專利名稱：一種從植物提取物中篩選甘油三酯酶抑制劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物篩選與評(píng)價(jià)方法領(lǐng)域，涉及一種從植物提取物中篩選甘油三酯酶抑制劑的方法。
背景技術(shù)：
甘油三酯是人體內(nèi)含量最多的脂類，脂肪組織中的甘油三酯在一系列脂肪酶的作用下，分解生成甘油和脂肪酸，這一過(guò)程稱為脂動(dòng)員。脂動(dòng)員生成的脂肪酸可釋放入血，與白蛋白結(jié)合形成脂酸白蛋白運(yùn)輸至其它組織被利用；甘油被運(yùn)輸?shù)礁闻K，被甘油激酶催化生成3-磷酸甘油，進(jìn)入糖酵解途徑分解或用于糖異生。在脂動(dòng)員過(guò)程中，催化由甘油三酯水解生成甘油二酯的甘油三酯酶是脂動(dòng)員的限速酶。若能獲得具有高效抑制劑抑制該酶的活性，就能有效降低糖尿病患者體內(nèi)血糖含量。
天然產(chǎn)物中含有豐富的具有生物活性的成分，是開發(fā)新藥候選化合物的巨大資源庫(kù)。但是目前針對(duì)天然藥物的開發(fā)并沒有形成如化學(xué)藥物開發(fā)那樣的規(guī)模，其中最大的技術(shù)難度在于天然產(chǎn)物中活性化合物的篩選效率太低。常規(guī)方法大都采用有機(jī)溶劑對(duì)天然產(chǎn)物進(jìn)行系統(tǒng)分離，制得的樣品需要干燥、稱量、溶解、配制、加樣等一系列步驟后才能進(jìn)行活性評(píng)價(jià)，存在耗時(shí)耗力等問(wèn)題。因此，開發(fā)針對(duì)特定酶靶標(biāo)活性化合物的快速分離與鑒定方法可以極大地提高天然產(chǎn)物中活性化合物發(fā)現(xiàn)的速度。目前，基于親和選擇的活性化合物富集技術(shù)在天然產(chǎn)物活性成分篩選中的應(yīng)用越來(lái)越多。這類方法包括親和超濾法、親和磁珠富集法、親和細(xì)胞膜色譜法等。根據(jù)所采用的靶標(biāo)固定方式不同，可將這些方法分為兩類溶液化酶和固定化酶。固定化酶的方法即采用各種不同介質(zhì)將靶標(biāo)蛋白或酶固定在其表面，從復(fù)雜混合樣品中分離活性化合物，再通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等手段分析固定介質(zhì)上吸附的活性化合物，從而實(shí)現(xiàn)化合物的快速發(fā)現(xiàn)。酶的固定化方法主要有吸附法、共價(jià)結(jié)合法、包埋法及交聯(lián)法四大類。其中吸附法應(yīng)用范圍較廣，包括物理吸附法和離子吸附法。其突出優(yōu)勢(shì)在于工藝簡(jiǎn)單，操作條件溫和；不易破壞酶分子的高級(jí)結(jié)構(gòu)以及活性中心的構(gòu)象，酶回收率較高；載體選擇范圍大且大多廉價(jià)易得；吸附過(guò)程還能達(dá)到酶純化的目的。物理吸附法主要以高吸附能力的非水溶性材料為載體，如硅藻土、分子篩、硅膠、多孔玻璃、氧化鋁、大孔吸附樹脂等。中空纖維材料具有良好的吸附性能，能夠?qū)袠?biāo)蛋白或酶吸附在其中，從而很有潛力成為新的固定介質(zhì)。然而，以往研究從未將中空纖維應(yīng)用于天然藥物中活性化合物的發(fā)現(xiàn)中。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種從植物提取物中篩選甘油三酯酶抑制劑的方法，使用該方法能快速篩選獲得植物提取物中具甘油三脂酶抑制活性的化合物。本發(fā)明的技術(shù)方案為
