專利名稱：一種萊克多巴胺單克隆抗體的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及免疫化學技術領域，尤其涉及一種萊克多巴胺單克隆抗體的制備方法。
背景技術：
萊克多巴胺(RAC)為β2_受體激動劑，與其他興奮劑類藥物如克倫特羅、卡布特羅、沙丁胺醇等具有類似結構，對體內(nèi)代謝的作用較強，能降低脂肪的生成和促進脂肪的分解，促進蛋白質(zhì)合成并減少其降解；還能促進胰島素的釋放，使糖原分解增加，因此能利用合成脂肪的能量和成分來增加蛋白質(zhì)的合成。近年來由于加大了打擊非法使用克倫特羅的力度，使其同類藥物RAC的非法添加日趨嚴重，盡管我國政府頒布了各種法令嚴禁將RAC等β 2_激動劑作為動物促生長劑使用，但是由于經(jīng)濟利益的驅(qū)使，違法濫用RAC等β2-激動劑的現(xiàn)象仍非常普遍，各類中毒事件時有發(fā)生。RAC長期使用后易在動物組織，特別是內(nèi)臟中積聚殘留，并通過食物鏈進入人體引起中毒癥狀，能使骨骼肌收縮增強，破壞快縮肌和慢縮肌纖維間的融合現(xiàn)象，引發(fā)肌肉震顫。其他中毒癥狀包括面色潮紅、心動過速、心率失常、胸悶、腹痛、肌肉疼痛、四肢麻木、惡心、頭痛和暈眩等。對患有高血壓、青光眼、糖尿病、前列腺肥大等疾病的患者危害更大，嚴重的可能危及生命。RAC在牲畜體內(nèi)吸收代謝較快，一般不易蓄積，體內(nèi)RAC的含量很低，一般為ng級。目前RAC的檢測技術主要有色譜技術和免疫分析技術等。色譜技術為經(jīng)典技術，主要有高效液相色譜(HPLC)，高效液相色譜/熒光(HPLC/FLD)，液相色譜-質(zhì)譜連用(LC-MS)，氣相色譜-質(zhì)譜連用(GC-MS)，高效毛細管電泳(HPCE)等方法。免疫分析技術主要有酶免疫技術、免疫生物傳感器技術、金標免疫層析技術及新興的生物芯片技術。色譜技術靈敏準確，但是樣品處理繁瑣費時，成本高，所需儀器設備昂貴，一次檢測樣品量少，檢測時間長，而且需要有經(jīng)過專門訓練的專業(yè)人員來操作復雜的儀器設備，不易普及，僅作為少數(shù)實驗室的確證方法。免疫分析技術具有敏感、特異且一次能檢測大量樣品、滿足現(xiàn)場和快速檢測的要求。已成為前期篩查的主要手段。由于作為半抗原的萊克多巴胺本身不能誘導機體產(chǎn)生抗體，必須將其與載體蛋白偶聯(lián)獲得人工合成的完全抗原才具有抗原性。而小分子抗原與載體蛋白的偶聯(lián)效果及細胞融合后陽性克隆的篩選都直接影響著抗體的制備效果，是抗體制備的關鍵。目前，RAC與載體的連接方法主要有多元酸酐與混合酸酐聯(lián)用法和1，4_ 丁二醇二縮水甘油醚法，這些方法改造位點均為萊克多巴胺的活性位點，在這些部位引入連接臂會影響到萊克多巴胺的電子分布和空間位阻，因此會不同程度造成免疫所得萊克多巴胺抗體特異性降低。為了建立萊克多巴胺酶免疫分析方法，需要制備特異性強、可大量生產(chǎn)的萊克多巴胺的單克隆抗體。但目前制備所得的萊克多巴胺的單克隆抗體特異性不強，也無法大量生產(chǎn)。因此，目前制備的萊克多巴胺的單克隆抗體存在假陽性、假陰性偏高，特異性不強，無法大量生產(chǎn)等問題。

發(fā)明內(nèi)容
