專利名稱：一種合成利拉魯肽的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥合成領域，具體涉及一種合成利拉魯肽的方法。
背景技術：
利拉魯肽，英文名為Liraglutide，是丹麥諾和諾德公司研制出的一種治療II型糖尿病的藥物。利拉魯肽是一種人胰高糖素樣肽-I (GLP-I)類似物，其作為GLP-I受體激動劑能起到良好的降低血糖作用，肽序如下NH2-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-GIn-Ala-Ala-Lys (N- ε - (N- a -Palmitoyl-L- Y -glutamyl ))-Glu-Phe-IIe-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-COOH利拉魯肽與天然GLP-I分子結構相比有一個氨基酸差異，并增加了一個16碳棕櫚·酰脂肪酸側鏈，與天然人GLP-I有95%同源性。并且由于脂肪酸側鏈的存在，其分子不易被DPP-IV降解，并能與白蛋白結合因而有較高的代謝穩(wěn)定性。在利拉魯肽的現(xiàn)有合成方法中，諾和諾德公司主要是通過基因重組技術，利用酵母生產利拉魯肽，但是國內無法得到酵母菌種進行生產。專利US6268343B1、US6458924B2以及文獻 “Journal of Medicinal Chemistry 43,1664-1669, 2000” 均公開了利用中間體GLP-I (7-37) -OH和N° -alkanoyl_Glu (ONSu) -OtBu來制備利拉魯肽的方法，但是這三種現(xiàn)有技術中，中間體GLP-1 (7-37) -OH均需要反相HPLC純化，再在液相條件下與Na-alkanoyl-Glu (ONSu) -OtBu反應，并且由于GLP-1 (7-37) -OH N端未保護以及側鏈保護基全部脫除，會導致產生許多雜質，難以純化，操作繁瑣，周期長，廢液多，不利于環(huán)保，并且兩步純化，需花費大量乙腈，成本高昂，不利于大規(guī)模生產等。中國專利CN102286092A公開了一種全固相合成方法，采用2-CTC樹脂或王樹脂，按照利拉魯肽肽序逐個偶聯(lián)氨基酸，最后經過反向純化得到利拉魯肽，其不需要兩步純化而且雜質較少，優(yōu)于上述幾種現(xiàn)有制備方法。但是，這種方法需要逐個偶聯(lián)氨基酸，合成周期長，總收率較低，僅為15%左右(參見CN102286092A實施例12-14)，仍需要進一步提高。

發(fā)明內容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種合成利拉魯肽的方法，使得本發(fā)明所述方法能夠提高其總收率。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案一種合成利拉魯肽的方法，包括以下步驟步驟I、固相合成在SEQ ID NO: I所示氨基酸序列N端、His側鏈上以及Glu側鏈上偶聯(lián)有保護基的多肽片段I ;固相合成在SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列N端、Thr側鏈上、Ser側鏈上以及Asp側鏈上偶聯(lián)有保護基的多肽片段2 ；固相合成在SEQ ID NO: 3所示氨基酸序列N端、Ser側鏈上、Tyr側鏈上以及Glu側鏈上偶聯(lián)有保護基的多肽片段3 ；固相合成在SEQ ID NO: 4所示氨基酸序列N端、Gln側鏈上、Glu側鏈上偶聯(lián)有保護基以及在Lys側鏈上偶聯(lián)有Na-Palmitoyl-L- y -glutamyl-OtBu的多肽片段4 ；固相合成在SEQ ID NO: 5所示氨基酸序列C端偶聯(lián)有王樹脂或2-CTC樹脂以及在Trp側鏈上和Arg側鏈上偶聯(lián)有保護基的多肽片段5 ；步驟2、將多肽片段5的N端和多肽片段4的C端偶聯(lián)，偶聯(lián)后脫除多肽片段4的N端保護基，得到肽樹脂I ;步驟3、將多肽片段3的C端和肽樹脂I的N端偶聯(lián)，偶聯(lián)后脫除多肽片段3的N端保護基，得到肽樹脂II ；步驟4、將多肽片段2的C端和肽樹脂II的N端偶聯(lián)，偶聯(lián)后脫除多肽片段2的N端保護基，得到肽樹脂III ； 步驟5、將多肽片段I的C端和肽樹脂III的N端偶聯(lián)，得到利拉魯肽樹脂；步驟6、利拉魯肽樹脂裂解脫除C端樹脂和所有保護基得到利拉魯肽粗品，粗品純化后即得利拉魯肽。