嗜熱吸水鏈霉菌cDNA文庫構(gòu)建及兩種大棚肺致病抗原多肽的表達和表達方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種嗜熱吸水鏈霉菌cDNA文庫構(gòu)建兩種大棚肺致病抗原多肽的表達和表達方法，所要解決的問題是：構(gòu)建了嗜熱吸水鏈霉菌cDNA文庫，從中篩選具有毒力作用的兩種大棚肺致病基因進行體外克隆并誘導(dǎo)兩種大棚肺致病抗原多肽的表達。本發(fā)明的要點是：得到有義序列978個，獲得單一基因347個，其中2段基因分別與胸膜肺炎放線菌外膜蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白B的同源性為51%和42%，其開放閱讀框長度分別為1554bp和726bp，分別編碼517和241個氨基酸。本發(fā)明的用途是：從嗜熱吸水鏈霉菌cDNA文庫中篩選具有毒力作用的兩種致病基因進行體外克隆并誘導(dǎo)兩種大棚肺致病抗原多肽的表達，為后續(xù)開發(fā)新的農(nóng)民肺診斷方法提供理論和實踐依據(jù)。
【專利說明】嗜熱吸水鏈霉菌cDNA文庫構(gòu)建及兩種大棚肺致病抗原多肽的表達和表達方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，具體涉及到嗜熱吸水鏈霉菌cDNA文庫的構(gòu)建、表達序列標簽(EST)測序，通過生物信息手段獲得引起機體過敏反應(yīng)的兩種致病基因，篩選具有毒力作用的兩種致病基因進行體外克隆并誘導(dǎo)兩種大棚肺致病抗原多肽的表達，為后續(xù)開發(fā)新的農(nóng)民肺診斷方法提供理論和實踐依據(jù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 1.農(nóng)民肺疾病發(fā)病及檢測現(xiàn)狀
農(nóng)民肺(Farmer’ s lung disease)是因吸入具有抗原性的有機粉塵(如霉變枯草或其他霉變植物粉塵等)而引起一種外源性變態(tài)反應(yīng)性肺泡炎，通常在暴露于各種發(fā)霉植物的農(nóng)民中發(fā)病，故稱之為“農(nóng)民肺”。其主要臨床表現(xiàn)為咳嗽、呼吸困難、乏力、全身肌肉酸痛等，并可引發(fā)不同程度的心、肺功能障礙，重癥患者甚至可因呼吸衰竭或心力衰竭而死亡。農(nóng)民肺已經(jīng)成為一種嚴重妨礙廣大農(nóng)民健康、影響勞動力的職業(yè)病，應(yīng)給予高度重視。大棚作業(yè)農(nóng)民肺一一簡稱“大棚肺”，即為暴露于溫室大棚環(huán)境內(nèi)的一種農(nóng)民肺，由于大棚種植方式不受氣候因素的影響，且能有效提高土地利用率、增加土地產(chǎn)值、提高農(nóng)民收入，在農(nóng)村地區(qū)頗受農(nóng)民的歡迎，已經(jīng)成為我國農(nóng)業(yè)經(jīng)濟的重要組成部分，但與此同時，大棚肺患病率與日俱增，對我國東北部分地區(qū)從事蔬菜、花卉、蘑菇大棚作業(yè)農(nóng)民的大棚肺流行病學(xué)進行調(diào)查，其結(jié)果顯示:我國東北地區(qū)大棚肺的患病率約為5.7%，其患病與多種因素有關(guān)。考慮到我國龐大的大棚從業(yè)農(nóng)民數(shù)量，大棚肺已成為威脅大棚從業(yè)農(nóng)民呼吸系統(tǒng)的主要疾病之一。
[0003]農(nóng)民肺按病理改變可分為支氣管血管周圍單核細胞浸潤的急性期、肉芽腫形成的亞急性期、最終發(fā)展成為肺纖維化病變的慢性持續(xù)期。急性期、亞急性期大棚肺臨床癥狀無特異性，需結(jié)合病史以及短時間內(nèi)重復(fù)性進行血清生化學(xué)、肺功能、CT等檢查才能確診。因基層醫(yī)院醫(yī)生對大棚肺認知不足，常被誤診為普通感冒、哮喘等延誤了最佳治療時機，導(dǎo)致大棚肺患者反復(fù)入院，診療成本增加，加重了患病農(nóng)民的經(jīng)濟負擔和相應(yīng)的社會負擔。因此，臨床上迫切需要一種快速、敏感、特異的用于大棚肺急性期、亞急性期的快速篩查及輔助診斷的檢查方法，做到大棚肺的早期防治，解決患大棚肺農(nóng)民“看病難、看病貴”的問題，減少大棚肺的患病率。
