛋白質(zhì)如溶菌酶等存在免疫排斥反應(yīng)，影響血壓以及腎臟毒性的問題。人血清白蛋白是人血漿中的蛋白質(zhì)，因其具有安全無毒、無免疫原性、可生物降解、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，在臨床上應(yīng)用廣泛，常用于治療休克與燒傷，補(bǔ)充因手術(shù)、意外事故或大出血所致的血液丟失，也可以作為血漿增溶劑。 可見，HAS較溶菌酶具備更多的優(yōu)勢以及臨床應(yīng)用基礎(chǔ)，是理想的可注射用藥物載體。目前，關(guān)于人血清白蛋白的專利較多專利CN01805629.6公開了一種去除人血清白蛋白多聚體的方法；專利CN200610038790.8公開了人β干擾素與人血清白蛋白的融合蛋白的制備方法及產(chǎn)品；專利CN02813703. 5公開了從生產(chǎn)人血清白蛋白的宿主細(xì)胞的內(nèi)源血清白蛋白中純化人血清白蛋白的方法；專利CN201010561294. 7公開了一種重組人血清白蛋白的分離純化方法，等等。然而，關(guān)于人血清白蛋白或其多肽片段作為一種腎靶向藥物載體及應(yīng)用的專利尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于公開一種腎靶向藥物載體，它是將人血清白蛋白降解為具有一定氨基酸序列的多肽片段，具有如下通式
Λ
rlIll-Il
其中
A表示多肽片段，
m和η為正整數(shù)，I彡m，η彡585，表示多肽片段兩端氨基酸在人血清白蛋白序列中的位置。通過不同的降解方法，可將人血清白蛋白降解得到分子量大小在1000-60000之
間的多肽片段；通過體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，優(yōu)選心123、Α124_298、Α299_585的多肽片段；更優(yōu)選序列為A
299-585 的多肽片段。本發(fā)明的一個目的在于提供一種腎靶向藥物載體的制備方法，是將人血清白蛋白經(jīng)溴化氰降解、葡聚糖凝膠分離純化得到粗品、羧甲基纖維素進(jìn)一步分離純化制備而成。具體地說，包括以下步驟
(O溴化氰降解溴化氰和人血清白蛋白按質(zhì)量比I: I反應(yīng)，以70%甲酸水溶液為反應(yīng)介質(zhì)，4°C下反應(yīng)20_24h。(2)葡聚糖凝膠分離純化以葡聚糖凝膠S^hadex G-100為固定相，甲酸和甲酸銨緩沖系統(tǒng)為流動相，室溫下分離步驟(I)的降解產(chǎn)物，得到兩個粗品I和II。(3)羧甲基纖維素進(jìn)一步分離純化以羧甲基纖維素S^harose FF為固定相，磷酸鹽緩沖系統(tǒng)為流動相，以NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，室溫下將粗品I分離純化為多肽片段A299_585 ;將粗品II分離純化為多肽片段Ah23和A
124-298°上述三種多肽片段的分子量分別為A299_585 35000道爾頓；Ai_123 =15000-2000道爾頓；A124_298 =15000-2000 道爾頓。
進(jìn)一步優(yōu)選的方法包括
(O溴化氰降解溴化氰和人血清白蛋白按質(zhì)量比I: I反應(yīng)，以70%甲酸水溶液為反應(yīng)介質(zhì)，4°C下反應(yīng)20-24h。(2)葡聚糖凝膠分離純化以葡聚糖凝膠S^hadex G-100為固定相，O. 174 M甲酸和O. 026 M甲酸銨緩沖系統(tǒng)為流動相，pH=2. 86，室溫下分離得到兩個粗品I和II，分離曲線檢測波長為280 nm。分離純化結(jié)果見附圖I。(3)羧甲基纖維素進(jìn)一步分離純化以羧甲基纖維素為固定相，O. 005 M磷酸鹽緩沖系統(tǒng)為流動相，pH=6. 5，以I M NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，室溫下將粗品I分離純化為多肽片段A299-585，分離曲線檢測波長為280 nm;以羧甲基纖維素為固定相，O. 01 M磷酸鹽緩沖系統(tǒng)為流動相，pH=3. 25，以I M NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，室溫下將粗品II分離純化為多肽片段八1-123和仏24_298，分離曲線檢測波長為230 nm。分離純化結(jié)果見附圖2、附圖3。分離純化所得三個多肽片段經(jīng)透析、冷凍干燥即得。