其中，步驟I所述固相載體為樹脂固相載體，更優(yōu)選為2-CTC樹脂。利拉魯肽主鏈氨基酸有31個，采用片段方法進行合成存在很多種形式，但只有合適的片段方法才能有利于提高利拉魯肽的總收率。為此，申請人根據長期的試驗研究以及氨基酸消旋情況，提出了本發(fā)明所述方法來制備利拉魯肽，提高了總收率。在本發(fā)明所述方法中，首先按照利拉魯肽主鏈肽序分成5個片段，分別先合成這5個片段，然后再將5個片段逐步偶聯(lián)獲得利拉魯肽。以利拉魯肽主鏈N端到C端的氨基酸順序編號，如下式NH2-Hisl-Ala2-Glu3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Valio-Ser11-Ser12-Tyr13-Leu14-G1u15-G1 Y16-Gln17-Ala18-Ala19-LyS20 (N- ε - (N- a -Palmitoyl-L- Y -glutamyl)) -Glu21-Ph
e22_Ile23_Ala24_Trp25_Leu26_Val27_Arg28_Gly29_Arg30_Gly31_co()HSEQ ID NO: I所示氨基酸序列即為上式中編號1_4的多肽序列，SEQ ID N0:2所示氨基酸序列即為上式中編號5-10的多肽序列，SEQ ID N0:3所示氨基酸序列即為上式中編號11-16的多肽序列，SEQ ID N0:4所示氨基酸序列即為上式中編號17-24的多肽序列，SEQ ID N0:5所示氨基酸序列即為上式中編號25-31的多肽序列。本發(fā)明在步驟I中固相合成的多肽片段I是在SEQ ID NO: I所示氨基酸序列基礎上，在其N端、His側鏈上以及Glu側鏈上分別偶聯(lián)保護基；固相合成的多肽片段2是在SEQID NO: 2所示氨基酸序列基礎上，在其N端、Thr側鏈上、Ser側鏈上以及Asp側鏈上分別偶聯(lián)保護基；固相合成的多肽片段3是在SEQ ID NO: 3所示氨基酸序列基礎上，在其N端、Ser側鏈上、Tyr側鏈上以及Glu側鏈上分別偶聯(lián)保護基；固相合成的多肽片段4是在SEQID NO:4所示氨基酸序列基礎上，在其N端、Gln側鏈上、Glu側鏈上分別偶聯(lián)保護基以及在其Lys側鏈上偶聯(lián)有Na-Palmitoyl-L-Y-glutamyl-OtBu (OtBu為谷氨酸上α羧基的保護基)；固相合成的多肽片段5是在SEQ ID NO: 5所示氨基酸序列基礎上，在其C端偶聯(lián)有王樹脂或2-CTC樹脂以及在Trp側鏈上和Arg側鏈上分別偶聯(lián)保護基。本發(fā)明所述保護基是在氨基酸合成領域常用的保護氨基酸主鏈以及側鏈上氨基、羧基等干擾合成的基團的保護基團，防止氨基、羧基等在制備目標產物過程中發(fā)生反應，生成雜質，對于本發(fā)明中需要保護側鏈的氨基酸來說，本領域技術人員公知其側鏈結構以及知曉采用常用保護基來保護氨基酸側鏈上的氨基、羧基等基團，作為優(yōu)選，本發(fā)明通過Trt保護基保護組氨酸、谷氨酰胺的側鏈；通過OtBu保護基保護谷氨酸、天冬氨酸的側鏈；通過tBu保護基保護蘇氨酸、絲氨酸、酪氨酸的側鏈；通過Boc保護基保護色氨酸的側鏈；通過Pdf保護基保護精氨酸的側鏈。此外，在本發(fā)明所述方法涉及的氨基酸中，除組氨酸外，其余氨基酸N端均優(yōu)選通過Fmoc保護基進行保護，而組氨酸優(yōu)選通過Boc保護基進行保護。