為解決現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明提供一種萊克多巴胺的單克隆抗體的制備方法，利用該方法生產(chǎn)的萊克多巴胺單克隆抗體靈敏度高、特異性強，可應用于萊克多巴胺的檢測中，滿足實際應用的需要。本發(fā)明的技術方案是提供一種萊克多巴胺的單克隆抗體的制備方法，包括如下步驟A)制備完全抗原RAC-BSA和包被原RAC-OVA Ca)將萊克多巴胺，即RAC溶解在四氫呋喃水溶液中，先后加入苯甲氧羰琥珀酰亞胺和碳酸氫鈉，攪拌12小時后用乙酸乙酯萃取，取有機相減壓除去溶劑，過硅膠層析柱，收集中間產(chǎn)物A ; (b)將所述中間產(chǎn)物A溶解在二氯甲烷中，冷卻至0°C，加入三乙胺和叔丁基二甲基氯硅烷，升至室溫反應12h后加水，再用二氯甲烷萃取，取有機相減壓除去溶劑，得到化合物B ; (c )將所述化合物B溶解在二氯甲烷中，冷卻至- I (TC，先后加入三苯基膦、咪唑和N-溴代丁二酰亞胺，攪拌30min后加入飽和氯化銨溶液，再用二氯甲烷萃取，取有機相減壓除去溶劑，得到化合物C ;(d)將6-羥基己烷甲酸甲酯溶解在N，N- 二甲基甲酰胺中，冷卻至0°C，加入NaH，攪拌lOmin，得到混合液，將所述化合物C溶解在N，N-二甲基甲酰胺中，再加入到所述混合液中，攪拌IOh后減壓除 去N，N-二甲基甲酰胺，用乙酸乙酯萃取，取有機相減壓除去溶劑，得到化合物D ;(e)將所述化合物D溶解在甲醇水溶液中，冷卻至0°C，加入LiOH,反應Ih后減壓除去甲醇，用HCl調(diào)節(jié)PH至3，用乙酸乙酯萃取，取有機相減壓除去溶劑，得到化合物E ; (f)將所述化合物E溶解在甲醇中，加入催化量的Pd/C，密閉反應體系，用氫氣換氣3次，反應Ih后過濾Pd/C，減壓除去甲醇，得化合物F ；(g)將所述化合物F溶解在四氫呋喃，冷卻至0°C，加入四丁基氟化銨，反應2h后減壓除去四氫呋喃，過柱提純產(chǎn)品，得到化合物G ； (h)將所述化合物G溶解在N，N- 二甲基甲酰胺中，冷卻至0°C，加入三乙胺和牛血清白蛋白，即BSA，待BSA完全溶解后加入二環(huán)己基碳二亞胺，攪拌24h，減壓除去N，N-二甲基甲酰胺，先后用水和乙醇洗滌，得到固體產(chǎn)物即為RAC-BSA ; (i)將所述化合物G溶解在N，N- 二甲基甲酰胺中，冷卻至(TC，加入三乙胺和卵清蛋白，即OVAJt OVA完全溶解后加入二環(huán)己基碳二亞胺，攪拌24h，減壓除去N，N-二甲基甲酰胺，先后用水和乙醇洗滌，得到固體產(chǎn)物即為RAC-OVA ;B)動物免疫采用Balb/c小鼠作為免疫動物，所述RAC-BSA與等體積弗氏完全佐劑乳化后作為第一次免疫原，所述RAC-BSA與等體積快速鼠單抗制備佐劑乳化后作為第二、三、四次免疫原，每次免疫劑量為25飛Oug/只小鼠，共免疫四次；C)沖擊免疫所述免疫結束后1(Γ15天，用間接ELISA法測血清抗體效價，選取所述血清效價高的小鼠進行沖擊免疫，所述沖擊免疫的劑量為5(Tl00Ug/只；D)制備雜交瘤細胞所述沖擊免疫結束后三天，取接受過沖擊免疫的小鼠的脾細胞，以PEG4000作融合劑，將免疫脾細胞與骨髓瘤細胞按數(shù)量比為5 :1進行細胞融合，選取陽性克隆進行亞克隆，得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株；E)制備腹水并純化萊克多巴胺單克隆抗體用滅菌石蠟致敏Balb/c小鼠，所述致敏結束7天后分別對每組小鼠腹腔注射所述雜交瘤細胞，7^10天后采集腹水，采用飽和硫酸銨法純化腹水，再用DEAE弱陰離子交換樹脂進一步純化，得到純化后的單克隆抗體，即萊克多巴胺單克隆抗體。