專利名稱：一種高比活尿促卵泡素的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種尿促卵泡素的制備方法，具體的說是一種高比活尿促卵泡素的制備方法。
背景技術(shù)：
卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone, FSH)是由垂體前葉嗜堿性細(xì)胞合 成、分泌的一類糖蛋白，它由α鏈和β鏈兩個(gè)亞基組成。α亞基有85個(gè)氨基酸，β亞基有115個(gè)氨基酸，特異性由β亞基組成，總分子量約33000。FSH的β亞基由115個(gè)氨基酸組成，分子量約為18000，其中第7和24位置的天冬酰胺是發(fā)生N-糖基化的氨基酸。卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone, FSH)的主要生理功能是促進(jìn)卵泡的各種細(xì)胞生長、發(fā)育促進(jìn)卵泡細(xì)胞周圍間質(zhì)細(xì)胞分化為內(nèi)、外兩層泡膜細(xì)胞并合成黃體生成素(leuteinizing hormone,簡稱LH)受體；促進(jìn)卵泡顆粒細(xì)胞增生和顆粒細(xì)胞內(nèi)的芳香化酶系統(tǒng)活化，使雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素；促進(jìn)卵泡液分泌，使卵泡細(xì)胞逐漸增大。FSH主要針對排卵障礙引起的不孕癥，并廣泛應(yīng)用于人工受精、試管嬰兒等輔助生育技術(shù)中。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計(jì)，不育癥在育齡夫婦中發(fā)病率為8%，在我國估計(jì)每年新增200萬對不育夫婦，而且呈增長趨勢。目前，國內(nèi)高純度卵泡刺激素幾乎全部依賴進(jìn)口 ；日本本國還沒有廠家有能力生產(chǎn)高純度的卵泡刺激素原料；世界上尿促性素、卵泡刺激素的年銷售額約為10億美元，卵泡刺激素的銷售額約為5. 4億美元。含卵泡刺激素的第一代產(chǎn)品是尿促性素(HMG)，它是卵泡刺激素與黃體生成素比例約為1:1的混合物。對某些患者，黃體生成素水平過高會影響卵泡的正常發(fā)育，而且容易導(dǎo)致多囊卵巢綜合癥(Polycystic Ovarian Syndrome,簡稱P00S),引發(fā)月經(jīng)稀、無排卵、不孕及流產(chǎn)。因此，純卵泡刺激素比尿促性素更安全。雪蘭諾(Serono)公司的娩得定(MetiOdin)就是一種含極少黃體生成素的卵泡刺激素制劑。但Metrodin還是保留了很多雜蛋白，屬低純度產(chǎn)品。雜蛋白會導(dǎo)致一定的過敏反應(yīng)，增加注射痛苦。因此近來市場傾向于開發(fā)高比活的高純度FSH，但是目前多數(shù)制備FSH的生產(chǎn)工藝所得產(chǎn)品純度不高。如中國專利申請?zhí)朲L200410060631. 9的高純度尿卵泡刺激素的純化及生產(chǎn)工藝中描述了用染料親和層析(偶氮紅Sepharose 4B)和陽離子交換層析法得到卵泡刺激素效價(jià)不低于200國際單位/mg蛋白。中國專利申請?zhí)?00910048954. 9的一種高比活尿促卵泡刺激素及制備方法中描述了用陽離子交換色譜(SP Sepharose或CMSepharose)和染料親和色譜(Blue Sepharose FF或Blue Sepharose 6B)從卵泡刺激素比活315國際單位/mg蛋白的初始原料用磷酸鹽緩沖液溶解加工得到卵泡刺激素比活不低于7000國際單位/mg蛋白的產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對上述問題的不足，提供一種高比活尿促卵泡素的制備方法，其制備工藝方法簡單，操作方便，制得的尿促卵泡素其比活> 10000國際單位/mg蛋白，產(chǎn)品的活性高并且純度也高。本發(fā)明為解決上述問題所采用的技術(shù)方案是一種高比活尿促卵泡素的制備方法，所述的高比活尿促卵泡素的比活> 10000國際單位/mg蛋白；