[0004]2.cDNA文庫的構(gòu)建及嗜熱吸水鏈霉菌在農(nóng)民肺疾病診斷治療中的重要作用
從1976年Hofstetter成功的構(gòu)建了第一個cDNA文庫以來，cDNA文庫已成為研究功能基因組學(xué)的基本手段之一，通過構(gòu)建cDNA文庫不僅可保護瀕危珍惜生物資源，通過對遺傳信息的功能注釋可以對農(nóng)作物進行遺傳改良、對家畜進行品種優(yōu)化，也是分析真菌基因表達圖譜、功能和結(jié)構(gòu)的重要資源，同時通過構(gòu)建腫瘤組織的cDNA文庫并獲得大量的相關(guān)腫瘤抗原，將為腫瘤的治療提供新的思路。全長cDNA文庫的構(gòu)建、測序和功能注釋是了解生物體結(jié)構(gòu)和功能的重要方法之一，有助于鑒定其基因組序列中的外顯子及內(nèi)含子的邊界，可以從cDNA文庫中篩選到所需的目的基因，并直接用于該目的基因的表達。
[0005]引起農(nóng)民肺的病原體主要是嗜熱放線菌，其中嗜熱吸水鏈霉菌是我國農(nóng)民肺的主要病原菌，放線菌孢子作為一種外源性物質(zhì)具有抗原性，被患者吸入體內(nèi)后引發(fā)免疫反應(yīng)，當再次吸入抗原后，抗原抗體在體內(nèi)形成免疫復(fù)合物并沉積于肺部，引起炎癥反應(yīng)，放線菌表面特異性抗原可能是引起農(nóng)民肺的重要因素之一，同時，機體過敏反應(yīng)可能與菌體表面致毒性物質(zhì)有較大關(guān)系。我們通過構(gòu)建嗜熱吸水鏈霉菌的cDNA文庫，通過生物信息手段獲得引起機體過敏反應(yīng)的兩種致病基因，并將該致病基因進行體外表達，以期為農(nóng)民肺的血清學(xué)檢驗奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明目的是:構(gòu)建嗜熱吸水鏈霉菌cDNA文庫及兩種大棚肺致病抗原多肽的表達和表達方法。
[0007]本發(fā)明技術(shù)方案的理論基礎(chǔ):
(I)引起農(nóng)民肺的病原體主要是嗜熱放線菌，其中嗜熱吸水鏈霉菌是我國農(nóng)民肺的主要病原菌。
[0008](2)cDNA文庫的構(gòu)建、測序和功能注釋是了解生物體結(jié)構(gòu)和功能的重要方法之一，高質(zhì)量的cDNA文庫在生物保護、遺傳育種、病原診斷及腫瘤治療等方面起有重要作用。
[0009]本發(fā)明的技術(shù)方案是:
構(gòu)建的嗜熱吸水鏈霉菌cDNA文庫是，得到有義序列978個，獲得單一基因347個，其中2段基因中的一段基因與胸膜肺炎放線菌外膜蛋白的同源性為51%，其開放閱讀框(ORF)長度為1554 bp和，編碼517個氨基酸；另一段基因與轉(zhuǎn)鐵蛋白B的同源性為42%，其開放閱讀框(ORF)長度為726 bp，編碼241個氨基酸。
[0010]所說的從中篩選出具有毒力作用的基因進行體外克隆并誘導(dǎo)表達是，將所說的2段基因亞克隆入原核表達載體中，IPTG誘導(dǎo)表達產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量分別為63 000和30000多肽。
[0011]嗜熱吸水鏈霉菌cDNA文庫構(gòu)建及兩種大棚肺致病抗原多肽的表達和表達方法包括下列步驟是:
1、嗜熱吸水鏈霉菌CDNA文庫的構(gòu)建
采用TRIZOL進行嗜熱吸水鏈霉菌總RNA的提取并經(jīng)01igoteXTMmRNA純化試劑盒純化為mRNA ;利用多聚腺嘌呤脫氧核苷(PolyA)聚合酶進行3’末端加尾，按照SMART? cDNA文庫構(gòu)建試劑盒說明書合成雙鏈cDNA ;產(chǎn)物經(jīng)蛋白酶K處理后用sfil酶切，過吸附柱CHROMASPIN-400進行分級，分離后的cDNA連入(λ TriplEx2)載體中，噬菌體包裝蛋白進行包裝構(gòu)成cDNA原始文庫并以大腸桿菌XL-1 Blue為受體菌擴增文庫。
[0012]2、cDNA文庫質(zhì)量及插入片段鑒定