步驟B)中RAC-BSA與等體積弗氏完全佐劑乳化后作為第一次免疫原，RAC-BSA與等體積快速鼠單抗制備佐劑乳化后作為第二、三、四次免疫原，使用佐劑變換的原因是如果完全用快速鼠單抗制備佐劑，會提高成本；完全用弗氏完全佐劑則需要較長的時間，而且抗原需求量大；兩者在合適的時間結合使用既可以節(jié)約成本，又可以節(jié)省時間。步驟E)中采用飽和硫酸銨法純化腹水，再用DEAE弱陰離子交換樹脂進一步純化，而不是采用傳統(tǒng)的親和層析方法，優(yōu)點是可以減少對抗體活性的損害，并且可以提高抗體純度。
作為本發(fā)明的進一步改進是步驟A)中所述制備完全抗原RAC-BSA和包被原RAC-OVA是采用醚化反應將萊克多巴胺芐醇基團的羥基連接上6-羥基己烷甲酸甲酯制備半抗原，再經(jīng)過縮合反應制得萊克多巴胺與載體蛋白復合物；與目前常用的RAC與載體的連接方法多元酸酐與混合酸酐聯(lián)用法和1，4_ 丁二醇二縮水甘油醚法相比，該方法不會改造萊克多巴胺的活性位點，不會影響到萊克多巴胺的電子分布和空間位阻，因此不會造成免疫所得萊克多巴胺抗體特異性降低。作為本發(fā)明的進一步改進是步驟B)中所述Balb/c小鼠為8 12周鼠齡的健康雄性Balb/c小鼠，選取該雄性青年小鼠的優(yōu)點是小鼠免疫反應強烈，易于高效價高親和力抗體的生成。作為本發(fā)明的進一步改進是步驟B)中所述第二、三、四次免疫的時間分別是所述第一次免疫后的第30、50、65天，免疫程序中時間的間隔有利于免疫效果的提高和高效價高親和力抗體的生成。作為本發(fā)明的進一步改進是步驟C)中所述沖擊免疫的免疫原是RAC-BSA，不加任何佐劑，易于聞效價聞未和力抗體的生成。作為本發(fā)明的進一步改進是步驟D)中所述PEG4000融合劑為預熱至42°C的質(zhì)量分數(shù)為50% PEG4000，在此條件下免疫脾細胞與骨髓瘤細胞融合效果較好。作為本發(fā)明的進一步改進是步驟E)中所述Balb/c小鼠為生育一次的雌性青年小鼠，優(yōu)點是雌性小鼠腹膜彈性較好，尤其已育小鼠，產(chǎn)生腹水的量更多。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是運用特殊免疫方式，抗體效價較高，相對縮減下游產(chǎn)品開發(fā)的成本；利用本發(fā)明提供的制備方法制得的萊克多巴胺單克隆抗體靈敏度高、特異性強，可應用于萊克多巴胺的檢測中，假陽性、假陰性比率顯著降低，滿足實際應用的需要。


圖I為制備完全抗原與包被原的相同中間產(chǎn)物G的合成路線示意 圖2為RAC-BSA偶聯(lián)物、RAC、BSA的紫外掃描光譜示意 圖3為RAC-OVA偶聯(lián)物、RAC, OVA的紫外掃描光譜示意 圖4為間接ELISA測定抗體效價結果示意 圖5為間接競爭ELISA測定IC50的回歸曲線示意圖。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。實施例一完全抗原與包被原的制備與檢測。I、完全抗原的制備與檢測。a.完全抗原的制備，包括如下步驟(1)將IOmol萊克多巴胺溶解在25mlTHF (四氫呋喃)和25ml純水中，先后加入IOmolCbzOSU (苯甲氧羰琥珀酰亞胺)和20mol NaHCO3，攪拌12小時后用150ml乙酸乙酯萃取，取有機相用旋轉蒸發(fā)儀減壓除去溶劑，過硅膠層析柱，收集中間產(chǎn)物A ；