所述的制備方法步驟為
步驟I、在20—60g的低純度尿促性素中加入pH值為7. 4的Tris-HCl平衡液，制得5—15L的混合液，后將混合液通過5L的抗黃體生成素抗體凝膠柱，收集吸附后的液體，得到吸附液，后用20— 60L的pH值為7. 4的Tris-HCl平衡液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液I，后將洗脫液I和吸附液，得到混合液，后將混合液通過截留分子量為IOKD的超濾膜進(jìn)行純化、濃縮，得到5 —15 L的濃縮液，備用；
步驟2、用濃度為10%的氫氧化鈉將步驟I中濃縮液的pH值調(diào)至7. 8，后將pH值為7. 8 的濃縮液I通過5L的陰離子交換色譜，用20—30L的pH值為7. 8的Tris-HCl平衡液進(jìn)行洗脫，收集洗脫后的液體，將洗脫后的液體放置在280nm處的紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測，當(dāng)OD值為O. 002時(shí)，收集洗脫液II，將洗脫液II通過截留分子量為IOKD的超濾膜進(jìn)行純化、濃縮，得到5 — 15L的餾分I，備用；
步驟3、用濃度為10%的醋酸將步驟2中餾分I的pH值調(diào)至4. 8，后將pH值為4. 8的餾分I通過2L的陽離子交換色譜，用pH值為4. 8的Tris-HCl平衡液洗滌陽離子交換色譜柱，棄去洗漆后的液體，后用pH值為4. 5、濃度為O. 3mol/L的醋酸銨洗脫陽離子交換色譜柱，收集洗脫后的液體，將洗脫后的液體放置在280nm處的紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測，當(dāng)OD值為O. 002時(shí)，收集洗脫液III，將洗脫液III通過截留分子量為IOKD的超濾膜進(jìn)行純化、濃縮，得到2 — 6L的餾分II，備用；
步驟4、用濃度為10%的氫氧化鈉將步驟3中餾分II的pH值調(diào)至9. 5，后將pH值為9. 5的餾分II通過藍(lán)色瓊脂糖凝膠染料親和色譜，后用pH值為9. 5、濃度為O. lmol/L的氯化鈉洗滌藍(lán)色瓊脂糖凝膠染料親和色譜，棄去洗滌后的液體，再用濃度為3mol/L的氯化鈉溶液洗脫藍(lán)色瓊脂糖凝膠染料親和色譜柱，收集洗脫后的液體，將洗脫后的液體放置在280nm處的紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測，當(dāng)OD值為O. 002時(shí)，收集洗脫液IV，將洗脫液IV通過截留分子量為IOKD的超濾膜進(jìn)行純化、濃縮，得到2L的餾分III，備用；
步驟5、將步驟4中的餾分III用無水乙醇進(jìn)行沉淀、脫水，得到產(chǎn)品；
所述的PH值為7. 4的Tris-HCl平衡液的組成成份每40ml的Tris-HCl平衡液中含有10. Oml濃度為O. 2mol/L的三羥甲基氨基甲烷(Tris)溶液、17. Oml濃度為O. 2mol/L的HCl 和 13. Oml 的水；
所述的PH值為7. 8的Tris-HCl平衡液的組成成份每40ml的Tris-HCl平衡液中含有10. Oml濃度為O. 2mol/L的三羥甲基氨基甲烷(Tris)溶液、14. Oml濃度為O. lmol/L的HCl 和 16. Oml 的水；
所述的PH值為4. 8的Tris-HCl平衡液的組成成份每40ml的Tris-HCl平衡液中含有10. Oml濃度為O. 2mol/L的三羥甲基氨基甲烷(Tris)溶液、22. Oml濃度為lmol/L的HCl和8. Oml的水。所述的陰離子交換色譜的活性基團(tuán)為二乙胺基乙基纖維素、磺酸基、三乙胺、一NH2或一 NH3中的任意一種。有益效果本發(fā)明的制備方法是經(jīng)過長期研究，發(fā)現(xiàn)免疫親和層析、染料親和層析、離子交換層析等方法對于分離純化各有其特定的范圍，按本發(fā)明中的組合方式所制備得到的卵泡刺激素純度高，其比活彡10000國際單位/mg蛋白。