專利名稱：一種ugt1a9/1a8的特異性探針底物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種UGT1A9/1A8的特異性探針底物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
UGT (尿苷二憐酸葡萄糖醒酸轉(zhuǎn)移酶，Uridine diphosphate-glucuronosyltransferase)酶家族是人體內(nèi)重要的代謝酶系，其負責清除多種內(nèi)源性化合物如膽紅素，5-羥色胺，甲狀腺素等以及大量外源性化合物如伊利替康，雷洛昔酚，對乙酰氨基酚等藥物，以及己烯雌酚、雙酚A等食品及環(huán)境毒物等(Drug MetabolismDisposition. 2004，32:1201-1208)。UGT酶中的I家族和2家族是UGT酶系的兩個主要家族，其中 UGTl 家族共有 9 個亞型1A1,1A3, 1A4, 1A5, 1A6，1A7，1A8，1A9 和 IAlO0 UGTlA 的 9·個亞型在人體的組織分布上具有明顯的組織特異性。其中UGT1A1，1A3, 1A4，1A6，1A9在肝臟中都有豐富的表達(1A6和1A9在腎臟中的表達要比肝臟還高)，而1A4，1A6和1A9在腸道中幾乎不表達。UGT1A7主要在食道和氣管和宮頸等組織分布，UGT1A8和1A10主要在小腸和結(jié)腸中表達豐富，肝臟中不表達。UGT酶活性的體外評價體系主要包括重組單酶、哺乳動物的亞細胞組分、新鮮提取的肝細胞、原代培養(yǎng)肝細胞、肝切片、肝灌流等(Toxicology in Vitro2006, 135-153),其中已經(jīng)商品化的人重組UGT單酶主要來自于細菌、昆蟲細胞、哺乳動物細胞以及酵母菌建立的克隆表達體系，而亞細胞組分主要包括微粒體、S9成分。采用這些標準化的評價體系，結(jié)合相應(yīng)的輔因子(如=UDPGA等)和孵育條件，可通過檢測探針底物的代謝清除或產(chǎn)物生成速率，對上述各種體系中表達的UGT酶活性進行表征。UGTlA中的多個亞型在氨基酸序列上具有很高的同源性，因而催化的底物具有廣泛的交叉性，目前UGT各個亞型的特異性探針底物很缺乏。UGT1A9在氨基酸序列上與1A7，I AS, 1A10亞型之間具有高度同源性(>93%)，因而這些酶之間經(jīng)常顯示具有共底物的代謝特征。由于UGT1A9亞型主要分布于肝臟和腎臟,而1A8,1A10主要在腸中表達同時不在肝臟組織中表達(Plos One. 2007. e396)。所以在體外以組織微粒體和S9為主的代謝體系中，盡管一個化合物是UGT1A8和UGT1A9的共底物，但由于這兩種酶在人體的組織分布特異性也可將UGT1A9和UGT1A8對該化合物在肝臟和腸道的代謝能力解析清楚，同時該化合物若不被其它UGT酶代謝其不僅可作為肝臟中UGT1A9的特異性探針底物，又可作為腸道UGT1A8的特異性探針底物。UGT1A9主要負責代謝清除一些非留體類抗炎藥物如對乙酰氨基酚，吲哚美辛等，治療帕金森癥的輔助藥物伊托卡朋和一些天然產(chǎn)物如黃酮，蒽醌，香豆素類化合物等，而UGT1A8主要負責代謝如藥物雷洛昔酚，嗎啡，天然的黃酮等。對這兩個酶的代謝活性的評估具有十分重要的意義。綜上所述，UGT酶的特異性探針底物的篩選及開發(fā)意義重大。目前麻醉藥物異丙酚就是UGT1A9代謝為主的藥物(其可被UGT1A9、1A7和1A8催化生成其單葡萄糖醛酸化產(chǎn)物)，已在臨床上廣泛使用。本發(fā)明中紫草素具有代謝產(chǎn)物單一(僅生成一個單葡萄糖醛酸化產(chǎn)物)、代謝酶高選擇性(肝臟僅UGT1A9代謝、腸中僅UGT1A8參與其代謝)、代謝速率快、代謝產(chǎn)物易檢測等特點。此外，紫草素作為我國和澳大利亞等國家的合法食品添加劑，其具有高安全性(小鼠口服LD5tl為2700-7990mg/kg)，因此其作為體內(nèi)UGT1A9的探針要比麻醉藥物異丙酚更加安全。而腸道主要代謝酶UGT1A8—直未有特異性探針底物的報道，本發(fā)明的提出將填補該領(lǐng)域的空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種萘醌類化合物紫草素及其應(yīng)用，該紫草素可作為UGT1A9和UGT1A8的高特異性體外探針底物，用于定量測定不同來源生物樣本中UGT1A9及UGT1A8的酶活。由于目前尚未見文獻報道UGT1A8的特異性探針底物，紫草素作為探針底物能夠特異性的評價機體或組織中UGT1A9酶和UGT1A8酶對藥物的處置能力，對藥物代謝相關(guān)基礎(chǔ)研究具有重要意義。