一種分離純化脫水達托霉素的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種分離純化脫水達托霉素的方法，該方法先采用陶瓷膜過濾達托霉素發(fā)酵液，濾液經(jīng)FPDA13樹脂進行分離純化，然后將得到的脫水達托霉素解吸液通過納濾膜濃縮，脫水達托霉素濃縮液再經(jīng)制備色譜法分離純化，最終得到色譜純度大于98％的高純度的脫水達托霉素，該方法操作簡便、成本低廉。
【專利說明】一種分離純化脫水達托霉素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及藥物純化領(lǐng)域，具體涉及一種分離純化脫水達托霉素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著抗生素的發(fā)展及抗生素的濫用，病原菌對抗生素的耐藥性是當今社會面臨的最嚴峻挑戰(zhàn)。除了控制抗生素濫用外，目前尋找一種有效的對抗耐藥菌的抗生素成了解決這一問題的最佳途徑，萬古霉素曾被認為是對抗革蘭氏陽性菌的最后一道防線，但現(xiàn)在全世界臨床已發(fā)現(xiàn)越來越多的耐此藥菌。
[0003]達托霉素(Daptomycin)是由LillyGL^)公司最初研究,Cubist制藥公司開發(fā)的一環(huán)脂肽類抗生素。應(yīng)病人對新型耐藥抗生素的迫切需求，2003年底，美國食品與藥物管理局(FDA)經(jīng)過快速審理程序批準注射用達托霉素(Daptomycin)(商品名cubicin)用于治療由一些革蘭氏陽性敏感菌株引起的并發(fā)性皮膚及皮膚結(jié)構(gòu)感染，如膿腫、手術(shù)切口感染和皮膚潰瘍。達托 霉素的作用機制與其他抗生素不同，它通過擾亂細胞膜對氨基酸的轉(zhuǎn)運，從而阻礙細菌細胞壁肽聚糖的生物合成，改變細胞質(zhì)膜的性質(zhì)；另外，它還能通過破壞細菌的細胞膜，使其內(nèi)容物外泄而達到殺菌的目的，因此細菌對達托霉素產(chǎn)生耐藥性可能會比較困難。
[0004]達托霉素雖然已經(jīng)在美國實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，但在達托霉素產(chǎn)品中常包含有脫水達托霉素等雜質(zhì)，嚴重影響產(chǎn)品質(zhì)量，為此能夠單獨分離純化出達托霉素中的雜質(zhì)并進行研究是非常必要的。
[0005]目前，國內(nèi)相關(guān)脫水達托霉素的專利及文獻報道甚少，更未見脫水達托霉素的分離純化方法。歐洲專利1586580A2中描述了達托霉素雜質(zhì)歸屬，但并未具體涉及達托霉素雜質(zhì)分離方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種操作簡便、成本低廉且能快速得到高純度脫水達托霉素的分離純化方法。
[0007]本發(fā)明的分離純化脫水達托霉素的方法，其步驟包括:
[0008]I)將達托霉素發(fā)酵液用陶瓷膜進行過濾，然后水循環(huán)洗滌陶瓷膜，收集達托霉素濾液；
[0009]2)將上述達托霉素濾液調(diào)節(jié)pH至6.0~8.0,經(jīng)弱堿性樹脂吸附、洗脫后得到脫水達托霉素解吸液；
[0010]3)將上述解吸液經(jīng)納濾膜系統(tǒng)濃縮，得到脫水達托霉素濃縮液；
[0011]4)將上述濃縮液經(jīng)制備色譜柱分離純化得到色譜純度> 98%的脫水達托霉素制備液；
[0012]5)將上述制備液經(jīng)真空凍干干燥后得到固體脫水達托霉素。
[0013]根據(jù)上述分離純化方法，在步驟I)中，所用的陶瓷膜孔徑為0.01 μ m~0.1 μ m，洗滌陶瓷膜所用水溶液的體積為發(fā)酵液體積3~5倍。
[0014]在步驟2)中，采用弱堿性樹脂分離系統(tǒng)分離純化脫水達托霉素，弱堿性樹脂選擇FPDA13樹脂，其裝填內(nèi)徑和高度比為1: 7~1: 10，優(yōu)選為1: 10，從而更好的分離達托霉素及脫水達托霉素。
[0015]在步驟2)中，采用pH為6.5~8.0的(λ 06N的乙酸鈉溶液、(λ 2N~(λ 6N的氯化鈉溶液洗脫樹脂，收集色譜純度> 40 %的脫水達托霉素的解吸液。
[0016]在步驟3)中，所用納濾膜的截留分子量為200~500。
[0017]在步驟4)中，采用制備色譜分離系統(tǒng)進一步分離純化脫水達托霉素，制備色譜柱條件是:
[0018]色譜柱:Ib-Sitc8/6045_1，250*10.0Omm ;