本發(fā)明中采用比活為60國際單位/mg蛋白的卵泡刺激素作為初始原料，用三羥甲基氨基甲烷溶液(Tris-HCl)溶解加工得到卵泡刺激素比活不低于10000國際單位/mg蛋白的產(chǎn)品。三羥甲基氨基甲烷溶液是蛋白的良好溶劑，比常規(guī)的磷酸鹽緩沖溶液更適用于蛋白純化，應(yīng)用于本制備方法可取得更好的吸附效率。本制備方法選用工藝單元的組合具有獨(dú)創(chuàng)新穎性， 而且在每個(gè)工藝單元使用的材料和工藝條件都具有獨(dú)創(chuàng)性，與已往相關(guān)報(bào)道中，其所使用的材料成本降低，制備工藝條件提高，同時(shí)制備方法比以往的制備方法簡單，得到的產(chǎn)品純度高，比活性大。通過本發(fā)明的制備方法得到卵泡刺激素，其純度高，比活> 10000國際單位/mg蛋白，超過以往的任何公開報(bào)道。
具體實(shí)施例方式一種高比活尿促卵泡素的制備方法，所述的高比活尿促卵泡素的比活> 10000國際單位/mg蛋白；
所述的制備方法步驟為
步驟I、在20—60g的低純度尿促性素中加入pH值為7. 4的Tris-HCl平衡液，制得5—15L的混合液，后將混合液通過5L的抗黃體生成素抗體凝膠柱，收集吸附后的液體，得到吸附液，后用20— 60L的pH值為7. 4的Tris-HCl平衡液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液I，后將洗脫液I和吸附液，得到混合液，后將混合液通過截留分子量為IOKD的超濾膜進(jìn)行純化、濃縮，得到5 —15 L的濃縮液，備用；
步驟2、用濃度為10%的氫氧化鈉將步驟I中濃縮液的pH值調(diào)至7. 8，后將pH值為7. 8的濃縮液I通過5L的陰離子交換色譜，用20—30L的pH值為7. 8的Tris-HCl平衡液進(jìn)行洗脫，收集洗脫后的液體，將洗脫后的液體放置在280nm處的紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測，當(dāng)OD值為O. 002時(shí)，收集洗脫液II，將洗脫液II通過截留分子量為IOKD的超濾膜進(jìn)行純化、濃縮，得到5 — 15L的餾分I，備用；
步驟3、用濃度為10%的醋酸將步驟2中餾分I的pH值調(diào)至4. 8，后將pH值為4. 8的餾分I通過2L的陽離子交換色譜，用pH值為4. 8的Tris-HCl平衡液洗滌陽離子交換色譜柱，棄去洗漆后的液體，后用pH值為4. 5、濃度為O. 3mol/L的醋酸銨洗脫陽離子交換色譜柱，收集洗脫后的液體，將洗脫后的液體放置在280nm處的紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測，當(dāng)OD值為O. 002時(shí)，收集洗脫液III，將洗脫液III通過截留分子量為IOKD的超濾膜進(jìn)行純化、濃縮，得到2 — 6L的餾分II，備用；
步驟4、用濃度為10%的氫氧化鈉將步驟3中餾分II的pH值調(diào)至9. 5，后將pH值為9. 5的餾分II通過藍(lán)色瓊脂糖凝膠染料親和色譜，后用pH值為9. 5、濃度為O. lmol/L的氯化鈉洗滌藍(lán)色瓊脂糖凝膠染料親和色譜，棄去洗滌后的液體，再用濃度為3mol/L的氯化鈉溶液洗脫藍(lán)色瓊脂糖凝膠染料親和色譜柱，收集洗脫后的液體，將洗脫后的液體放置在280nm處的紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測，當(dāng)OD值為O. 002時(shí)，收集洗脫液IV，將洗脫液IV通過截留分子量為IOKD的超濾膜進(jìn)行純化、濃縮，得到2L的餾分III，備用；步驟5、將步驟4中的餾分III用無水乙醇進(jìn)行沉淀、脫水，得到產(chǎn)品；
所述的PH值為7. 4的Tris-HCl平衡液的組成成份每40ml的Tris-HCl平衡液中含有10. Oml濃度為O. 2mol/L的三羥甲基氨基甲烷(Tris)溶液、17. Oml濃度為O. 2mol/L的HCl 和 13. Oml 的水；