(2)將IOmol所述中間產(chǎn)物A溶解在50mlDCM (二氯甲烷)中，冷卻至(TC，加入25mol三乙胺和20mol TBS-Cl (叔丁基二甲基氯硅烷)，升至室溫反應12h，反應結束后加入IOOml水，再用200ml DCM萃取，取有機相用旋轉蒸發(fā)儀減壓除去溶劑，得到化合物B ;
(3)將IOmol所述化合物B溶解在50mlDCM中，冷卻至_10°C，先后加入15mol三苯基膦、15mol咪唑和15mol NBS (N-溴代丁二酰亞胺)，攪拌30min后加入15ml飽和氯化銨溶液，再用IOOml DCM萃取，取有機相用旋轉蒸發(fā)儀減壓除去溶劑，得到化合物C ;
(4)將IOmol6-羥基己烷甲酸甲酯溶解在50ml DMF (N，N_ 二甲基甲酰胺)中，冷卻至(TC，加入IOmol的NaH，攪拌lOmin，得到混合液，將IOmol所述化合物C溶解在5ml DMF中， 再加入到所述混合液中，攪拌10h，反應結束后減壓除去DMF，用200ml EA (乙酸乙酯)萃取，取有機相用旋轉蒸發(fā)儀減壓除去溶劑，得到化合物D ；
(5)將IOmol所述化合物D溶解在20ml水和20ml甲醇中，冷卻至(TC，加入15molLiOH,反應Ih后減壓除去甲醇，用IN HCl調(diào)節(jié)pH至3，用200ml EA分三次萃取，取有機相用旋轉蒸發(fā)儀減壓除去溶劑，得到化合物E ;
(6)將IOmol所述化合物E溶解在50ml甲醇中，加入催化量的Pd/C，密閉反應體系，用氫氣換氣3次，反應Ih后過濾Pd/C，減壓除去甲醇，得化合物F ；
(7)將IOmol所述化合物F溶解在50mlTHF中，冷卻至(TC，加入12mol TBAF (四丁基氟化銨)，反應2h，反應結束后減壓除去THF，過柱提純產(chǎn)品，得到化合物G ；
(8)將IOmol所述化合物G溶解在DMF中冷卻至0°C，加入IOmolEt3N (三乙胺)和O. 2mol BSA (牛血清白蛋白)，待BSA完全溶解后加入IOmol DCC (二環(huán)己基碳二亞胺)，攪拌24h,減壓除去DMF，將剩余固體物質(zhì)溶于水中，抽濾，收集濾液并加入體積分數(shù)為40%的乙醇，充分混勻后抽濾，用乙醇洗滌，收集固體并減壓除去乙醇，得到固體產(chǎn)物即為RAC-BSA。步驟(I)- (7)的合成路線示意圖如圖I所示。b. RAC-BSA 的檢測
采用紫外分光光度計進行全波長掃描，鑒定偶聯(lián)物是否偶聯(lián)成功稱取RAC-BSA偶聯(lián)物、RAC、BSA各lmg，分別溶于Iml PBS緩沖液中，以PBS為空白對照，對上述物質(zhì)的溶液分別作光譜掃描，觀測幾種物質(zhì)的光密度(OD值)，紫外掃描光譜圖見圖2。結果分析由圖2可見，RAC和BSA的特征波長分別在291nm和276nm處，偶聯(lián)物RAC-BSA在279nm處有一個吸收峰，由紫外特征吸收峰的偏移可知免疫抗原RAC-BSA偶聯(lián)成功。2、包被原的制備與檢測。a.包被原的制備
步驟同完全抗原的制備，只是步驟(8)中BSA (牛血清白蛋白)換為OVA (卵清蛋白)，得到 RAC-OVA。(3 ) RAC-OVA 的檢測
