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      一種從大腸桿菌懸浮液中提取谷胱甘肽的方法

      文檔序號(hào):3588429閱讀:1385來源:國知局
      專利名稱:一種從大腸桿菌懸浮液中提取谷胱甘肽的方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域,涉及一種從大腸桿菌懸浮液中提取、制備低蛋白質(zhì)含量、高品質(zhì)的谷胱甘肽的方法,屬于谷胱甘肽制備技術(shù)領(lǐng)域。
      背景技術(shù)
      谷胱甘肽,即是L -谷氨酰-L -半胱氨酰甘氨酸(縮寫GSH),是由L-谷氨酸、L -半胱氨酰和甘氨酸經(jīng)肽鍵縮合而成的一種同時(shí)具有谷氨?;蛶€基的生物活性三肽化合物。谷胱甘肽有兩種形式還原型GSH和氧化型GSSG,只有GSH才具有活性,而生物體內(nèi)的GSSG需還原后才能發(fā)揮其重要的生理功能。還原型谷胱甘肽固體較為穩(wěn)定,但其水溶液在空氣中極易被氧化成氧化型谷胱甘肽GSSG。GSH在自然界中廣泛分布于動(dòng)物、植物和微生物細(xì)胞內(nèi)。GSH在生物體內(nèi)有著多種重要的生理功能,特別是對于維持生物體內(nèi)適宜的 氧化還原環(huán)境起著至關(guān)重要的作用。GSH還具有獨(dú)特的生理功能,被稱為長壽因子和抗衰老因子。由于GSH在強(qiáng)化食品風(fēng)味的同時(shí)對人體有保健作用,它的應(yīng)用前景顯然要優(yōu)于其它類型的防腐劑或抗氧化劑。隨著GSH的生理生化功能和性質(zhì)被不斷研究發(fā)現(xiàn),GSH作為一種多功能的生物活性添加劑在食品加工業(yè)中的應(yīng)用將會(huì)愈來愈廣,GSH的需求量正日益增大。生物發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽的方法不斷得到改進(jìn),已經(jīng)成為目前國內(nèi)外生產(chǎn)谷胱甘肽最普遍的方法。但要從菌體發(fā)酵液中獲得純度很高的GSH,一直成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。到目前為止報(bào)道的分離提純GSH的方法有銅鹽法、離子交換、親和層析、雙水相分離等。銅鹽法是一種比較傳統(tǒng)的方法,有一定實(shí)用價(jià)值,目前仍然被一些GSH生產(chǎn)工藝所應(yīng)用,但污染較大,工藝復(fù)雜,所以隨著各項(xiàng)新的分離純化技術(shù)的出現(xiàn),必將逐漸被淘汰。由于氨基酸和多肽類物質(zhì)為具有弱堿性和弱酸性官能團(tuán)的兩性化合物,因此采用陰陽離子交換樹脂吸附、解吸的方法來使得氨基酸和膚類化合物和其他物質(zhì)快速有效的分離。該方法經(jīng)濟(jì)效益較高,可望完全代替銅鹽法。親和層析方法是一種有效的分離純化GSH的方法。一般而言含汞樹脂對酸堿比較敏感,穩(wěn)定性比較差,在工業(yè)應(yīng)用上有一定的限制。近年來我國離子交換樹脂工業(yè)發(fā)展迅速,國產(chǎn)離子交換樹脂的價(jià)格相對于進(jìn)口樹脂價(jià)格大大降低,使得離子交換法在生化物質(zhì)的分離方面的研究不斷深入。離子交換法能夠?qū)щ娗闆r不同的物質(zhì)進(jìn)行分離,廣泛應(yīng)用于天然活性成分的研究中。對于離子交換法,國內(nèi)外對陽離子交換樹脂的研究比較多,但大多GSH的回收率很低,只達(dá)到32. 9%—57. 6%,同時(shí)獲得的產(chǎn)品純度普遍較低。

      發(fā)明內(nèi)容
      本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足,提供一種從大腸桿菌懸浮液中提取谷胱甘肽的方法,是利用生物發(fā)酵法在大腸桿菌中表達(dá)積累谷胱甘肽后,通過先進(jìn)的分離純化手段制備高品質(zhì)、高含量的谷胱甘肽的方法,制備的產(chǎn)品以富含谷胱甘肽的作為高端食品添加劑存在。為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明所提供的技術(shù)方案是一種從大腸桿菌懸浮液中提取谷胱甘肽的方法,包括步驟如下
      (I)用2±0· 5moIH2SO4調(diào)節(jié)大腸桿菌懸浮液的pH值為2-3,經(jīng)過2. 5±0· 5MPa勻漿均質(zhì)機(jī)破壁得破壁好的懸浮液,所述的破壁時(shí)間為45-60min ;
      (2)將破壁好的懸浮液離心得到離心上清液,離心轉(zhuǎn)速為5000土 lOOrpm,時(shí)間為10-15 min ;