所述的PH值為7. 8的Tris-HCl平衡液的組成成份每40ml的Tris-HCl平衡液中含有10. Oml濃度為O. 2mol/L的三羥甲基氨基甲烷(Tris)溶液、14. Oml濃度為O. lmol/L的HCl 和 16. Oml 的水。 所述的陰離子交換色譜的活性基團(tuán)為二乙胺基乙基纖維素、磺酸基、三乙胺、一NH2或一 NH3中的任意一種。實(shí)施例一
一種高比活尿促卵泡素的制備方法，所述的制備方法步驟為
步驟I、在20g的低純度尿促性素中加入pH值為7. 4的TriS-HCl平衡液，其中卵泡刺激素的生物效價(jià)為60IU/mg，黃體生成素的生物學(xué)效價(jià)55IU/mg，混合均勻，制得5L的混合液體，后將混合液體通過5L的抗黃體生成素抗體凝膠柱，黃體生成素與抗黃體生成素抗體凝膠柱上的抗體結(jié)合，黃體生成素吸附在抗黃體生成素抗體凝膠柱上，而卵泡刺激素則留在吸附后的液體中，收集吸附液，后用20L的pH值為7. 4的Tris-HCl平衡液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液I，后將洗脫液I和吸附液，得到混合液，后將混合液通過截留分子量為IOKD的超濾膜進(jìn)行純化、濃縮，得到5 L含有卵泡刺激素有效成份的濃縮液，備用；
步驟2、用濃度為10%的氫氧化鈉將步驟I中濃縮液的pH值調(diào)至7. 8，后將pH值為7. 8的濃縮液I通過5L的DEAE Sepharose FF,用20L的pH值為7. 8的Tris-HCl平衡液進(jìn)行洗脫，收集洗脫后的液體，將洗脫后的液體放置在280nm處的紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測，當(dāng)OD值為O. 002時(shí)，收集洗脫液II，將洗脫液II通過截留分子量為IOKD的超濾膜進(jìn)行純化、濃縮，得到5L的餾分I，備用；
步驟3、用濃度為10%的醋酸將步驟2中餾分I的pH值調(diào)至4. 8，后將pH值為4. 8的餾分I通過2L的SP Sepharose FF，用pH值為4. 8的Tris-HCl平衡液洗滌陽離子交換色譜柱，棄去洗漆后的液體，后用pH值為4. 5、濃度為O. 3mol/L的醋酸銨洗脫陽離子交換色譜柱，收集洗脫后的液體，將洗脫后的液體放置在280nm處的紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測，當(dāng)OD值為O. 002時(shí)，收集洗脫液III，將洗脫液III通過截留分子量為IOKD的超濾膜進(jìn)行純化、濃縮，得到2L的餾分II，備用；
步驟4、用濃度為10%的氫氧化鈉將步驟3中餾分II的pH值調(diào)至9. 5，后將pH值為9. 5的餾分II通過藍(lán)色瓊脂糖凝膠染料親和色譜，后用pH值為9. 5、濃度為O. lmol/L的氯化鈉洗滌藍(lán)色瓊脂糖凝膠染料親和色譜，棄去洗滌后的液體，再用濃度為3mol/L的氯化鈉溶液洗脫藍(lán)色瓊脂糖凝膠染料親和色譜柱，收集洗脫后的液體，將洗脫后的液體放置在280nm處的紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測，當(dāng)OD值為O. 002時(shí)，收集洗脫液IV，將洗脫液IV通過截留分子量為IOKD的超濾膜進(jìn)行純化、濃縮，得到2L的餾分III，備用；
步驟5、將步驟4中的餾分III用無水乙醇進(jìn)行沉淀、脫水，得到比活為12856國際單位/mg蛋白的尿促卵泡素，其中卵泡刺激素的生物效價(jià)為11442 IU/mg,黃體生成素的生物學(xué)效價(jià) 56IU/mg。實(shí)施例二一種高比活尿促卵泡素的制備方法，所述的制備方法步驟為
步驟I、在40g的低純度尿促性素中加入pH值為7. 4的TriS-HCl平衡液，其中卵泡刺激素的生物效價(jià)為65 IU/mg,黃體生成素的生物學(xué)效價(jià)60 IU/mg,混合均勻，制得IOL的混合液體，后將混合液體通過IOL的抗黃體生成素抗體凝膠柱，黃體生成素與抗黃體生成素抗體凝膠柱上的抗體結(jié)合,黃體生成素吸附在抗黃體生成素抗體凝膠柱上,而卵泡刺激素則留在吸附后的液體中，收集吸附液，后用40L的pH值為7. 4的Tris-HCl平衡液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液I，后將洗脫液I和吸附液，得到混合液，后將混合液通過截留分子量為IOKD的超濾膜進(jìn)行純化、濃縮，得到10 L含有卵泡刺激素有效成份的濃縮液，備用；