將原始及擴增文庫稀釋成不同倍數(shù)于溶菌肉湯(LB)平板上培養(yǎng)過夜；文庫滴度(PFU/ml) =噬菌斑數(shù)X稀釋倍數(shù)XlO3/所 用稀釋文庫液體積(μ?);向噬菌體與大腸桿菌XLl-Blue混合液的上層瓊脂中加入異丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)和5-溴-4氯-3吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)培養(yǎng)過夜，進行藍白斑篩選，重組率(％)=白斑/ (白斑+藍斑);根據(jù)λ TriplEx2多克隆位點序列設(shè)計引物(5，端:5’ -GCCATTGTGTTGGTACCC-3’，3’端:5’ -TAATACGACTGACTATAGGGC-3’)，將LB/四環(huán)素瓊脂平板平均分成8個扇形區(qū)域，每個區(qū)域選取3個共24個獨立的噬菌斑進行聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)鑒定；反應(yīng)結(jié)束后取10 μ?產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。
[0013]3、EST測序及序列分析
將構(gòu)建好的啫熱吸水鏈霉菌cDNA文庫中的全部克隆進行編號，取前1020編號的克隆，提取質(zhì)粒，PCR鑒定，將含插入片段的克隆委托生工生物工程(上海)有限公司進行5’端測序，測序引物為質(zhì)粒通用引物；對獲得的表達序列標簽(EST)序列按照以下步驟進行分析，利用Cross match及repeat masker軟件去除載體片段、短于100 bp的序列及污染序列，得到高質(zhì)量的EST數(shù)據(jù)集；利用聚類比對工具對以上數(shù)據(jù)進行聚類分析，降低數(shù)據(jù)冗余性；使用Phrap軟件對聚類后的集群進行拼接，得到一致性序列；將得到的一致性序列與SwissProt數(shù)據(jù)庫進行同源比對、功能注釋，根據(jù)功能注釋在基因功能預(yù)測(GO)分類數(shù)據(jù)庫中進行功能分類描述；利用美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站上的相似性比較工具(http://blast.ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi),對于相似度可靠性評價值(E 值)<
0.1，同源性>30%的基因提取注釋信息，進一步利用DNAMAN6.0軟件進行氨基酸翻譯及序列比對，從中篩選引起機體過敏反應(yīng)的兩種致病基因。
[0014]4、目的基因的體外表達
針對目的基因設(shè)計轉(zhuǎn)鐵蛋白B引物，上游引物:CGAGCTCGCATGCCGCCCCCGTGG，下游弓丨物:TTGCGGCCGC AATCAAAGGCAAGAAAAGTGG ;外膜蛋白引物，上游引物:CGGATCCGATGGCCATTGGCGAACATCG,下游引物:TTGCGGCCGCAATCACGTCCGGATCC ;構(gòu)建表達載體，PCR擴增目的基因，雙酶切回收目的片段連接入pET-28a載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，PCR鑒定重組子，挑取含有目的片段的單克隆測序；將陽性重組子轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)大腸桿菌并接種于含卡那霉素的LB平板培養(yǎng)過夜；挑取活化的單菌落在LB液體培養(yǎng)基中擴增培養(yǎng)，600 nm處吸光度值達1.5左右時加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度達I mmol/L,誘導(dǎo)4 h ;超聲波破碎菌體,離心收集上清,混入上樣緩沖液,沸水浴加熱5 min,進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后，考馬斯亮藍G250染色，冰醋酸脫色后，凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。