      (3)將離心上清液經(jīng)陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂連續(xù)吸附與解吸,收集富含谷胱甘肽的高峰液;
      (4)將谷胱甘肽高峰液進(jìn)行低溫濃縮成谷胱甘肽濃縮液,再將谷胱甘肽濃縮液冷凍干燥即得白色粉末狀谷胱甘肽成品。
      進(jìn)一步在上述從大腸桿菌懸浮液中提取谷胱甘肽的方法中,所述步驟3的陽離子樹脂交換是指將型號(hào)為DOOl陽離子交換樹脂裝柱,柱體積6CmX80Cm,將離心上清液直接上柱,其上柱時(shí)pH值為2-3,流速為100ml/min,上樣直至飽和;用3_5倍柱體積的以鹽酸調(diào)pH值為4的蒸餾水洗樹脂柱,將雜質(zhì)洗去,再用3-5倍柱體積的I. 5%HC1洗脫,其洗脫速度為100ml/min,洗脫收集DOOl陽離子高峰液。所述步驟3的陰離子樹脂交換是指將型號(hào)為D293陰離子交換樹脂裝柱,柱體積6cmX80cm,將DOOl陽離子高峰液直接上柱,速度為100ml/min,收集富含谷胱甘肽的高峰液。所述步驟4的低溫真空濃縮條件是真空度
      O.9±0. IMPa,旋轉(zhuǎn)速度130±20 rpm,溫度55_60°C,濃縮至谷胱甘肽高峰液重量百分濃度的8-10倍,得谷胱甘肽濃縮液。所述步驟4的冷凍干燥條件是將谷胱甘肽在低溫條件下經(jīng)納濾濃縮與真空低溫濃縮后的濃縮液在_72±5°C下干燥28±2h,即得白色粉末狀谷胱甘妝成品。與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明從谷胱甘肽大腸桿菌的懸浮液中提取GSH的過程分為提取和濃縮兩個(gè)部分,提取為從含有谷胱甘肽的大腸桿菌中,通過菌體破壁抽提,懸浮液的固液分離,得到含有谷胱甘肽的上清液,經(jīng)過離子交換樹脂技術(shù)、代溫納濾濃縮、真空低溫濃縮、冷凍干燥得到GSH。用2molH2S04調(diào)節(jié)pH值,經(jīng)過高壓勻質(zhì)器破壁,高速離心得到含有的谷胱甘肽的上清液。采用在破壁前調(diào)節(jié)pH值,不僅有利于GSH的穩(wěn)定,而且可以使大分子蛋白質(zhì)變性沉淀,除去大部分蛋白質(zhì)。陽陰離子交換技術(shù)去除大分子雜質(zhì)和脂類色素物質(zhì),最終達(dá)到從懸浮液中分離、純化、濃縮谷胱甘肽的操作工序,有效的去除菌體細(xì)胞碎片、大分子蛋白、有色物質(zhì),尤其是離子交換技術(shù)適合大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。該法操作簡單、高效、費(fèi)用低廉、成品純度較高、環(huán)境污染小、易于工業(yè)化。制得GSH產(chǎn)品的純度為95%以上、蛋白質(zhì)含量為I. 3%、提取收率為86. 5%的谷胱甘肽成品。
      具體實(shí)施例方式為更好理解本發(fā)明,下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步介紹,但需要說明的是,本發(fā)明所要求的保護(hù)的范圍并不局限于實(shí)施例所表述的范圍。實(shí)施例I
      發(fā)酵培養(yǎng)得到的谷胱甘肽大腸桿菌懸浮液,成份分析結(jié)果菌體275g/L;GSH含量
      3.95 g/L。將上述30L懸浮液用2 mo I/L硫酸調(diào)節(jié)pH至2_3范圍內(nèi),經(jīng)過高壓勻質(zhì)器破壁45-60min,將破碎好的懸浮液,經(jīng)高速冷凍離心機(jī)分離,條件5°C -10°C,5000rpm,15min。得到離心上清液12L,取12L上清液直接上DOOl陽離子交換樹脂柱,柱體積為6mX80cm,流速為100ml/min,上樣直至飽和;用3_5倍柱體積的pH 4. O的PBS緩沖液洗樹脂柱,將雜質(zhì)洗去,再用3-5倍柱體積的I. 5% HCl洗脫,其洗脫速度為100ml/min,洗脫收集富含DOOl陽離子高峰液。再將DOOl陽離子高峰液直接上D293陰離子交換樹脂柱,速度為100ml/min,收集富含谷胱甘肽的脫色高峰。此時(shí)GSH回收率為93. 1,蛋白質(zhì)去除率為78%。將上述經(jīng)吸附柱濃縮后的谷胱甘肽濃縮液進(jìn)行真空濃縮,按照下列條件進(jìn)行真空度O. 9MPa,旋轉(zhuǎn)速度130 rpm,溫度35V -60°C濃縮至8倍。將谷胱甘肽濃縮液進(jìn)行冷凍干燥,于_72°C下干燥28 h后得到白色粉末狀谷胱甘肽成品。此時(shí)谷胱甘肽的純含量為102. 52 g,提取收率為86. 5%。谷胱甘肽呈白色粉末狀物質(zhì),具有良好的感官品質(zhì)。對比實(shí)施例I