步驟2、用濃度為10%的氫氧化鈉將步驟I中濃縮液的pH值調(diào)至7. 8，后將pH值為7. 8的濃縮液I通過5L的苯乙烯系膦酸樹脂S印harose FF,用25L的pH值為7. 8的Tris-HCl平衡液進(jìn)行洗脫，收集洗脫后的液體，將洗脫后的液體放置在280nm處的紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測，當(dāng)OD值為O. 002時(shí)，收集洗脫液II，將洗脫液II通過截留分子量為IOKD的超濾膜進(jìn)行純化、濃縮，得到IOL的餾分I，備用；
步驟3、用濃度為10%的醋酸將步驟2中餾分I的pH值調(diào)至4. 8，后將pH值為4. 8的餾分I通過2L的SP Sepharose FF，用pH值為4. 8的Tris-HCl平衡液洗滌陽離子交換色譜柱，棄去洗漆后的液體，后用pH值為4. 5、濃度為O. 3mol/L的醋酸銨洗脫陽離子交換色譜柱，收集洗脫后的液體，將洗脫后的液體放置在280nm處的紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測，當(dāng)OD值為O. 002時(shí)，收集洗脫液III，將洗脫液III通過截留分子量為IOKD的超濾膜進(jìn)行純化、濃縮，得到4L的餾分II，備用；
步驟4、用濃度為10%的氫氧化鈉將步驟3中餾分II的pH值調(diào)至9. 5，后將pH值為9. 5的餾分II通過藍(lán)色瓊脂糖凝膠染料親和色譜，后用pH值為9. 5、濃度為O. lmol/L的氯化鈉洗滌藍(lán)色瓊脂糖凝膠染料親和色譜，棄去洗滌后的液體，再用濃度為3mol/L的氯化鈉溶液洗脫藍(lán)色瓊脂糖凝膠染料親和色譜柱，收集洗脫后的液體，將洗脫后的液體放置在280nm處的紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測，當(dāng)OD值為O. 002時(shí)，收集洗脫液IV，將洗脫液IV通過截留分子量為IOKD的超濾膜進(jìn)行純化、濃縮，得到2L的餾分III，備用；
步驟5、將步驟4中的餾分III用無水乙醇進(jìn)行沉淀、脫水，得到比活為14156國際單位/mg蛋白的尿促卵泡素，其中卵泡刺激素的生物效價(jià)為12542 IU/mg，黃體生成素的生物學(xué)效價(jià) 59IU/mg。 實(shí)施例三
一種高比活尿促卵泡素的制備方法，所述的制備方法步驟為
步驟I、在60g的低純度尿促性素中加入pH值為7. 4的TriS-HCl平衡液，其中卵泡刺激素的生物效價(jià)為70IU/mg，黃體生成素的生物學(xué)效價(jià)65IU/mg，混合均勻，制得15L的混合液體，后將混合液體通過5L的抗黃體生成素抗體凝膠柱，黃體生成素與抗黃體生成素抗體凝膠柱上的抗體結(jié)合，黃體生成素吸附在抗黃體生成素抗體凝膠柱上，而卵泡刺激素則留在吸附后的液體中，收集吸附液，后用60L的pH值為7. 4的Tris-HCl平衡液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液I，后將洗脫液I和吸附液，得到混合液，后將混合液通過截留分子量為IOKD的超濾膜進(jìn)行純化、濃縮，得到15 L含有卵泡刺激素有效成份的濃縮液，備用；
步驟2、用濃度為10%的氫氧化鈉將步驟I中濃縮液的pH值調(diào)至7. 8，后將pH值為7. 8的濃縮液I通過5L的三乙胺S印harose FF,用30L的pH值為7. 8的Tris-HCl平衡液進(jìn)行洗脫，收集洗脫后的液體，將洗脫后的液體放置在280nm處的紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測，當(dāng)OD值為O. 002時(shí)，收集洗脫液II，將洗脫液II通過截留分子量為IOKD的超濾膜進(jìn)行純化、濃縮，得到15L的餾分I，備用；