一種從植物提取物中篩選甘油三酯酶抑制劑的方法，包括利用吸附載體進(jìn)行酶的固定化，以及利用負(fù)載有酶的吸附載體從植物提取物中親和選擇分離出活性化合物，所述吸附載體為中空纖維。本發(fā)明中采用中空纖維作為吸附載體是因?yàn)橹锌绽w維的比表面積較大，能大大增加酶的吸附量，進(jìn)而提高篩選效率，且吸附過(guò)程不會(huì)對(duì)酶的活性產(chǎn)生影響。作為優(yōu)選，所述吸附載體為聚丙烯中空纖維。聚丙烯中空纖維材料價(jià)格便宜，操作過(guò)程中不易折斷損傷，使用方便，能夠降低篩選成本、提高篩選效率。優(yōu)選的聚丙烯中空纖維的規(guī)格為300 400 μ m內(nèi)徑，80 120 μ m壁厚，O. I
O.3μπι孔隙大小，40 60%孔隙率。
所述酶的固定化方法為(I)將中空纖維浸泡在乙醇中活化；(2)取出中空纖維用去離子水清洗；(3)活化好的中空纖維垂直放入酶溶液中，攪拌孵育。所述酶溶液為甘油三酯酶溶液，使用的溶劑為水或磷酸緩沖液。所述植物提取物的獲取方法為(I)收集植物組織，使用乙醇水溶液回流提取，濃縮提取液得到樣品Α，此步驟的乙醇水溶液中，乙醇的體積百分比濃度優(yōu)選70% ；(2)樣品A上樣于大孔樹脂，使用體積比呈梯度分布的乙醇水溶液洗脫，合并目標(biāo)洗脫液，濃縮得到樣品B;(3)樣品B上樣于陽(yáng)離子交換樹脂，使用體積比呈梯度分布的乙醇水溶液洗脫，合并目標(biāo)洗脫液，濃縮即得到植物提取物。作為優(yōu)選，所述大孔樹脂為DlOl大孔樹脂。作為優(yōu)選，所述陽(yáng)離子交換樹脂為732型陽(yáng)離子交換樹脂。為確保所述中空纖維能有效吸附甘油三酯酶，在活性化合物的親和選擇分離之前，要對(duì)吸附酶的中空纖維進(jìn)行吸附質(zhì)量考察，考察方法包括電鏡掃描、衰減全反射紅外光譜測(cè)定或X光電子能譜分析。以空白的中空纖維為對(duì)照，對(duì)吸附酶的中空纖維進(jìn)行吸附質(zhì)量考察時(shí)，作為一種實(shí)施方式，所述電鏡掃描能從掃描影像中直觀地考察甘油三酯酶的吸附情況。作為另一種實(shí)施方式，所述衰減全反射紅外光譜使用傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行測(cè)定。與常規(guī)的紅外光譜分析方法相比，衰減全反射分析不需要通過(guò)樣品信號(hào)，而是通過(guò)樣品表面的反射信號(hào)獲得樣品表層有機(jī)成分的結(jié)構(gòu)信息，能夠直接獲得一些特殊樣品(如纖維、塑料、橡膠等)的紅外光譜。作為第三種實(shí)施方式，所述X光電子能譜分析也是一種表面分析方法，該方法能提供樣品表面的元素含量與形態(tài)，這是因?yàn)楦鞣N原子、分子的軌道電子結(jié)合能是一定的，因此，通過(guò)對(duì)樣品產(chǎn)生的光子能量的測(cè)定，就可以了解樣品中元素的組成。同時(shí)，元素所處的化學(xué)環(huán)境不同，其結(jié)合能會(huì)有微小的差別，進(jìn)而引起化學(xué)位移的變化，因此，利用化學(xué)位移值就可以分析元素的化合價(jià)和存在形式。在確保甘油三酯酶已吸附到中空纖維上后，即可進(jìn)行活性化合物的親和選擇分離，其方法為