[0019]流動相:乙腈、磷酸二氫氨緩沖液，其中乙腈、磷酸二氫氨緩沖液體積比為30: 70~40: 60，優(yōu)選35: 65 ;磷酸二氫氨緩沖液中磷酸二氫氨占3~5%，優(yōu)選5%，磷酸二氫氨緩沖液pH為3.0~4.0 ;
[0020]進樣體積:5ml ；
[0021]流速:4ml/min；
[0022]檢測波長:214nm；
[0023]柱溫:室溫。
[0024]上述各步驟中，采用常用的酸堿調(diào)節(jié)劑包括乙酸和氫氧化鈉來調(diào)節(jié)溶液的pH。
`[0025]在本發(fā)明方法中，達托霉素發(fā)酵液經(jīng)過陶瓷膜系統(tǒng)、樹脂分離系統(tǒng)及制備色譜分離系統(tǒng)處理后，得到的脫水達托霉素其色譜純度在98%以上。該方法簡單易行，成本低廉。
【具體實施方式】
[0026]以下通過實施例進一步描述本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0027]下述實施例所用實驗材料均為達托霉素發(fā)酵液，其為pH7.0左右的較粘稠料液。
[0028]實施例1
[0029]將達托霉素發(fā)酵液經(jīng)過孔徑0.01 μ m的陶瓷膜過濾除去達托霉素發(fā)酵液中的水溶性蛋白、色素等大分子物質(zhì)，用發(fā)酵液3倍體積的水循環(huán)洗滌陶瓷膜得到陶瓷膜濾液，所得濾液澄清透明，且顏色為紅黃色。
[0030]將濾液用稀乙酸調(diào)節(jié)pH至6.0，過FPDA13樹脂，水洗樹脂并用pH為6.5的0.06N乙酸鈉溶液及0.2N氯化鈉溶液洗脫,收集色譜純度> 40%的脫水達托霉素解吸液。
[0031]解吸液經(jīng)過截留分子量為200的納濾膜納濾濃縮(濃縮壓力< 0.6MPa)，濃縮后脫水達托霉素濃度為I % (w/w) ο
[0032]濃縮液經(jīng)制備色譜柱(乙腈:磷酸二氫氨緩沖液(體積比)=30: 70，ρΗ3.5)分離純化，并用高效液相跟蹤檢測(檢測條件與歐洲專利“PROCESS FOR THEPURIFICATIONOF DAPT0MYCIN”(EP 1586580A2)公開的方法相同)，收集色譜純度> 90%的脫水達托霉素制備液。
[0033]制備液真空凍干，所得固體脫水達托霉素的純度采用高效液相色譜法(檢測條件與歐洲專利 “PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN” (EPI 586 580 A2)公開的方法相同)檢測，其純度在93%以上。[0034]實施例2
[0035]將達托霉素發(fā)酵液經(jīng)過孔徑0.05 μ m的陶瓷膜過濾除去達托霉素發(fā)酵液中的水溶性蛋白、色素等大分子物質(zhì)，用發(fā)酵液4倍體積的水循環(huán)洗滌陶瓷膜得到陶瓷膜濾液，所得濾液澄清透明，且顏色為紅黃色。
[0036]將濾液用稀乙酸調(diào)節(jié)pH至7.0，過FPDA13樹脂，水洗樹脂并用pH為7.0的0.06N乙酸鈉溶液及0.3N氯化鈉溶液洗脫,收集色譜純度> 48%的脫水達托霉素解吸液。
[0037]解吸液經(jīng)過截留分子量為300的納濾膜納濾濃縮，濃縮后脫水達托霉素濃度為I % (w/w)。
[0038]濃縮液經(jīng)制備色譜柱(乙腈:磷酸二氫氨緩沖液(體積比)=35: 65，pH3.5)分離純化，并用高效液相跟蹤檢測(檢測條件與歐洲專利“PROCESS FOR THEPURIFICATIONOF DAPTOMYCIN”(EP I 586 580 A2)公開的方法相同)，收集色譜純度> 98%的脫水達托霉素制備液
[0039]制備液真空凍干，所得固體脫水達托霉素的純度采用高效液相色譜法(檢測條件與歐洲專利 “PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN” (EPI 586 580 A2)公開的方法相同)檢測，其純度在98%以上。
[0040]實施例3
[0041]將達托霉素發(fā) 酵液經(jīng)過孔徑0.1 μ m的陶瓷膜過濾除去達托霉素發(fā)酵液中的水溶性蛋白、色素等大分子物質(zhì)，用發(fā)酵液5倍體積的水循環(huán)洗滌陶瓷膜得到陶瓷膜濾液，所得濾液澄清透明，且顏色為紅黃色。
[0042]將濾液用稀乙酸調(diào)節(jié)pH至8.0，過FPDA13樹脂，水洗樹脂并用pH為8.0的0.06N乙酸鈉溶液、0.6N氯化鈉溶液洗脫,收集色譜純度> 40%的脫水達托霉素解吸液。
[0043]解吸液經(jīng)過截留分子量為500的納濾膜納濾濃縮，濃縮后脫水達托霉素濃度為I % (w/w)。