步驟3、用濃度為10%的醋酸將步驟2中餾分I的pH值調(diào)至4. 8，后將pH值為4. 8的餾分I通過2L的SP Sepharose FF，用pH值為4. 8的Tris-HCl平衡液洗滌陽離子交換色譜柱，棄去洗漆后的液體，后用pH值為4. 5、濃度為O. 3mol/L的醋酸銨洗脫陽離子交換色譜柱，收集洗脫后的液體，將洗脫后的液體放置在280nm處的紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測，當(dāng)OD值為O. 002時(shí)，收集洗脫液III，將洗脫液III通過截留分子量為IOKD的超濾膜進(jìn)行純化、濃縮，得到6L的餾分II，備用；
步驟4、用濃度為10%的氫氧化鈉將步驟3中餾分II的pH值調(diào)至9. 5，后將pH值為9. 5的餾分II通過藍(lán)色瓊脂糖凝膠染料親和色譜，后用pH值為9. 5、濃度為O. lmol/L的氯化鈉洗滌藍(lán)色瓊脂糖凝膠染料親和色譜，棄去洗脫后的液體，再用濃度為3mol/L的氯化鈉溶液洗脫藍(lán)色瓊脂糖凝膠染料親和色譜柱，收集洗脫后的液體，將洗脫后的液體放置在280nm處的紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測，當(dāng)OD值為O. 002時(shí)，收集洗脫液IV，將洗脫液IV通過截留分子量為IOKD的超濾膜進(jìn)行純化、濃縮，得到2L的餾分III，備用；
步驟5、將步驟4中的餾分III用無水乙醇進(jìn)行沉淀、脫水，得到比活為比活為15326國際單位/mg蛋白的尿促卵泡素，其中卵泡刺激素的生物效價(jià)為13159 IU/mg，黃體生成素的生物學(xué)效價(jià)62IU/mg。。所述的pH值為7. 4的Tris-HCl平衡液的組成成份每40ml的Tris-HCl平衡液中含有10. Oml濃度為O. 2mol/L的三羥甲基氨基甲烷(Tris)溶液、17. Oml濃度為O. 2mol/L的HCl和13. Oml的水；
所述的PH值為7. 8的Tris-HCl平衡液的組成成份每40ml的Tris-HCl平衡液中含有10. Oml濃度為O. 2mol/L的三羥甲基氨基甲烷(Tris)溶液、14. Oml濃度為O. lmol/L的HCl 和 16. Oml 的水；
在本發(fā)明中所用的陰離子交換色譜不限于使用SP Sepharose FF ；
在本發(fā)明中所用的染料親和層析不限于使用Blue Sepharose 4B ；
在本發(fā)明中尿促卵泡素和黃體生成素的生物效價(jià)均按中國藥典2010版的檢驗(yàn)方法進(jìn)行檢測；
在本發(fā)明中尿促卵泡素比活的測定方法，按照國際公開的Lowry法對得到的卵泡刺激素溶液進(jìn)行測定，得到卵泡刺激素中的蛋白濃度，后依據(jù)公式測得尿促卵泡素比活
權(quán)利要求
1.一種高比活尿促卵泡素的制備方法，其特征在于所述的高比活尿促卵泡素的比活≥10000國際單位/mg蛋白； 所述的制備方法步驟為 步驟I、在20—60g的低純度尿促性素中加入pH值為7. 4的Tris-HCl平衡液，制得5—15L的混合液，后將混合液通過5L的抗黃體生成素抗體凝膠柱，收集吸附后的液體，得到吸附液，后用20— 60L的pH值為7. 4的Tris-HCl平衡液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液I，后將洗脫液I和吸附液，得到混合液，后將混合液通過截留分子量為IOKD的超濾膜進(jìn)行純化、濃縮，得到5 —15 L的濃縮液，備用； 步驟2、用濃度為10%的氫氧化鈉將步驟I中濃縮液的pH值調(diào)至7. 8，后將pH值為7. 8的濃縮液I通過5L的陰離子交換色譜，用20—30L的pH值為7. 8的Tris-HCl平衡液進(jìn)行洗脫，收集洗脫后的液體，將洗脫后的液體放置在280nm處的紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測，當(dāng)OD值為O. 