此外，紫草素作為肝臟UGT1A9的探針底物，與異丙酚相比更具優(yōu)勢。本發(fā)明提供了一種萘醌類化合物紫草素，該紫草素的名稱為5，8_ 二羥·基-2-(1-羥基-4-甲基-3-戊烯基)-I, 4-萘醌，其是尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A9和1A8的特異性探針底物，其結(jié)構(gòu)如圖I所示。本發(fā)明還提供了所述紫草素定量測定生物體系中UGT1A8或UGT1A9酶活的方法，采用紫草素作為探針底物，通過定量檢測單位時間內(nèi)的底物的消除量或其O-葡萄糖醛酸化產(chǎn)物的生成量來測定各生物樣品及細胞中UGT1A9或1A8酶的活性；其測定方法為—體系中以紫草素作為特異性探針底物；底物濃度選擇1/5 5Km之間；——在具有輔因子UDPGA的孵育體系中，反應(yīng)溫度為10°C至60°C之間；—反應(yīng)時間為5-120分鐘，在確保以上底物相應(yīng)的葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物紫草素單葡萄糖醛酸化產(chǎn)物(5，8- 二羥基-2-(1-0葡萄糖醛酸-4-甲基-3-戊烯基)-I，4-萘醌)達到定量限且底物轉(zhuǎn)化率低于10%時終止反應(yīng)；測定單位時間內(nèi)底物減少量或單葡萄糖醛酸化產(chǎn)物生成量作為尿苷二磷酸葡萄糖醛酸1A9和1A8酶活性的評價指標。其中檢測底物減少量或其對葡萄糖醛酸化產(chǎn)物生成量的定量檢測方法為采用陣列二極管檢測器最大吸收波長為517nm，質(zhì)譜、放射性同位素示蹤技術(shù)等也可用于檢測紫草素及其葡萄糖醛酸化產(chǎn)物。所用的檢測器可以用其中的一種或多種串聯(lián)。本發(fā)明提供的紫草素用于標定特定組織代謝麻醉藥物異丙酚的能力，以及標定和預估UGT1A9代謝為主的化合物在特定機體的代謝清除率。采用人類重組表達UGT1A9或1A8單酶，肝微粒體，腎微粒體或腸微粒體或相應(yīng)的S9孵育體系進行考察，通過相關(guān)性分析，特異性抑制實驗，重組單酶代謝反應(yīng)，以及酶反應(yīng)動力學幾方面的證據(jù)，證明紫草素可高選擇性的被肝臟UGT1A9酶和腸道UGT1A8酶催化代謝并生成紫草素2- (1-0)-單葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物(如圖3所示)UFLC圖譜見圖4，代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)見圖4。作為UGT1A9和1A8的特異性探針底物，紫草素可用于檢測人重組UGT單酶中UGT1A9/1A8的活性，尤其適合用于對細菌、昆蟲細胞、哺乳動物細胞以及酵母菌克隆表達體系生產(chǎn)的UGT1A9和UGT1A8重組酶的酶活測定，以及多種哺乳動物組織器官來源的微粒體、
S-9等制備物中UGT1A9和UGT1A8的活性標定。
選用本發(fā)明所述紫草素作為尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A9和1A8的特異性探針底物檢測酶的體外活性具有以下突出優(yōu)勢(I)高選擇性紫草素可以被肝臟或腎臟中的UGT1A9特異性地代謝，也可以被腸道中的UGT1A8特異性代謝生成相應(yīng)的單葡萄糖醛酸化產(chǎn)物。(2)易于獲得底物紫草素是中藥紫草中含有的天然化學成分，來源簡單易于分離純化，無需化學合成。(3)易于檢測，紫草素可以利用陣列二極管檢測器進行檢測，UV檢測器對其也有一定的吸收，這些檢測器相對容易獲得。異丙酚因為其分子結(jié)構(gòu)簡單，沒有光譜吸收只能采用質(zhì)譜檢測或同位素標記，檢測成本較高。(4)高安全性紫草素是合法的食品添加劑，其與異丙酚相比，LD50值更高，安全性更好。


·圖I.紫草素的化學結(jié)構(gòu)式；圖2.紫草素的UGT單酶篩選實驗；圖3.紫草素的UGT催化代謝示意圖；圖4.紫草素在人肝微粒體中的代謝譜圖；圖5.紫草素2- (1-0)-單葡萄糖醛酸化產(chǎn)物的質(zhì)譜圖。