本發(fā)明的另一個目的在于證明人血清白蛋白多肽片段能夠特異性地蓄積在腎臟，具有良好的腎臟靶向性。具體涉及采用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記人血清白蛋白多肽片段進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，通過體內(nèi)分布證實(shí)多肽片段具有良好的腎靶向效率，并優(yōu)選出腎靶向效果最佳的片段。I.異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記人血清白蛋白多肽片段
取三種多肽片段凍干粉分別溶于碳酸鹽緩沖液；另取FITC溶于DMSO溶液中，混勻，滴加FITC溶液于多肽片段溶液中，4°C下避光攪拌反應(yīng)24 h。透析、冷凍干燥，即得三種標(biāo)記多肽片段。2.熒光標(biāo)記的多肽片段的體內(nèi)分布
取三種FITC標(biāo)記的多肽片段分別小鼠尾靜脈注射后，在15分鐘、30分鐘、60分鐘和120分鐘將小鼠處死，取心、肝、脾、肺、腎、腦，稱重，制成勻漿，經(jīng)過生物樣品處理后，用熒光分光光度計(jì)測定含量，計(jì)算出三種多肽片段在小鼠腎臟的蓄積率以及在每種組織中的含量分布，結(jié)果見附圖4-附圖7。說明人血清白蛋白多肽片段具有良好的腎靶向效率，并且片段A299-S85的腎祀向效果最佳。本發(fā)明的另一個目的還提供了腎靶向藥物載體作為治療、診斷急慢性腎臟疾病藥物的載體的應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明提供了一種具有良好腎靶向效果的新型多肽片段載體，為腎靶向藥物研究提供了新的思路和方向；人血清白蛋白多肽片段無免疫原性，可生物降解，生物相容性好，提高了腎靶向藥物的安全性和有效性，為臨床上急慢性腎臟疾病提供了新的治療途徑。


圖I.葡聚糖凝膠Sephadex G-100分離純化人血清白蛋白降解粗品的分離曲線圖 圖2.羧甲基纖維素從粗品I中分離純化得到多肽片段A299_585的分離曲線圖 圖3.羧甲基纖維素從粗品II中分離純化得到多肽片段4_123，A124_298的分離曲線圖 圖4.三種多肽片段在小鼠腎臟的蓄積率圖5.多肽片段Ah23在小鼠各組織中的含量分布圖 圖6.多肽片段仏24_298在小鼠各組織中的含量分布圖 圖7.多肽片段‘_585在小鼠各組織中的含量分布圖
具體實(shí)施例下面再結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明的腎靶向藥物載體，它不限制本發(fā)明，本發(fā)明的范圍要求由權(quán)利要求限定。實(shí)施例I :
多肽片段的制備
取I. O g人血清白蛋白(Sigma,純度彡96%, USA)溶解于4 ml純水中，再加入16 ml70%甲酸，混勻后，加入1.0 g CNBr，在4°C下攪拌反應(yīng)20-24h。多次純水透析除去反應(yīng)溶液中的雜質(zhì)離子，再使用PEG-6000將溶液濃縮至適當(dāng)體積。 以葡聚糖凝膠S印hadex G-100為固定相，O. 174 M甲酸和O. 026 M甲酸銨緩沖系統(tǒng)為流動相，pH=2. 86，25°C，流速為O. I ml/min，分離得到兩個多肽片段I和II，見附圖I ;以羧甲基纖維素為固定相，O. 005 M磷酸鹽緩沖系統(tǒng)為流動相，pH=6. 5，以I M NaCl進(jìn)行梯度洗脫，25°C，流速為1.0 ml/min，洗脫梯度為O M_0. 5 M，將片段I分離純化為多肽片段A299_585，見附圖2 ;以羧甲基纖維素為固定相，O. 01 M磷酸鹽緩沖系統(tǒng)為流動相，pH=3. 25，以I M NaCl進(jìn)行梯度洗脫，25°C，流速為I ml/min，洗脫梯度為O. 45 M-0. 7 M，將片段II分離純化為多肽片段仏_123和仏24_298，見附圖3。分離純化后得到的三個片段經(jīng)過多次純水透析除去溶液中雜質(zhì)離子，然后分別冷凍干燥，即得三種多肽片段。
實(shí)施例2