002時(shí)，收集洗脫液II，將洗脫液II通過截留分子量為IOKD的超濾膜進(jìn)行純化、濃縮，得到5 — 15L的餾分I，備用； 步驟3、用濃度為10%的醋酸將步驟2中餾分I的pH值調(diào)至4. 8，后將pH值為4. 8的餾分I通過2L的陽離子交換色譜，用pH值為4. 8的Tris-HCl平衡液洗滌陽離子交換色譜柱，棄去洗漆后的液體，后用pH值為4. 5、濃度為O. 3mol/L的醋酸銨洗脫陽離子交換色譜柱，收集洗脫后的液體，將洗脫后的液體放置在280nm處的紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測，當(dāng)OD值為O. 002時(shí)，收集洗脫液III，將洗脫液III通過截留分子量為IOKD的超濾膜進(jìn)行純化、濃縮，得到2 — 6L的餾分II，備用； 步驟4、用濃度為10%的氫氧化鈉將步驟3中餾分II的pH值調(diào)至9. 5，后將pH值為9. 5的餾分II通過藍(lán)色瓊脂糖凝膠染料親和色譜，后用pH值為9. 5、濃度為O. lmol/L的氯化鈉洗滌藍(lán)色瓊脂糖凝膠染料親和色譜，棄去洗滌后的液體，再用濃度為3mol/L的氯化鈉溶液洗脫藍(lán)色瓊脂糖凝膠染料親和色譜柱，收集洗脫后的液體，將洗脫后的液體放置在280nm處的紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測，當(dāng)OD值為O. 002時(shí)，收集洗脫液IV，將洗脫液IV通過截留分子量為IOKD的超濾膜進(jìn)行純化、濃縮，得到2L的餾分III，備用； 步驟5、將步驟4中的餾分III用無水乙醇進(jìn)行沉淀、脫水，得到產(chǎn)品； 所述的PH值為7. 4的Tris-HCl平衡液的組成成份每40ml的Tris-HCl平衡液中含有10. Oml濃度為O. 2mol/L的三羥甲基氨基甲烷(Tris)溶液、17. Oml濃度為O. 2mol/L的HCl 和 13. Oml 的水； 所述的PH值為7. 8的Tris-HCl平衡液的組成成份每40ml的Tris-HCl平衡液中含有10. Oml濃度為O. 2mol/L的三羥甲基氨基甲烷(Tris)溶液、14. Oml濃度為O. lmol/L的HCl 和 16. Oml 的水； 所述的PH值為4. 8的Tris-HCl平衡液的組成成份每40ml的Tris-HCl平衡液中含有10. Oml濃度為O. 2mol/L的三羥甲基氨基甲烷(Tris)溶液、22. Oml濃度為lmol/L的HCl和8. Oml的水。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種高比活尿促卵泡素的制備方法，其特征在于所述的陰離子交換色譜的活性基團(tuán)為二乙胺基乙基纖維素、磺酸基、三乙胺、苯乙烯系膦酸樹脂、一NH2或一 NH3中的任意一種。
全文摘要
一種高比活尿促卵泡素的制備方法，在低純度尿促性素中加入pH值為7.4的Tris-HCl平衡液，后通過抗黃體生成素抗體凝膠柱，后進(jìn)行純化、濃縮，后依次通過陰離子交換色譜、陽離子交換色譜和藍(lán)色瓊脂糖凝膠染料親和色譜，收集洗滌后的液體，將洗滌后的液體在280nm處的紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測，當(dāng)OD值為0.002時(shí)，收集洗滌液并進(jìn)行純化、濃縮，后用無水乙醇進(jìn)行沉淀、脫水，得到比活≥10000國際單位/mg蛋白的高比活尿促卵泡素。本發(fā)明提供的一種高比活尿促卵泡素的制備方法，其制備工藝方法簡單，操作方便，制得的尿促卵泡素其比活≥10000國際單位/mg蛋白，產(chǎn)品的活性高并且純度也高。
文檔編號C07K1/22GK102924588SQ20121041415
公開日2013年2月13日 申請日期2012年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月26日
發(fā)明者申恒海, 錢興澤, 梁云愛, 杜安生 申請人:日照新康生物科技有限公司