[0044]濃縮液經(jīng)制備色譜柱(乙腈:磷酸二氫氨緩沖液(體積比)=40: 60，pH3.5)分離純化，并用高效液相跟蹤檢測(檢測條件與歐洲專利“PROCESS FOR THEPURIFICATIONOF DAPTOMYCIN”(EP I 586 580 A2)公開的方法相同)，收集色譜純度> 95%的脫水達托
霉素制備液。
[0045]制備液真空凍干，所得固體脫水達托霉素的純度采用高效液相色譜法(檢測條件與歐洲專利 “PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN” (EPI 586 580 A2)公開的方法相同)檢測，其純度在95%以上。
[0046]本發(fā)明所用膜在使用后均要用膜清洗劑清洗，必要時用0.5%亞硫酸氫鈉溶液浸泡保存，以達到膜的重復(fù)利用。
[0047]本發(fā)明綜合采用膜分離技術(shù)、樹脂層析技術(shù)、制備色譜技術(shù)提供一種快速簡便、成本低廉的制備高純度脫水達托霉素的工藝技術(shù)。尤其是FPDA13層析和制備色譜技術(shù)的綜合利用更是高純度脫水達托霉素制備的關(guān)鍵工藝控制點。雖然本文已經(jīng)對該發(fā)明進行了詳盡的描述，但可以理解，在不違背本發(fā)明精神和實質(zhì)的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以做一些修改或變動，這些修改或變動均在本發(fā)明要求保護的范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種分離純化脫水達托霉素的方法，包括下述步驟: 1)將達托霉素發(fā)酵液用陶瓷膜進行過濾，收集達托霉素濾液； 2)將上述達托霉素濾液pH調(diào)至6.0~8.0，經(jīng)弱堿性樹脂吸附、洗脫后得到脫水達托霉素的解吸液； 3)將上述解吸液經(jīng)納濾膜系統(tǒng)濃縮，得到脫水達托霉素濃縮液； 4)將上述濃縮液經(jīng)制備色譜柱分離純化后得脫水達托霉素制備液； 5)將上述制備液凍干干燥后得到固體脫水達托霉素。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟I)中所述陶瓷膜膜孔徑為0.01μπι~.0.1 μ m0
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟I)中用水循環(huán)洗滌陶瓷膜，洗滌所用的水用量為發(fā)酵液體積的3~5倍。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中所述弱堿性樹脂為FPDA13樹脂，其裝填內(nèi)徑和高度比為1: 7~1: 10。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中采用pH為6.5~8.0的0.06N的乙酸鈉、0.2N~0.6N的氯化鈉溶液洗滌樹脂，收集色譜純度> 40%的脫水達托霉素的解吸液。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中所述納濾膜系統(tǒng)的截留分子量為200 ~500。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)中，所述濃縮液經(jīng)制備色譜柱分離純化后得到的脫水達托霉素制備液，其色譜純度> 98%。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)所述制備色譜柱條件為:色譜柱:Ib-SitC8/6045-l>250*10.0Omm ;波長:214nm ;流動相:乙腈、磷酸二氫氨緩沖液。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述流動相中乙腈與磷酸二氫氨緩沖液體積比為30: 70~40: 60。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，磷酸二氫氨緩沖液中磷酸二氫氨占3~5%。
11.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，磷酸二氫氨緩沖液的pH為3.0~4.0。
【文檔編號】C07K1/36GK103724400SQ201210383238
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年10月10日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月10日
【發(fā)明者】趙燕, 張洪蘭 申請人:北大方正集團有限公司, 北大國際醫(yī)院集團重慶大新藥業(yè)股份有限公司, 北大國際醫(yī)院集團有限公司