(I)取植物提取物水溶液，加入吸附酶的中空纖維，進(jìn)行孵育；(2)取出經(jīng)孵育的吸附酶的中空纖維，經(jīng)磷酸緩沖液清洗、乙腈水溶液洗脫后，收集洗脫液進(jìn)行活性成分的分析；(3)根據(jù)分析鑒定結(jié)果，采用制備液相色譜獲取活性化合物。將所述植物提取物水溶液和吸附酶的中空纖維在適宜條件下進(jìn)行孵育，植物提取物中的甘油三酯酶配體就與甘油三酯酶發(fā)生相互作用，被吸附在甘油三酯酶的表面，利用配體-受體間的親和作用力，就可從植物提取物中特異性地分離出能與甘油三酯酶結(jié)合的目標(biāo)化合物。對(duì)植物提取物水溶液和吸附酶的中空纖維進(jìn)行孵育時(shí)，作為優(yōu)選，所述孵育時(shí)間為10 60min，孵育溫度為15 37°C。 更優(yōu)選的，所述孵育時(shí)間為30min，孵育溫度為37°C。 用磷酸緩沖液對(duì)孵育后的中空纖維進(jìn)行清洗時(shí)，作為優(yōu)選，所述磷酸緩沖液的離子強(qiáng)度為50 IOOOmM,磷酸緩沖液的pH值為5. 6 8. O。更優(yōu)選的，所述磷酸緩沖液的離子強(qiáng)度為50mM，磷酸緩沖液的pH值為6. 8。對(duì)結(jié)合在吸附酶的中空纖維上的活性化合物進(jìn)行洗脫時(shí)，作為優(yōu)選，所述乙腈水溶液中乙腈的體積百分比濃度為10%。作為優(yōu)選，所述乙腈水溶液洗脫次數(shù)為I 3次，更優(yōu)選的，洗脫次數(shù)為3次。作為優(yōu)選，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)洗脫液進(jìn)行活性成分分析和分離。使用上述方法分離得到三個(gè)活性化合物，分別為槲皮素-3-0-阿拉伯糖基-(I — 2)-半乳糖苷、槲皮素-3-0- β -D-葡萄糖醛酸和山奈酚-3- β -O-D-葡萄糖醛酸；進(jìn)一步檢測(cè)這三個(gè)活性化合物對(duì)甘油三酯酶的抑制活性，獲得上述三個(gè)活性化合物對(duì)甘油三酯酶的半數(shù)抑制濃度分別為66. 7μΜ、94. OyM和43. 7 μ Μ，抑制效果較好，可被應(yīng)用于制備抗糖尿病藥物。本發(fā)明中的不同體積比濃度的乙醇和乙腈，如未作特殊說(shuō)明，所使用的溶劑均為水。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明提供的從植物提取物中篩選甘油三酯酶抑制劑的方法，運(yùn)用中空纖維作為吸附載體，快速篩選獲得了植物組織中具甘油三脂酶抑制活性的化合物，將先分離后篩選的傳統(tǒng)活性篩選模式改進(jìn)為先篩選鑒定后分離的新型活性篩選模式，大大減少了化合物制備分離的盲目性?？赏茝V應(yīng)用于天然藥物或中藥混合物中具有甘油三脂酶抑制活性的化合物的快速篩選。


圖I為空白中空纖維、吸附酶的中空纖維的衰減全反射紅外譜圖。圖2為吸附酶的中空纖維的掃描電鏡圖。圖3為基于中空纖維的植物提取物中甘油三酯酶抑制劑的篩選流程圖。圖4a為荷葉提取物的液相色譜圖。圖4b為荷葉提取物經(jīng)吸附甘油三酯酶的中空纖維篩選后洗脫物的液相色譜圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖，以荷葉提取物為例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。除荷葉提取物外，本發(fā)明也同樣適用于從其他植物提取物中篩選甘油三酯酶抑制劑。 I、吸附甘油三酯酶的中空纖維制備I)試劑及溶液配制豬胰腺甘油三酯酶(simga公司);聚丙烯中空纖維，規(guī)格內(nèi)徑335 μ m,壁厚100 μ m,孔隙O. 2 μ m(杭州恒濾膜技術(shù)工程有限公司)；
Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天公司)。2)吸附甘油三酯酶的中空纖維制備將50根6cm長(zhǎng)的聚丙烯中空纖維浸泡在100%乙醇中活化Ih后取出，用去離子水把附著的乙醇清洗干凈；將IOmL(O. lmg/mL)甘油三酯酶溶液加入到吸附容器里，將活化好的中空纖維垂直放入容器中，室溫下攪拌孵育30min !Bradford法測(cè)定孵育液中剩余的蛋白量，計(jì)算每根中空纖維上吸附的酶量。3)吸附酶的中空纖維質(zhì)量考察電鏡分析使用掃描式電子顯微鏡對(duì)空白中空纖維、吸附甘油三脂酶的中空纖維的表面分別進(jìn)行掃描成像，檢查中空纖維性狀，可見纖維呈中空狀，直徑約為350 μ m，表明中空纖維能將酶吸附其中。吸附酶的中空纖維掃描電鏡圖像如圖2所示。衰減全反射分析使用傅里葉變換紅外光譜儀，測(cè)定空白中空纖維、吸附酶的中空纖維的衰減全反射紅外光譜，測(cè)定結(jié)果如圖I所示。由圖可見，空白中空纖維(a)的衰減全反射紅外圖中在波數(shù)2800-3000^^1處出現(xiàn)聚丙烯的特征吸收峰；而吸附酶的中空纖維(b)的衰減全反射紅外圖中除聚丙烯的特征吸收峰外，還在波數(shù)1650CHT1處出現(xiàn)了酰胺鍵的特征吸收峰，由此表明，甘油三酯酶已吸附到中空纖維上。X光電子能譜分析使用X光電子能譜分析儀分析空白中空纖維和吸附甘油三酯酶的中空纖維的X光電子衍射圖譜。元素分析數(shù)據(jù)表明，甘油三酯酶吸附到中空纖維上后，碳元素的比例下降(82. 4%^ 69. 2% ),氧元素的比例升高(17. 6%^ 23. 9% ),氮元素(O —6.21%)和硫元素(0 — 0.7%)的比例上升。由此表明，甘油三酯酶已吸附到中空纖維上。2、基于中空纖維的篩選條件研究I)藥品、試劑及溶液配制豬胰腺甘油三酯酶、4-甲基傘形酮油酸酯(simga公司)；聚丙烯中空纖維，規(guī)格內(nèi)徑335 μ m,壁厚100 μ m,孔隙O. 2 μ m(杭州恒濾膜技術(shù)工程有限公司)；橙皮苷(上海融禾生物醫(yī)藥有限公司)。2)基于中空纖維的快速篩選條件優(yōu)化基于中空纖維的植物提取物中甘油三酯酶抑制劑的篩選流程如圖3所示。為提高活性化合物的篩選效率，采用已確定具有甘油三酯酶抑制活性的陽(yáng)性化合物橙皮苷考察該方法的篩選條件。篩選方法的一般流程為在2mL的離心管中，加入200 μ L的橙皮苷溶液(lmg/mL)和I. SmL的磷酸緩沖液(pH 7. 4)，垂直放入10根吸附甘油三酯酶的中空纖維，于一定溫度孵育一定時(shí)間后，吸出孵育液。加入ImL磷酸緩沖液清洗中空纖維1-3次，最后加入10%乙腈溶液ImL洗脫結(jié)合的活性化合物，每次振搖lOmin，再合并洗脫液進(jìn)行液相色譜_質(zhì)譜聯(lián)用分析。分別對(duì)上述篩選過(guò)程中的5個(gè)因素進(jìn)行考察，包括洗脫次數(shù)(1、2、3次)、孵育時(shí)間(10、20、30、45、60min)、磷酸緩沖液的離子強(qiáng)度(50、150、300、500、IOOOmM)、磷酸緩沖液的 pH 值(5·6、6·2、6·8、7·4、8·0)、孵育溫度(15°C、25°C、37°C )。 結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)3次洗脫，清洗液中已不含有橙皮苷，因此確定清洗次數(shù)為3次。當(dāng)磷酸緩沖液的PH值為6. 8時(shí)，洗脫液中橙皮苷的色譜峰面積最大，可見pH值為6. 