作為優(yōu)選方案，步驟I所述固相合成多肽片段I具體為將N端偶聯(lián)有Fmoc保護基的甘氨酸(Fmoc-Gly-OH)溶解并活化，與固相載體偶聯(lián)后脫Fmoc保護基得到H-Gly-固相載體，然后按照SEQ ID NO: I所示氨基酸序列C端到N端的順序，依次逐個將N端偶聯(lián)有Fmoc保護基以及側鏈偶聯(lián)有OtBu保護基的谷氨酸(Fmoc-Glu (OtBu) -0H)>N端偶聯(lián)有Fmoc保護基的丙氨酸(Fmoc-Ala_OH)、N端偶聯(lián)有Boc保護基以及側鏈偶聯(lián)有Trt保護基的組氨酸(Fmoc-His (Trt) -0H)進行延伸偶聯(lián)，偶聯(lián)后 裂解脫除固相載體得到多肽片段I (Boc-His (Trt)-Ala-Glu (OtBu)-Gly-ΟΗ)。作為優(yōu)選方案，步驟I所述固相合成多肽片段2具體為將N端偶聯(lián)有Fmoc保護基的甘氨酸(Fmoc-Val-OH)溶解并活化，與固相載體偶聯(lián)后脫Fmoc保護基得到H-Val-固相載體，然后按照SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列C端到N端的順序，依次逐個將N端偶聯(lián)有Fmoc保護基以及側鏈偶聯(lián)有OtBu保護基的天冬氨酸(Fmoc-Asp (OtBu) -0H)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護基以及側鏈偶聯(lián)有tBu保護基的絲氨酸(Fmoc-Ser (tBu) -0H)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護基以及側鏈偶聯(lián)有tBu保護基的蘇氨酸(Fmoc-ThrC tBu)-0H)>N端偶聯(lián)有Fmoc保護基的苯丙氨酸(Fmoc-Phe-OH)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護基以及側鏈偶聯(lián)有tBu保護基的蘇氨酸(Fmoc-Thr (tBu) -0H)進行延伸偶聯(lián)，偶聯(lián)后裂解脫除固相載體得到多肽片段 2(Fmoc_Thr (tBu) -Phe-Thr (tBu) -Ser (tBu) -Asp (OtBu) -Val_0H)ο作為優(yōu)選方案，步驟I所述固相合成多肽片段3具體為將N端偶聯(lián)有Fmoc保護基的甘氨酸(Fmoc-Gly-OH)溶解并活化，與固相載體偶聯(lián)后脫Fmoc保護基得到H-Gly-固相載體，然后按照SEQ ID NO: 3所示氨基酸序列C端到N端的順序，依次逐個將N端偶聯(lián)有Fmoc保護基以及側鏈偶聯(lián)有OtBu保護基的谷氨酸(Fmoc-Glu (0tBu)-0H)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護基的亮氨酸(Fmoc-Leu_OH)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護基以及側鏈偶聯(lián)有tBu保護基的酪氨酸(Fmoc-Tyr (tBu)-0H)、兩個N端偶聯(lián)有Fmoc保護基以及側鏈偶聯(lián)有tBu保護基的絲氨酸(Fmoc-Ser (tBu) -OH)進行延伸偶聯(lián)，偶聯(lián)后裂解脫除固相載體得到多肽片段 3(Fmoc_Ser (tBu) -Ser (tBu) -Tyr (tBu) -Leu-Glu (OtBu) -Gly-OH)ο作為優(yōu)選方案，步驟I所述固相合成多肽片段4具體為將N端偶聯(lián)有Fmoc保護基的丙氨酸(Fmoc-Ala-OH)溶解并活化，與固相載體偶聯(lián)后脫Fmoc保護基得到H-Ala-固相載體，然后按照SEQ ID