采用紫外分光光度計進行全波長掃描，鑒定偶聯(lián)物是否偶聯(lián)成功稱取RAC-OVA偶聯(lián)物、RAC、OVA各lmg，分別溶于Iml PBS緩沖液中，以PBS為空白對照，對上述物質(zhì)的溶液分別作光譜掃描，觀測幾種物質(zhì)的光密度(OD值)，紫外掃描光譜圖見圖3。結果分析由圖3可見，RAC和OVA的特征波長分別在291nm和280nm處，偶聯(lián)物RAC-OVA在276nm處有一個吸收峰，由紫外特征吸收峰的偏移可知免疫抗原RAC-OVA偶聯(lián)成功。實施例二小鼠免疫。取5只鼠齡在10周的Balb/c健康雄性小鼠，每只小鼠按下列程序免疫第O天取lmg/ml的RAC-BSA50y g加等體積弗氏完全佐劑乳化后在小鼠背部皮下多點注射，取lmg/ml的RAC-BSA25y g與等體積快速鼠單抗制備佐劑混勻后分別于第30天，第50天，第65天，同法注射免疫。一周后尾靜脈血離心取血清用間接ELISA法測效價，選取血清效價高的小鼠于第80天進行沖擊免疫,免疫原為RAC-BSA,免疫的劑量為50ug/只。間接ELISA檢測抗血清效價方法的建立
(I)包被用O. 15M pH9. 6的NaHCO3包被緩沖液將所述包被原RAC-OVA稀釋5000倍，100 μ I/孔加入酶標板，4°C過夜；次日取出，甩去孔內(nèi)液體，PBST洗滌三次，拍干。(2)封閉每孔加120 μ I封閉液(含2%脫脂奶粉、1%0VA的PBS)，37°C封閉2h后，甩去孔內(nèi)液體，PBST洗滌兩次并拍干孔內(nèi)液體。(3)加血清樣品用稀釋液將待檢血清樣品作1:10000——I =5120000梯度稀釋， οομ I/孔加入酶標板，同時用陰性血清做陰性對照，稀釋液做空白對照；37°C濕盒反應30min，甩去孔內(nèi)液體，PBST洗滌五次，拍干。(4)加酶標二抗將羊抗鼠IgG酶標二抗用稀釋液適當稀釋，100 μ I/孔加入酶標板，37。。
濕盒反應30min，甩去孔內(nèi)液體，PBST洗滌五次，拍干。(5)加底物每孔加入TMB底物溶液100μ 1，37°C濕盒顯色15min。(6)反應終止每孔加入終止液(2M硫酸溶液)50 μ I0(7)測定選擇450nm濾光片，用酶標儀測定、記錄每孔的OD值。結果判定以樣品血清孔的OD值在I. O左右，且P/N值在2. I以上的孔所對應的抗體稀釋度為該抗血清的效價(P表示待檢樣品血清孔的吸光度值；N表示陰性對照血清孔的吸光度值)。實施例三細胞融合，雜交瘤細胞的篩選及克隆化培養(yǎng)。I、飼養(yǎng)細胞制備。
將一只未接受免疫的Balb/c小鼠拉頸脫臼處死，浸泡于75%酒精5分鐘，在超凈工作臺內(nèi)剪開腹部皮膚，暴露腹膜；酒精消毒后注入5ml RPMI1640培養(yǎng)液，晃動小鼠或反復抽吸幾次后抽回注入離心管離心，棄上清，下層沉淀即為飼養(yǎng)細胞；用35ml完全培養(yǎng)液重懸上述飼養(yǎng)細胞，100 μ I/孔滴加到培養(yǎng)板，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)。2、脾細胞制備。
取間接ELISA檢測血清效價最高的免疫小鼠，眼眶采血后脫曰處死，在75%酒精中消毒后取脾臟，去除結締組織，制備脾細胞懸液，轉移到50ml離心管中，加RPMI1640培養(yǎng)液至30ml，離心棄上清，加RPMI1640培養(yǎng)液至30ml，計數(shù)，取I X IO8個細胞待用。3、骨髓瘤細胞制備。