8有利于甘油三酯酶與橙皮苷的結(jié)合。隨著離子強(qiáng)度從50mM增加到IOOOmM,洗脫出的橙皮苷峰面積逐漸減少，可見，離子強(qiáng)度低有利于甘油三酯酶與橙皮苷的結(jié)合，最終確定磷酸緩沖液的離子強(qiáng)度為50mM。孵育溫度為37°C對(duì)甘油三酯酶與橙皮苷的結(jié)合最有利。孵育時(shí)間從IOmin 增加到30min，洗脫出的橙皮苷峰面積也逐漸變大，繼續(xù)增加孵育時(shí)間至45min和60min，橙皮苷峰面積不再發(fā)生變化，說(shuō)明甘油三酯酶與橙皮苷的結(jié)合可能已經(jīng)達(dá)到飽和狀態(tài)。最終優(yōu)選的基于中空纖維的快速篩選條件為在2mL的離心管中，加入200 μ L的橙皮苷溶液(lmg/mL)和I. 8mL的磷酸緩沖液(pH 7. 4)，垂直放入10根吸附甘油三酯酶的中空纖維，于37°C孵育30min后，吸出孵育液。加入ImL 50mM磷酸緩沖液(pH 6. 8)清洗中空纖維3次，最后加入10%乙腈溶液ImL洗脫結(jié)合的活性化合物，取洗脫液進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析。3、荷葉提取物中具有甘油三酯酶抑制活性的化合物篩選I)獲取荷葉提取物取荷葉加70%乙醇回流提取2次，將提取液合并、濃縮，得到濃縮液A ;濃縮液A上樣于DlOl大孔樹脂，分別用水、60%乙醇、95%乙醇洗脫，棄去水洗脫液，將60%乙醇和95%乙醇洗脫液合并、濃縮，得到濃縮液B ;濃縮液B上樣于732型陽(yáng)離子交換樹脂，分別用水、50%乙醇、95%乙醇洗脫，將水和50%乙醇洗脫液合并、濃縮至干，得荷葉提取物。上述不同體積比濃度的乙醇，所采用的溶劑均為水。2)活性化合物親和選擇分離在2mL的離心管中，加入200 μ L的荷葉提取物水溶液(10mg/mL)和L 8mL的磷酸緩沖液(pH 7. 4)，垂直放入10根吸附酶的中空纖維，37°C孵育30min ;吸出孵育液，加入ImL 50mM磷酸緩沖液(pH 6. 8)清洗，共清洗3次；最后加入10%乙腈水溶液ImL洗脫結(jié)合化合物，振搖IOmin后，吸取洗脫液進(jìn)行液質(zhì)分析。3)活性成分分析使用液相色譜-質(zhì)譜對(duì)活性成分進(jìn)行分析。其中，液相色譜參數(shù)如下色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18 柱 250 X 4. 6mm, 5 μ m ;流動(dòng)相A為O. I %甲酸-7jC，流動(dòng)相B為乙腈；梯度洗脫程序如下0min,10% B ；60min, 50% B ；80min, 100% B ；流速為O. 5mL/min ;進(jìn)樣量20 μ L ;柱溫30°C ;檢測(cè)器二極管陣列檢測(cè)器；波長(zhǎng)掃描范圍190 400nm ;檢測(cè)波長(zhǎng)254nm。質(zhì)譜參數(shù)如下離子源電噴霧(ESI)源，正負(fù)離子掃描模式；質(zhì)量掃描范圍m/z 100-2000 ;碰撞氣高純氦；霧化氣高純氮；電噴霧電壓-4. 5kV ;鞘氣流速30arb ;輔助氣流速10arb ;毛細(xì)管溫度350°C ;毛細(xì)管電壓_15V。分析結(jié)果如圖4所示，荷葉提取物的液質(zhì)圖(負(fù)離子模式，圖4a)中共有10個(gè)峰，分別為槲皮素-3-0-阿拉伯糖基-(I — 2)-半乳糖苷、蘆丁、槲皮素-3-0-i3-D-葡萄糖醛酸、異鼠李素-3-0-β-D-蕓香糖苷、山奈酚-3-β-O-D-葡萄糖醛酸、異鼠李素-3-0-β -D-吡喃葡萄糖苷、異鼠李素-3-0-β -D-葡萄糖醛酸、香葉木素-7-葡萄糖苷、異鼠李素-7-0-β-D-葡萄糖醛酸、槲皮素(表I)。表I荷葉提取物的液相色譜-質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)