具體實施例方式下面的實施例將對本發(fā)明予以進一步的說明，但并不因此而限制本發(fā)明。實施例I :紫草素用于定量測定重組單酶中UGT1A9的酶活(I)預先準備180 μ I UGT代謝反應(yīng)體系，包括ρΗ7· 4的Tris-HCl緩沖液(5mM)、5mM MgCl2,重組人UGT1A9 (O. 015mg/ml)，紫草素終濃度為35 μ M，于37 °C條件下預孵5分鐘；(2)向反應(yīng)體系中加入20 μ 140mM UDPGA (終濃度4mM)起始反應(yīng)；(3)20分鐘后，加入100 μ I冰冷甲醇，劇烈震蕩后，終止反應(yīng)；(4)用高速冷凍離心機在4 °C，20，000 Xg的條件下，高速離心20分鐘后，取上清，進行UFLC-UV檢測；(5)在517nm下對紫草素及其葡萄糖醛酸化產(chǎn)物進行定量檢測。計算重組人UGT1A9酶的最大催化速率為150. 3pmol/mim/mgo實施例2 :紫草素用于定量測定人肝微粒體中UGT1A9的酶活(I)反應(yīng)體系同上。將體系中UGT1A9替換為人肝微粒體，微粒體的蛋白濃度為O. 025mg/ml，反應(yīng)時間為20分鐘。(2) 4°C, 20, OOOXg的條件下高速離心20分鐘后，取上清，進行UFLC-UV檢測；(3)在517nm下對紫草素及其葡萄糖醛酸化產(chǎn)物進行定量檢測。可測得在人肝微粒體中UGT1A9的最大催化速率為92. 6pmol/min/mg0實施例3 :檢測重組人UGT1A8單酶中的酶活反應(yīng)條件及操作流程與實施案例I相同，只是將UGT1A8代替UGT1A9進行紫草素的代謝孵育。利用相同的方法可以測定出不同批次重組人UGT1A8活性。測定本實驗的重組人UGT1A8的最大反應(yīng)速率為9. 67pmol/min/mg.實施案例4 :紫草素與異丙酚代謝的相關(guān)性分析 以紫草素和異丙酚為底物，分別在12例人肝個體樣本中進行UGT代謝反應(yīng)的孵育，反應(yīng)孵育條件同實施例I及2。測定每例人肝微粒體孵育體系中紫草素/異丙酚UGT代謝產(chǎn)物的生成速率，分別以紫草素/異丙酚UGT代謝產(chǎn)物的生成速率為橫、縱坐標作圖，對所形成的散點進行線性回歸分析，所得的r值為O. 91，提示紫草素與異丙酚具有相似的肝臟代謝酶及相近的UGT1A9代謝貢獻率。
權(quán)利要求
1.一種萘醌類化合物紫草素，化學名稱為5，8- 二羥基-2-(1-羥基-4-甲基-3-戊烯基)_1，4-萘醌，其特征在于該紫草素作為尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A9和1A8的特異性探針底物，其結(jié)構(gòu)如式(I)所示。
2.權(quán)利要求I所述的紫草素用于定量測定生物體系中UGT1A8或 UGT1A9酶活的方法，其特征在于采用紫草素作為探針底物，通過定量檢測單位時間內(nèi)的底物的消除量或，2- (1-0)-葡萄糖醛酸化產(chǎn)物的生成量來測定各生物樣品及細胞中UGT1A9或1A8酶的活性。
3.按照權(quán)利要求2所述的紫草素定量測定生物體系中UGT1A8或UGT1A9酶活的方法，其特征在于所述方法的條件為所選底物濃度介于1/5飛Km之間；孵育體系pH介于5.5 10. 5之間；反應(yīng)溫度介于2(T60°C之間；產(chǎn)物生成率或底物轉(zhuǎn)化率低于10%。
4.權(quán)利要求I所述的紫草素的應(yīng)用，其特征在于紫草素作為UGT1A9和UGT1A8特異性探針底物，用于定量測定重組UGT1A9，UGT1A8單酶體系，動物肝、腎及腸組織微粒體，S9中UGT1A9 或 UGT1A8 的酶活。
5.權(quán)利要求I所述的紫草素的應(yīng)用，其特征在于紫草素用于標定特定組織代謝麻醉藥物異丙酚的能力，以及標定和預估UGT1A9代謝為主的化合物在特定機體的代謝清除率。
全文摘要
一種萘醌類化合物紫草素，其作為葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶UGT1A9和UGT1A8的特異性探針底物，可用于UGT1A9/1A8酶活的定量測定。具體操作流程如下選擇紫草素作為特異性探針底物，并借助UGT體外孵育體系開展特異性底物的UGT催化反應(yīng)，通過定量檢測單位時間內(nèi)的底物消除量或其產(chǎn)物生成量來測定各生物樣品及細胞中UGT1A9和UGT1A8酶的活性。本發(fā)明可用于不同種屬、不同個體、不同來源生物樣本中UGT1A9/1A8酶活的定量評估，并可用于標定特定組織代謝麻醉藥物異丙酚的能力，以及基于體外代謝動力學數(shù)據(jù)標定和預估UGT1A9代謝為主的化合物在特定機體的代謝清除率。
文檔編號C07C50/32GK102898295SQ20121039340
公開日2013年1月30日 申請日期2012年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月16日
發(fā)明者楊凌, 何桂元, 葛廣波, 寧靜, 朱亮亮, 夏楊柳 申請人:中國科學院大連化學物理研究所