取3瓶生長狀態(tài)良好的(活細胞數(shù)>95%)骨髓瘤細胞，超凈工作臺中用彎頭滴管將之完全吹下，轉移到50ml離心管中，加RPMI1640培養(yǎng)液至30ml，離心棄上清，加RPMI1640培養(yǎng)液至30ml稀釋，計數(shù)，取2 X IO7個細胞待用。4、細胞融合。按數(shù)量比脾細胞骨髓瘤細胞=5 :1，混合，1500rpm離心5分鐘；棄上清，沉淀細胞塊彈成糊狀，置37°C水浴，在I分鐘內(nèi)加入Iml預熱至42°C的質(zhì)量分數(shù)為的50% PEG4000融合劑，并攪拌細胞，37°C水浴放置45s，2min內(nèi)加入10mlRPMI1640培養(yǎng)液并攪拌細胞；IOOOrpm離心5min,棄上清。5、細胞培養(yǎng)。
輕輕將融合后的細胞彈勻，加入75ml HT培養(yǎng)液，將細胞重懸混勻，加到預先準備好的飼養(yǎng)細胞板中；37°C，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)、觀察；細胞融合后第一天開始，對細胞進行仔細觀察并記錄；次日添加HAT培養(yǎng)基100 μ I，培養(yǎng)4天；ΗΑΤ培養(yǎng)液換液一次，10天后換HT培養(yǎng)液 培養(yǎng)，依細胞數(shù)量及時做ELISA檢測，后用RPMI1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞。6、雜交瘤細胞的篩選。
融合后當雜交細胞集落生長到一定大小，培養(yǎng)液開始變黃，便可開始篩選抗體活性；在收集上清時，應在上次換液后4天進行，以便抗體積累；上清I :10稀釋后用ELISA法進行雜交瘤細胞篩選。7、雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)。
將陽性孔雜交細胞計數(shù)制成細胞懸液，把鋪有飼養(yǎng)細胞的96孔板均分為4組，將細胞懸液按倍比法稀釋成4組溶液，即每組每毫升含100、50、25、12. 5個細胞，以100 μ I/孔加板培養(yǎng)；約10天左右選擇單克隆孔，檢測抗體，如陽性者，再克隆，直至抗體陽性率100% ;此時選擇抗體陽性強、細胞生長好的克隆，進行擴大培養(yǎng)，建系，保存。實施例四腹水制備及萊克多巴胺單克隆抗體的純化。I、腹水制備。
選取生育一次的Balb/c雌性青年小鼠，每只注射500 μ I液體石蠟致敏；10天后收集雜交瘤細胞并用RPMI1640培養(yǎng)液或PBS緩沖液洗細胞兩遍，取125萬細胞注射于老鼠腹腔，一周后可見老鼠狀態(tài)不活躍并且老鼠的腹腔腫大，此時可用無菌注射器于老鼠腹腔采集腹水，每隔一到兩天采集一次，這樣多次反復采集直到老鼠自然死亡；2000rpm離心去除上層脂肪和下層沉淀物，收集中層，取部分樣品ELISA測效價，其余分裝凍存?zhèn)溆谩?、飽和硫酸銨法純化腹水。
將腹水5ml與5ml PBS混合后，邊攪拌邊逐滴加入IOml飽和硫酸銨，繼續(xù)溫和攪拌IOmin后，4°C冰箱靜置過夜；4°C，IOOOOrpm離心lOmin，棄上清；沉淀用PBS重溶至10ml，然后邊輕輕攪拌邊逐滴加入5ml飽和硫酸按溶液，4°C冰箱靜置過夜；4°C，IOOOOrpm離心lOmin，棄上清；最后獲得的沉淀用少量生理鹽水溶解后，放入透析袋中于4°C進行透析，以置換緩沖液。3、DEAE弱陰離子交換樹脂進一步純化。