權(quán)利要求
1.一種從植物提取物中篩選甘油三酯酶抑制劑的方法，包括利用吸附載體進(jìn)行酶的固定化，以及利用負(fù)載有酶的吸附載體從植物提取物中親和選擇分離出活性化合物，其特征在于，所述吸附載體為中空纖維。
2.如權(quán)利要求I所述的從植物提取物中篩選甘油三酯酶抑制劑的方法，其特征在于，所述吸附載體為聚丙烯中空纖維。
3.如權(quán)利要求I所述的從植物提取物中篩選甘油三酯酶抑制劑的方法，其特征在于，所述酶的固定化方法為 (1)將中空纖維浸泡在乙醇中活化； (2)取出中空纖維用去離子水清洗； (3)活化好的中空纖維垂直放入酶溶液中，攪拌孵育。
4.如權(quán)利要求I所述的從植物提取物中篩選甘油三酯酶抑制劑的方法，其特征在于，所述活性化合物的親和選擇分離的方法為 (1)取植物提取物水溶液，加入吸附酶的中空纖維，進(jìn)行孵育； (2)取出經(jīng)孵育的吸附酶的中空纖維，經(jīng)磷酸緩沖液清洗、乙腈水溶液洗脫后，收集洗脫液進(jìn)行活性成分的分析； (3)根據(jù)分析鑒定結(jié)果，采用制備液相色譜獲取活性化合物。
5.如權(quán)利要求4所述的從植物提取物中篩選甘油三酯酶抑制劑的方法，其特征在于，所述孵育時(shí)間為10 60min，孵育溫度為15 37°C。
6.如權(quán)利要求5所述的從植物提取物中篩選甘油三酯酶抑制劑的方法，其特征在于，所述孵育時(shí)間為30min，孵育溫度為37°C。
7.如權(quán)利要求4所述的從植物提取物中篩選甘油三酯酶抑制劑的方法，其特征在于，所述磷酸緩沖液的離子強(qiáng)度為50 lOOOmM，磷酸緩沖液的pH值為5. 6 8. O。
8.如權(quán)利要求7所述的從植物提取物中篩選甘油三酯酶抑制劑的方法，其特征在于，所述磷酸緩沖液的離子強(qiáng)度為50mM，磷酸緩沖液的pH值為6. 8。
9.如權(quán)利要求4所述的從植物提取物中篩選甘油三酯酶抑制劑的方法，其特征在于，所述乙腈水溶液中乙腈的體積百分比濃度為10%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從植物提取物中篩選甘油三酯酶抑制劑的方法，包括利用吸附載體進(jìn)行酶的固定化，以及利用負(fù)載有酶的吸附載體從植物提取物中親和選擇分離出活性化合物。本發(fā)明運(yùn)用中空纖維作為吸附載體，將先分離后篩選的傳統(tǒng)活性篩選模式改進(jìn)為先篩選鑒定后分離的新型活性篩選模式，大大減少了化合物制備分離的盲目性，可推廣應(yīng)用于天然產(chǎn)物或中藥混合物中具有甘油三脂酶抑制活性的化合物的快速篩選。
文檔編號(hào)C07H17/07GK102824756SQ20121032803
公開日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2012年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月7日
發(fā)明者程翼宇, 王毅 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)