異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記人血清白蛋白多肽片段的制備方法及體內(nèi)分布研究精密稱取低分子量白蛋白凍干粉20 mg溶于10 ml碳酸鹽緩沖液(CBS，0. I Μ,ρΗ=9. 2)，另取20 mg FITC溶于2 ml DMSO溶液中，滴加O. 7 ml FITC溶液于白蛋白溶液中，4°C下避光攪拌反應(yīng)24 h，透析，冷凍干燥。取昆明種小鼠12只，雄性，重量在25-30 g之間，每3只一組，共4組。按照注射劑量50 mg/kg計(jì)算，尾靜脈注射FITC標(biāo)記的多肽片段，分別在15分鐘，30分鐘，60分鐘，120分鐘處死小鼠，取心、肝、脾、肺、腎、腦，稱重，并制備組織勻漿，經(jīng)過生物樣品處理后，用熒光分光光度計(jì)測定含量，計(jì)算三種多肽片段在小鼠腎臟的蓄積率以及在各組織中的含量分布，結(jié)果見附圖4-附圖7。結(jié)果證明，人血清白蛋白多肽片段是一種具有良好腎靶向性的藥物載體，其中，多肽片段A299_585的腎靶向效果最佳。
權(quán)利要求
1.一種腎靶向藥物載體，其特征是將人血清白蛋白降解為具有一定氨基酸序列的多肽片段，具有如下通式ΛrlIll-Il 其中 A表示多肽片段， m和η為正整數(shù)，I彡m，η彡585，表示多肽片段兩端氨基酸在人血清白蛋白序列中的位置。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的腎靶向藥物載體，其特征是分子量大小在1000-60000之間；it3 ^1_123、A124_298、A299-585 的多肽片段；更優(yōu)選序列為a299_585的多肽片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求1，2所述的腎靶向藥物載體，其特征是由人血清白蛋白經(jīng)溴化氰降解、葡聚糖凝膠分離純化得到粗品、羧甲基纖維素進(jìn)一步分離純化制備而成。
4.根據(jù)權(quán)利要求f3所述的腎靶向藥物載體的制備方法，包括如下步驟 (O溴化氰降解溴化氰和人血清白蛋白按質(zhì)量比I: I反應(yīng)，以70%甲酸水溶液為反應(yīng)介質(zhì)，4°C下反應(yīng)20-24h; (2)葡聚糖凝膠分離純化以葡聚糖凝膠SephadexG-100為固定相，甲酸和甲酸銨緩沖系統(tǒng)為流動相，室溫下分離步驟(I)的降解產(chǎn)物，得到兩個粗品I和II ; (3)羧甲基纖維素進(jìn)一步分離純化以羧甲基纖維素S^haroseFF為固定相，磷酸鹽緩沖系統(tǒng)為流動相，以NaCl鹽溶液進(jìn)行梯度洗脫，室溫下將粗品I分離純化為多肽片段A299_585 ;將粗品II分離純化為多肽片段Ah23和A 124-298 上述三種多肽片段的分子量分別為A299_585 35000道爾頓汸卜123 =15000-2000道爾頓;A124-298 :15000-2000 道爾頓。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的腎靶向藥物載體的制備方法，其特征是所述的步驟(2)和(3)中分離純化條件 (O分離得到兩個多肽片段I和II的色譜條件中，流動相甲酸和甲酸銨摩爾比為O.174 :0. 026，pH=2. 86，分離曲線檢測波長為280 nm ； (2)從多肽片段I中分離得到多肽片段A299_585的色譜條件中，磷酸鹽緩沖液濃度為O.005 M，pH=6. 5，NaCl溶液濃度為I M，分離曲線檢測波長為280 nm ； (3)從多肽片段II中分離得到多肽片段Aw23和A124_298的色譜條件中，磷酸鹽緩沖液濃度為O. 01 M，pH=3. 25，NaCl溶液濃度為I M，分離曲線檢測波長為230 nm。
6.上述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的腎靶向藥物載體可作為治療、診斷急慢性腎臟疾病藥物的載體的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種腎靶向藥物載體及應(yīng)用，具體涉及人血清白蛋白通過降解、分離純化得到的多肽片段，通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究證明多肽片段具有良好的腎臟靶向性。本發(fā)明制法簡單，工藝成熟，性能穩(wěn)定。其應(yīng)用可作為一種腎靶向藥物載體用于治療、診斷急慢性腎臟疾病領(lǐng)域。
文檔編號C07K1/02GK102793928SQ201210325919
公開日2012年11月28日 申請日期2012年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月6日
發(fā)明者袁志翔, 徐超群, 何夏凱, 譚鐳 申請人:四川省中醫(yī)藥科學(xué)院