      改變破壁pH。在破壁前不用硫酸所調(diào)pH值,其它操作同實(shí)施例I 一樣操作。 結(jié)果谷膚甘肽的純含量為36. 85g,提取收率為31. 1%
      對比實(shí)施例2
      改變所用的洗脫劑,將I. 5%的HCl改為采用I. 5%NaCl為洗脫劑。其他操作同實(shí)施例I。結(jié)果提取收率為72. 4%,蛋白質(zhì)去除率40. 6%
      對比實(shí)施例3
      陽離子交換樹脂前不用調(diào)節(jié)PH值,其他操作同實(shí)施例1,結(jié)果離交后因雜質(zhì)太多,無法離交高峰的純度明顯下降,純含量只有38. 32%。對比實(shí)施例4
      依照實(shí)施例I方法,將谷胱甘肽低溫濃縮液進(jìn)行真空干燥,最終得到谷胱甘肽26. 43g,提取收率為22. 3%。對比實(shí)施例5
      對比其他的干燥方式,凍干的損失率最低,真空烘干損失率69. 3% ;鼓風(fēng)烘干損失率87. 7%。通過上述對比說明,本發(fā)明操作簡單、高效、費(fèi)用低廉、成品純度較高、環(huán)境污染小、易于工業(yè)化。
      權(quán)利要求
      1.一種從大腸桿菌懸浮液中提取谷胱甘肽的方法,其特征步驟如下 (1)用2±0·5moIH2SO4調(diào)節(jié)大腸桿菌懸浮液的pH值為2-3,經(jīng)過2. 5±0· 5MPa勻漿均質(zhì)機(jī)破壁得破壁好的懸浮液,所述的破壁時(shí)間為45-60min ; (2)將破壁好的懸浮液離心得到離心上清液,離心轉(zhuǎn)速為5000±100rpm,時(shí)間為10-15min ; (3)將離心上清液經(jīng)陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂連續(xù)吸附與解吸,收集富含谷胱甘肽的高峰液; (4)將谷胱甘肽高峰液進(jìn)行低溫濃縮成谷胱甘肽濃縮液,再將谷胱甘肽濃縮液冷凍干燥即得白色粉末狀谷胱甘肽成品。
      2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的從大腸桿菌懸浮液中提取谷胱甘肽的方法,其特征在于所述步驟3的陽離子交換樹脂是指將型號(hào)為DOOl陽離子交換樹脂裝柱,柱體積6cmX80cm,將離心上清液直接上柱,其上柱時(shí)pH值為2-3,流速為100ml/min,上樣直至飽和;用3_5倍柱體積的PH值為4. O的PBS緩沖液洗樹脂柱,將雜質(zhì)洗去,再用3-5倍柱體積的I. 5%HC1洗脫,其洗脫速度為100ml/min,洗脫收集DOOl陽離子高峰液。
      3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的從大腸桿菌懸浮液中提取谷胱甘肽的方法,其特征在于所述步驟3的陰離子交換樹脂是指將型號(hào)為D293陰離子交換樹脂裝柱,柱體積6cmX80cm,將DOOl陽離子高峰液直接上柱,速度為100ml/min,收集富含谷胱甘肽的高峰液。
      4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的從大腸桿菌懸浮液中提取谷胱甘肽的方法,其特征在于所述步驟4的低溫真空濃縮條件是真空度O. 9±0. IMPa,旋轉(zhuǎn)速度130±20 rpm,溫度350C _60°C,濃縮至谷胱甘肽高峰液重量百分濃度的8-10倍,得谷胱甘肽濃縮液。
      5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的從大腸桿菌懸浮液中提取谷胱甘肽的方法,其特征在于所述步驟4的冷凍干燥條件是將谷胱甘肽超濃縮液在-72±5°C下干燥28±2h,即得白色粉末狀谷胱甘肽成品。
      全文摘要
      本發(fā)明公開了一種從大腸桿菌中提取谷胱甘肽的方法,是通過調(diào)節(jié)大腸桿菌懸浮液的pH值、高壓勻質(zhì)破壁、離心分離得到上清液,再使用離子交換樹脂去除大分子雜質(zhì)和脂類色素,將離子交換純化液低溫濃縮后,冷凍干燥最終達(dá)到從大腸桿菌中分離純化還原型谷胱甘肽成品。制得谷胱甘肽成品GSH產(chǎn)品的純度95%以上、蛋白質(zhì)含量為1.3%、提取收率為86.5%。
      文檔編號(hào)C07K1/18GK102942615SQ20121041192
      公開日2013年2月27日 申請日期2012年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月25日
      發(fā)明者朱義福, 吳平剛, 周新榮 申請人:廣東肇慶星湖生物科技股份有限公司
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