NO:4所示氨基酸序列C端到N端的順序，依次逐個將N端偶聯(lián)有Fmoc保護基的異亮氨酸(Fmoc-Ile_OH)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護基的苯丙氨酸(FmOC-Phe-0H)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護基以及側鏈偶聯(lián)有OtBu保護基的谷氨酸(Fmoc-Glu (OtBu)-OH),N端偶聯(lián)有Fmoc保護基以及側鏈偶聯(lián)有Alloc保護基的絲氨酸(Fmoc-Lys (Alloc) -0H)、兩個N端偶聯(lián)有Fmoc保護基的丙氨酸(Fmoc-Ala-OH)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護基以及側鏈偶聯(lián)有Trt保護基的谷氨酰胺(Fmoc-Gln (Trt) -0H)進行延伸偶聯(lián)，然后脫除賴氨酸保護基Alloc并和Na -Palmotiyl-Glu-OtBu偶聯(lián)，偶聯(lián)后裂解脫除固相載體得到多妝片段 4 (Fmoc-Gln (Trt)-Ala-Ala-Lys (N- ε - (Na-Palmitoyl-L- Y -glutamyl-OtBu)) -Glu (OtBu) -Phe-Ile-Ala-OH)。其中，所述Na-Palmotiyl-Glu-OtBu中，OtBu為谷氨酸上α羧基(即主鏈上的羧基)的保護基，是為了使谷氨酸側鏈上的羧基和賴氨酸側鏈上的氨基縮合偶聯(lián)形成谷?；?glutamyl),最終完成利拉魯肽賴氨酸側鏈的合成。作為優(yōu)選方案，步驟I所述固相合成多肽片段5具體為將N端偶聯(lián)有Fmoc保護基的甘氨酸(Fmoc-Gly-OH)溶解并活化，與固相載體偶聯(lián)后脫Fmoc保護基得到H-Gly-固相載體，然后按照SEQ ID NO: 5所示氨基酸序列C端到N端的順序，依次逐個將N端偶聯(lián)有Fmoc保護基以及側鏈偶聯(lián)有Pdf保護基的精氨酸(Fmoc-Arg (Pdf) -0H) > N端偶聯(lián)有Fmoc保護基的甘氨酸(Fmoc-Gly-OH)、N端偶聯(lián)有Fmoc 保護基以及側鏈偶聯(lián)有Pdf保護基的精氨酸(Fmoc-Arg (Pdf) -0H), N端偶聯(lián)有Fmoc保護基的纟顏氨酸(Fmoc-Val-OH)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護基的亮氨酸(Fmoc-Leu-OH)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護基以及側鏈偶聯(lián)有Trt保護基的色氨酸(Fmoc-Trp (Trt)-OH)進行延伸偶聯(lián)得到N段偶聯(lián)有Fmoc保護基的多肽片段5，脫除N段帶有的Fmoc保護基得到多肽片段5 (Trp(Boc) -Leu-Val-Arg (Pbf) -Gly-Arg (Pbf) -Gly-固相載體)，所述固相載體為王樹脂或2-CTC樹脂。在上述固相合成多肽片段1-5的優(yōu)選方案中，所述延伸偶聯(lián)是指在第一個氨基酸與固相載體偶聯(lián)后，剩余氨基酸按照各自序列的順序逐個和前一個偶聯(lián)的氨基酸發(fā)生縮合反應(主鏈氨基和羧基的縮合反應)進行偶聯(lián)。在延伸偶聯(lián)中，由于每個氨基酸N端都有保護基，因此需要先脫除N端保護基再偶聯(lián)，這對本領域技術人員來說是公知常識，本發(fā)明優(yōu)選用DBLK脫除N端保護基。在上述固相合成多肽片段1-4的優(yōu)選方案中，進一步優(yōu)選采用2-CTC樹脂為固相載體進行合成，更優(yōu)選采用替代度范圍為O. 65-1. lmmol/g的2-CTC樹脂為固相載體進行合成。