[0015]本發(fā)明的有益效果:
1.cDNA文庫質(zhì)量及插入片段長度分析
經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，合成的雙鏈DNA彌散范圍為250~2000 bp。原始cDNA文庫及擴增文庫滴度分別為5.6 X IO5 PFU/ml和6.2 X IO5 PFU/ml。藍白斑篩選法計算得到文庫的重組率為96.3%。構(gòu)建原始cDNA文庫后隨機挑選24個單克隆進行PCR檢測，結(jié)果顯示，所挑取克隆均含有重組片段，其大小為500~4000 bp。
[0016]2.嗜熱吸水鏈霉菌cDNA文庫的EST序列分析
1020個克隆的序列已測定完成，得到有義序列978個，長度為500~2000 bp，平均為495 bp，對其進行聚類分析及拼接，獲得347個單一基因，分別與美國國立生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站的核酸序列及SwissPiOt蛋白數(shù)據(jù)庫進行同源比對(E值〈0.1)，相似度高于30%者提取注釋信息，同時進行基因功能預(yù)測(表1)。對獲得的EST序列進行功能分類，發(fā)現(xiàn)有2段基因與報道的豬胸膜肺炎放線菌外膜蛋白及轉(zhuǎn)鐵蛋白B具有較高的同源性，推測其可能與嗜熱吸水鏈霉菌引起的免疫反應(yīng)有關(guān)。利用DNAMAN6.0軟件將這2條基因翻譯成2條完整的氨基酸序列，并分別定名為ST-omlA和ST-tbpB。其開放閱讀框長度分別為1554 bp和726 bp，分別編碼517和241個氨基酸，序列分析結(jié)果分別與胸膜肺炎放線桿菌外膜蛋白(GenBank 登錄號:AY278560.1)以及轉(zhuǎn)鐵蛋白(GenBank 登錄號:GQ465206.1，GQ465204.1，GQ465205.1)的同源性為51%和42%。
[0017]表1熱吸水鏈霉菌EST序列GO分類結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種構(gòu)建的嗜熱吸水鏈霉菌CDNA文庫，其特征是:得到有義序列978個，獲得單一基因347個，其中2段基因中的一段基因與胸膜肺炎放線菌外膜蛋白的同源性為51%，其開放閱讀框長度為1554 bp和，編碼517個氨基酸；另一段基因與轉(zhuǎn)鐵蛋白B的同源性為42%，其開放閱讀框長度為726 bp，編碼241個氨基酸。
2.從權(quán)利要求1所述的構(gòu)建的嗜熱吸水鏈霉菌cDNA文庫中篩選出兩種大棚肺致病抗原多肽的表達，其特征是:將所說的2段基因亞克隆入原核表達載體中，IPTG誘導(dǎo)表達產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量分別為63 OOO和30 000多肽。
3.嗜熱吸水鏈霉菌cDNA文庫構(gòu)建兩種大棚肺致病抗原多肽的表達方法，其特征是: (1)嗜熱吸水鏈霉菌cDNA文庫的構(gòu)建 采用TRIZOL進行嗜熱吸水鏈霉菌總RNA的提取并經(jīng)01igoteXTMmRNA純化試劑盒純化為mRNA;利用多聚腺嘌呤脫氧核苷(PolyA)聚合酶進行3’末端加尾，按照SMART? cDNA文庫構(gòu)建試劑盒說明書合成雙鏈cDNA ;產(chǎn)物經(jīng)蛋白酶K處理后用sfil酶切，過吸附柱CHROMASPIN-400進行分級，分離后的cDNA連入λ TriplEx2載體中，噬菌體包裝蛋白進行包裝構(gòu)成cDNA原始文庫并以大腸桿菌XL-1 Blue為受體菌擴增文庫； (2)cDNA文庫質(zhì)量及插入片段鑒定 將原始及擴增文庫稀釋成不同倍數(shù)于溶菌肉湯平板上培養(yǎng)過夜；文庫滴度PFU/ml=噬菌斑數(shù)X稀釋倍數(shù)X IO3/所用稀釋文庫液體積μ? ;向噬菌體與大腸桿菌XLl-Blue混合液的上層瓊脂中加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和5-溴-4氯-3吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)培養(yǎng)過夜，進行藍白斑篩選，重組率(％)=白斑/ (白斑+藍斑);根據(jù)λ TriplEx2多克隆位點序列設(shè)計引物(5，端:5’ -GCCATTGTGTTGGTACCC-3’，3’端:5’ -TAATACGACTGACTATAGGGC-3’)，將LB/四環(huán)素瓊脂平板平均分成8個扇形區(qū)域，每個區(qū)域選取3個共24個獨立的噬菌斑進行聚合酶鏈式反應(yīng)鑒定；反應(yīng)結(jié)束后取10 μ?產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳； (3)EST測序及序列分析 將構(gòu)建好的啫熱吸水鏈霉菌cDNA文庫中的全部克隆進行編號，取前1020編號的克隆，提取質(zhì)粒，PCR鑒定，將含插入片段的克隆委托生工生物工程(上海)有限公司進行5’端測序，測序引物為質(zhì)粒通用引物；對獲得的表達序列標簽EST序列按照以下步驟進行分析，利用Cross match及repeat masker軟件去除載體片段、短于100 bp的序列及污染序列,得到高質(zhì)量的EST數(shù)據(jù)集；利用聚類比對工具對以上數(shù)據(jù)進行聚類分析，降低數(shù)據(jù)冗余性；使用Phrap軟件對聚類后的集群進行拼接，得到一致性序列；將得到的一致性序列與SwissPiOt數(shù)據(jù)庫進行同源比對、功能注釋，根據(jù)功能注釋在基因功能預(yù)測GO分類數(shù)據(jù)庫中進行功能分類描述；利用美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站上的相似性比較工具，對于相似度可靠性評價值〈0.1，同源性>30%的基因提取注釋信息，進一步利用DNAMAN6.0軟件進行氨基酸翻譯及序列比對，從中篩選出引起機體過敏反應(yīng)的兩種致病基因； (4)目的基因的體外表達 針對目的基因設(shè)計轉(zhuǎn)鐵蛋白B引物，上游引物:CGAGCTCGCATGCCGCCCCCGTGG，下游弓丨物:TTGCGGCCGCAATCAAAGGCAAGAAAAGTGG ;外膜蛋白引物，上游引物:CGGATCCGATGGCCATTGGCGAACATCG,下游引物:TTGCGGCCGCAATCACGTCCGGATCC ;構(gòu)建表達載體，PCR擴增目的基因，雙酶切回收目的片段連接入pET-28a載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，PCR鑒定重組子，挑取含有目的片段的單克隆測序；將陽性重組子轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)大腸桿菌并接種于含卡那霉素的LB平板培養(yǎng)過夜；挑取活化的單菌落在LB液體培養(yǎng)基中擴增培養(yǎng)，600 nm處吸光度值達1.5左右時加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度達1 mmol/L,誘導(dǎo)4 h ;超聲波破碎菌體,離心收集上清,混入上樣緩沖液,沸水浴加熱5 min,進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后，考馬斯亮藍G250染色，冰醋酸脫色后，凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。
【文檔編號】C07K14/36GK103484942SQ201210349127
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2012年9月20日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月20日
【發(fā)明者】王笑歌, 王玲玲, 劉朔 申請人:中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院