在上述固相合成多肽片段1-4的優(yōu)選方案中，進一步優(yōu)選采用體積比TFE:DCM為1:4的混合裂解液進行裂解。在上述固相合成多肽片段1-5的優(yōu)選方案中，進一步優(yōu)選采用HOBT / DIC雙體系偶聯(lián)劑、PyBOP / HOBt / DIEA三體系偶聯(lián)劑或TBTU / HOBt / DIEA三體系偶聯(lián)劑進行偶聯(lián)。更優(yōu)選為，在固相合成多肽片段1-4的優(yōu)選方案中采用TBTU / HOBt / DIEA三體系偶聯(lián)劑偶聯(lián)；在固相合成多肽片段5的優(yōu)選方案中采用HOBT / DIC雙體系偶聯(lián)劑偶聯(lián)。對于這些多體系的偶聯(lián)劑，其各組分的配比在本領域中是一定的且是公知的，在此不再贅述。在上述固相合成多肽片段1-5的優(yōu)選方案中，進一步優(yōu)選采用DMF、DCM、NMP和DMSO中任意一種或兩種溶劑來溶解，以及采用DIEA或DIC來活化，更優(yōu)選為采用體積比DMFiDCM為I: I的混合溶劑、DMF或DCM來溶解，以及采用DIEA來活化。在上述固相合成多肽片段1-5的優(yōu)選方案中，進一步優(yōu)選，所述偶聯(lián)的氨基酸與固相載體的摩爾比為3-5:1，所述偶聯(lián)的氨基酸與偶聯(lián)劑中HOBt的摩爾比為1:1. I。在上述固相合成多肽片段4的優(yōu)選方案中，進一步優(yōu)選用苯基硅烷和四三苯基磷鈀來脫除Alloc保護基。在上述固相合成多肽片段5的優(yōu)選方案中，進一步優(yōu)選，所述王樹脂或2-CTC樹脂的替代度為O. 3-1. Ommol/go在本發(fā)明所述方法步驟2至步驟6中，所述偶聯(lián)優(yōu)選采用HOBT / DIC雙體系偶聯(lián)齊[J、PyBOP / HOBt / DIEA三體系偶聯(lián)劑或HBTU / HOBt / DIEA三體系偶聯(lián)劑進行偶聯(lián)，所述脫出N端保護基優(yōu)選采用DBLK脫除N端保護基。對于這些多體系的偶聯(lián)劑，其各組分的配比在本領域中是一定的且是公知的，在此不再贅述。在本發(fā)明所述方法步驟2至步驟5中，所述偶聯(lián)優(yōu)選采用DMF、DCM、NMP和DMSO中任意一種或兩種為溶劑，更優(yōu)選為在步驟2和步驟3中采用體積比NMP = DMF為I: I的混合溶劑，在步驟4中采用體積比NMP = DMSO為I: I的混合溶劑，在步驟5中采用DCM為溶劑。在本發(fā)明所述方法步驟6中，作為優(yōu)選方案，所述裂解采用體積比TFA = H2O 為95:5的混合裂解液、TFA:EDT:PHOHiH2O為90-95:1-5:1-3:1-2的混合裂解液或TFA:PhSMe:TIS:PH0H:H2O為80-85:1-5:1-5:1-5:1-5的混合裂解液裂解，更優(yōu)選為采用TFA:PhSMe:TIS:PHOHiH2O 為 80:5:5:5:5 的混合裂解液裂解。在本發(fā)明所述方法步驟6中，作為優(yōu)選方案，所述純化為HPLC反向純化。由本發(fā)明所述方法合成的利拉魯肽經HPLC檢測，純度為99%以上，總收率為30%以上，而且本發(fā)明所述方法中5個片段可以同時進行合成，與現(xiàn)有逐個合成氨基酸的技術方案相比，能夠極大地縮短合成周期，提高效率。由以上技術方案可知，本發(fā)明先固相合成利拉魯肽其中的5個多肽片段，而后再將多肽片段偶聯(lián)制成成品，所述方法能夠極大地縮短合成周期，提高效率，而且提高了利拉魯肽的總收率，優(yōu)于現(xiàn)有的合成方法。
具體實施例方式本發(fā)明公開了一種合成利拉魯肽的方法，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發(fā)明內容、精神和范圍內對本文所述的的化合物和制備方法進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術。在本發(fā)明具體實施方式
中，所有偶聯(lián)由保護基的氨基酸均可通過市售獲得，本發(fā)明中的保護氨基酸購自于吉爾生化有限公司，所用王樹脂和2-CTC樹脂購自于天津南開和成有限公司，申請文件中所用英文縮寫對應的中文含義見表I。表I英文縮寫釋義
Fmoc9-荷甲氧裁基
叔丁氧羰基 tBu叔丁基
權利要求
1.一種合成利拉魯肽的方法，其特征在于，包括以下步驟 步驟I、固相合成在SEQ ID NO: I所示氨基酸序列N端、His側鏈上以及Glu側鏈上偶聯(lián)有保護基的多肽片段I ; 固相合成在SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列N端、Thr側鏈上、Ser側鏈上以及Asp側鏈上偶聯(lián)有保護基的多肽片段2 ； 固相合成在SEQ ID NO: 3所示氨基酸序列N端、Ser側鏈上、Tyr側鏈上以及Glu側鏈上偶聯(lián)有保護基的多肽片段3 ； 固相合成在SEQ ID NO: 4所示氨基酸序列N端、Gln側鏈上、Glu側鏈上偶聯(lián)有保護基以及在Lys側鏈上偶聯(lián)有Na-Palmitoyl-L- y -glutamyl-OtBu的多肽片段4 ； 固相合成在SEQ ID NO: 5所示氨基酸序列C端偶聯(lián)有王樹脂或2-CTC樹脂以及在Trp側鏈上和Arg側鏈上偶聯(lián)有保護基的多肽片段5 ； 步驟2、將多肽片段5的N端和多肽片段4的C端偶聯(lián)，偶聯(lián)后脫除多肽片段4的N端保護基，得到肽樹脂I ; 步驟3、將多肽片段3的C端和肽樹脂I的N端偶聯(lián)，偶聯(lián)后脫除多肽片段3的N端保護基，得到肽樹脂II ； 步驟4、將多肽片段2的C端和肽樹脂II的N端偶聯(lián)，偶聯(lián)后脫除多肽片段2的N端保護基，得到肽樹脂III; 步驟5、將多肽片段I的C端和肽樹脂III的N端偶聯(lián)，得到利拉魯肽樹脂； 步驟6、利拉魯肽樹脂裂解脫除C端樹脂和所有保護基得到利拉魯肽粗品，粗品純化后即得利拉魯肽。
2.根據權利要求I所述方法，其特征在于，步驟I所述固相合成多肽片段I具體為 將N端偶聯(lián)有Fmoc保護基的甘氨酸(Fmoc-Gly-OH)溶解并活化，與固相載體偶聯(lián)后脫Fmoc保護基得到H-Gly-固相載體，然后按照SEQ ID NO: I所示氨基酸序列C端到N端的順序，依次逐個將N端偶聯(lián)有Fmoc保護基以及側鏈偶聯(lián)有OtBu保護基的谷氨酸(Fmoc-Glu(0tBu)-0H)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護基的丙氨酸(Fmoc-Ala-OH)、N端偶聯(lián)有Boc保護基以及側鏈偶聯(lián)有Trt保護基的組氨酸(Fmoc-His (Trt) -OH)進行延伸偶聯(lián)，偶聯(lián)后裂解脫除固相載體得到多肽片段 I (Boc-His (Trt)-Ala-Glu (OtBu)-Gly-ΟΗ)。
3.根據權利要求I所述方法，其特征在于，步驟I所述固相合成多肽片段2具體為 將N端偶聯(lián)有Fmoc保護基的甘氨酸(Fmoc-Val-OH)溶解并活化，與固相載體偶聯(lián)后脫Fmoc保護基得到H-Val-固相載體，然后按照SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列C端到N端的順序，依次逐個將N端偶聯(lián)有Fmoc保護基以及側鏈偶聯(lián)有OtBu保護基的天冬氨酸(Fmoc-Asp(OtBu) -OH)> N端偶聯(lián)有Fmoc保護基以及側鏈偶聯(lián)有tBu保護基的絲氨酸(Fmoc-Ser(tBu) -0H)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護基以及側鏈偶聯(lián)有tBu保護基的蘇氨酸(Fmoc-Thr(tBu)_0H)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護基的苯丙氨酸(Fmoc-Phe_OH)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護基以及側鏈偶聯(lián)有tBu保護基的蘇氨酸(Fmoc-Thr (tBu) -0H)進行延伸偶聯(lián)，偶聯(lián)后裂解脫除固相載體得到多妝片段 2 (Fmoc-Thr (tBu) -Phe-Thr (tBu) -Ser (tBu) -Asp (OtBu) -Val-OH)
4.根據權利要求I所述方法，其特征在于，步驟I所述固相合成多肽片段3具體為 將N端偶聯(lián)有Fmoc保護基的甘氨酸(Fmoc-Gly-OH)溶解并活化，與固相載體偶聯(lián)后脫Fmoc保護基得到H-Gly-固相載體，然后按照SEQ ID NO: 3所示氨基酸序列C端到N端的順序，依次逐個將N端偶聯(lián)有Fmoc保護基以及側鏈偶聯(lián)有OtBu保護基的谷氨酸(Fmoc-Glu(OtBu) -OH)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護基的亮氨酸(Fmoc-Leu-OH)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護基以及側鏈偶聯(lián)有tBu保護基的酪氨酸(Fmoc-Tyr (tBu)-OH)、兩個N端偶聯(lián)有Fmoc保護基以及側鏈偶聯(lián)有tBu保護基的絲氨酸(Fmoc-Ser (tBu) -OH)進行延伸偶聯(lián)，偶聯(lián)后裂解脫除固相載體得到多妝片段 3 (Fmoc-Ser (tBu) -Ser (tBu) -Tyr (tBu) -Leu-Glu (OtBu) -Gly-ΟΗ)
5.根據權利要求I所述方法，其特征在于，步驟I所述固相合成多肽片段4具體為 將N端偶聯(lián)有Fmoc保護基的丙氨酸(Fmoc-Ala-OH)溶解并活化，與固相載體偶聯(lián)后脫Fmoc保護基得到H-Ala-固相載體，然后按照SEQ ID NO: 4所示氨基酸序列C端到N端的順序，依次逐個將N端偶聯(lián)有Fmoc保護基的異亮氨酸(Fmoc-Ile-OH)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護基的苯丙氨酸(FmOC-Phe-0H)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護基以及側鏈偶聯(lián)有OtBu保護基的谷氨酸(Fmoc-Glu (0tBu)-0H)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護基以及側鏈偶聯(lián)有Alloc保護基的絲氨酸(Fmoc-Lys (Alloc) -0H)、兩個N端偶聯(lián)有Fmoc保護基的丙氨酸(Fmoc-Ala-OH)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護基以及側鏈偶聯(lián)有Trt保護基的谷氨酰胺(Fmoc-Gln (Trt) -OH)進行延伸偶聯(lián)，然后脫除賴氨酸保護基Alloc并和N°-Palmotiyl-Glu-OtBu偶聯(lián)，偶聯(lián)后裂解脫除固相載體得到多妝片段 4 (Fmoc-Gln (Trt)-Ala-Ala-Lys (N- ε - (Na-Palmitoyl-L- Y -glutamyI-OtBu)) -Glu (OtBu) -Phe-Ile-Ala-OH)。
6.根據權利要求I所述方法，其特征在于，步驟I所述固相合成多肽片段5具體為 將N端偶聯(lián)有Fmoc保護基的甘氨酸(Fmoc-Gly-OH)溶解并活化，與固相載體偶聯(lián)后脫Fmoc保護基得到H-Gly-固相載體，然后按照SEQ ID NO: 5所示氨基酸序列C端到N端的順序，依次逐個將N端偶聯(lián)有Fmoc保護基以及側鏈偶聯(lián)有Pdf保護基的精氨酸(Fmoc-Arg(Pdf) -OH), N端偶聯(lián)有Fmoc保護基的甘氨酸(Fmoc-Gly-OH)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護基以及側鏈偶聯(lián)有Pdf保護基的精氨酸(Fmoc-Arg (Pdf) -0H)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護基的繳氨酸(Fmoc-Val-OH)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護基的亮氨酸(Fmoc-Leu-OH)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護基以及側鏈偶聯(lián)有Trt保護基的色氨酸(Fmoc-Trp (Trt) -OH)進行延伸偶聯(lián)得到N段偶聯(lián)有Fmoc保護基的多肽片段5，脫除N段帶有的Fmoc保護基得到多肽片段5 (Trp(Boc) -Leu-Val-Arg (Pbf) -Gly-Arg (Pbf) -Gly-固相載體)，所述固相載體為王樹脂或2-CTC樹脂。
7.根據權利要求2-5任意一項所述方法，其特征在于，所述多肽片段固相合成中采用的固相載體為2-CTC樹脂。
8.根據權利要求2-5任意一項所述方法，其特征在于，所述裂解采用體積比TFE:DCM為1:4的混合裂解液裂解。
9.根據權利要求2-6任意一項所述方法，其特征在于，所述多肽片段固相合成中采用HOBT / DIC雙體系偶聯(lián)劑、PyBOP / HOBt / DIEA三體系偶聯(lián)劑或TBTU / HOBt/DIEA三體系偶聯(lián)劑偶聯(lián)。
10.根據權利要求2-6任意一項所述方法，其特征在于，所述多肽片段固相合成中采用的溶劑為DMF、DCM、NMP和DMSO中任意一種或兩種。
11.根據權利要求I所述方法，其特征在于，步驟2至步驟6所述偶聯(lián)采用HOBT/ DIC雙體系偶聯(lián)劑、PyBOP / HOBt / DIEA三體系偶聯(lián)劑或HBTU / HOBt/DIEA三體系偶聯(lián)劑偶聯(lián)。
12.根據權利要求I所述方法，其特征在于，步驟2至步驟6所述偶聯(lián)采用的溶劑為DMF、DCM、NMP和DMSO中任意一種或兩種。
13.根據權利要求I所述方法，其特征在于，步驟6所述裂解采用體積比TFA= H2O為95:5的混合裂解液、TFA:EDT:PHOHiH2O為90-95:1-5:1-3:1-2的混合裂解液或TFA: PhSMe: TIS: PHOHiH2O 為 80-85:1-5:1-5:1-5:1-5 的混合裂解液裂解。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥合成領域，公開了一種合成利拉魯肽的方法。本發(fā)明所述方法按照利拉魯肽主鏈N端至C端的氨基酸順序，先合成第1至第4氨基酸、第5至第10氨基酸、第11至第16氨基酸、第17至第24氨基酸以及第25至第31氨基酸的5個多肽片段，然后偶聯(lián)5個多肽片段合成利拉魯肽。本發(fā)明所述方法能夠同時進行5個片段的合成，極大地縮短合成周期，提高效率，而且該方法能夠提高利拉魯肽的總收率，優(yōu)于現(xiàn)有的合成方法。
文檔編號C07K14/605GK102875665SQ20121036996
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月28日 優(yōu)先權日2012年9月28日
發(fā)明者潘俊鋒, 覃亮政, 劉建, 馬亞平, 袁建成 申請人:深圳翰宇藥業(yè)股份有限公司