裝柱，O. 02M pH8. OPB平衡后將透析后抗體上樣，平衡緩沖液繼續(xù)平衡至穿透峰回落至基線，換用鹽溶液滴度洗脫并收集各組分；經(jīng)過DEAE純化后的抗體純度達到95%以上。實施例五萊克多巴胺單克隆抗體的鑒定。I、間接ELISA測定抗體效價。
O. 15M pH9. 6的碳酸鹽包被緩沖液(0.22 μ m過濾)將抗原稀釋至所需濃度，50-100ng/孔包被；PBST洗滌2次，拍干，加入200 μ I封閉液；將待測樣品稀釋成系列梯度濃度(I: 10000，1:20000，1:40000，1:80000…1:5120000)按 100 μ I/孔加入包被板孔中，同時設立陰性(小鼠陰性血清)和空白對照(PBS溶液)，370C反應2h ；PBST洗滌2次，加入適當稀釋的酶標二抗10(^1/孔，371反應111，PBST洗滌3次，PBS洗滌I次，加顯色液100 μ I/孔，37°C恒溫培養(yǎng)箱放置20min ;加入2M硫酸溶液50 μ I終止反應；可于白色背景上，直接用肉眼觀察結果反應孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“ + 號表示；也可測OD值在酶標儀上，于450nm以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值，若OD值大于1.0即為陽性。結果分析由圖4 (單抗效價測定)可知，該單抗的效價為1:320000。2、間接競爭ELISA測定IC50。
分別包被100ng、50ng、25ng、12. 5ng、6. 25ng濃度的抗原樣品；每個梯度包被2列；封閉；倒出孔內(nèi)溶液，PBST洗滌2次，封閉；每一行按標準加入50 μ I標準品溶液和相應的OD 值在I. O時的抗體稀釋溶液；同時設定不加孔為第一行；標準品抗原的濃度依次為O. IngO. 3ng O. 9ng 2. 7ng 8. Ing 24. 3ng最后一行設為空白行；37°C反應2小時加入PBST洗滌2次，PBS洗滌I次，拍干；加入酶標抗體，37 V反應Ih后PBST洗滌3次，PBS洗滌I次，拍干；加顯色液100 μ I/孔，37°C恒溫培養(yǎng)箱放置20min ;加入2M硫酸溶液50 μ I ;在酶標儀上，于450nm以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值；按以下公式計算抑制率
抑制率(％) = [ (B — B。)/B0] X 100% ；
抑制率為50%時的Rac質(zhì)量濃度即為該單抗的IC50值；
結果如表一所不
表一
權利要求
1.一種萊克多巴胺單克隆抗體的制備方法，其特征在于包括如下步驟 A)制備完全抗原RAC-BSA和包被原RAC-OVA (a)將萊克多巴胺，即RAC溶解在四氫呋喃水溶液中，先后加入苯甲氧羰琥珀酰亞胺和碳酸氫鈉，攪拌12小時后用乙酸乙酯萃取，取有機相減壓除去溶劑，過硅膠層析柱，收集中間產(chǎn)物A ;(b)將所述中間產(chǎn)物A溶解在二氯甲烷中，冷卻至0°C，加入三乙胺和叔丁基二甲基氯硅烷，升至室溫反應12h后加水，再用二氯甲烷萃取，取有機相減壓除去溶劑，得到化合物B ; (c)將所述化合物B溶解在二氯甲烷中，冷卻至-10°C，先后加入三苯基膦、咪唑和N-溴代丁二酰亞胺，攪拌30min后加入飽和氯化銨溶液，再用二氯甲烷萃取，取有機相減壓除去溶劑，得到化合物C ;(d)將6-羥基己烷甲酸甲酯溶解在N，N- 二甲基甲酰胺中，冷卻至0°C，加入NaH，攪拌lOmin，得到混合液，將所述化合物C溶解在N，N- 二甲基甲酰胺中，再加入到所述混合液中，攪拌IOh后減壓除去N，N-二甲基甲酰胺，用乙酸乙酯萃取，取有機相減壓除去溶劑，得到化合物D ;(e)將所述化合物D溶解在甲醇水溶液中，冷卻至0°C，加入LiOH，反應Ih后減壓除去甲醇，用HCl調(diào)節(jié)pH至3，用乙酸乙酯萃取，取有機相減壓除去溶劑，得到化合物E ; (f )將所述化合物E溶解在甲醇中，加入催化量的Pd/C，密閉反應體系，用氫氣換氣3次，反應Ih后過濾Pd/C，減壓除去甲醇，得化合物F ；(g)將所述化合物F溶解在四氫呋喃中，冷卻至0°C，加入四丁基氟化銨，反應2h后減壓除去四氫呋喃，過柱提純產(chǎn)品，得到化合物G ； (h)將所述化合物G溶解在N，N- 二甲基甲酰胺中，冷卻至O °C，加入三乙胺和牛血清白蛋白，即BSA，待BSA完全溶解后加入二環(huán)己基碳二亞胺，攪拌24h，減壓除去N，N-二甲基甲酰胺，先后用水和乙醇洗滌，得到固體產(chǎn)物即為RAC-BSA ；(i)將所述化合物G溶解在N，N- 二甲基甲酰胺中，冷卻至O °C，加入三乙胺和卵清蛋白，即OVAJt OVA完全溶解后加入二環(huán)己基碳二亞胺，攪拌24h，減壓除去N，N- 二甲基甲酰胺，先后用水和乙醇洗漆，得到固體產(chǎn)物即為RAC-OVA ； B)動物免疫采用Balb/c小鼠作為免疫動物，所述RAC-BSA與等體積弗氏完全佐劑乳化后作為第一次免疫原，所述RAC-BSA與等體積快速鼠單抗制備佐劑乳化后作為第二、三、四次免疫原，每次免疫劑量為25飛Oug/只小鼠，共免疫四次； C)沖擊免疫所述第四次免疫結束后1(Γ15天，用間接ELISA法測血清抗體效價，選取所述血清效價高的小鼠進行沖擊免疫，所述沖擊免疫的劑量為5(Tl00Ug/只； D)制備雜交瘤細胞所述沖擊免疫結束后三天，取接受過沖擊免疫的小鼠的脾細胞，以PEG4000作融合劑，將免疫脾細胞與骨髓瘤細胞按數(shù)量比為5 1進行細胞融合，選取陽性克隆進行亞克隆，得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株； E)制備腹水并純化萊克多巴胺單克隆抗體用滅菌石蠟致敏Balb/c小鼠，所述致敏結束7天后分別對每組小鼠腹腔注射所述雜交瘤細胞，7 10天后采集腹水，采用飽和硫酸銨法純化腹水，再用DEAE弱陰離子交換樹脂進一步純化，得到純化后的單克隆抗體，即萊克多巴胺單克隆抗體。
2.根據(jù)權利要求I所述的一種萊克多巴胺單克隆抗體的制備方法，其特征在于步驟A)中所述制備完全抗原RAC-BSA和包被原RAC-OVA是采用醚化反應將萊克多巴胺芐醇基團的羥基連接上6-羥基己烷甲酸甲酯制備半抗原，再經(jīng)過縮合反應制得萊克多巴胺與載體蛋白復合物。
3.根據(jù)權利要求I所述的一種萊克多巴胺單克隆抗體的制備方法，其特征在于步驟B)中所述Balb/c小鼠為8 12周鼠齡的健康雄性Balb/c小鼠。
4.根據(jù)權利要求I所述的一種萊克多巴胺單克隆抗體的制備方法，其特征在于步驟B)中所述第二、三、四次免疫的時間分別是所述第一次免疫后的第30、50、65天。
5.根據(jù)權利要求I所述的一種萊克多巴胺單克隆抗體的制備方法，其特征在于步驟C)中所述沖擊免疫的免疫原是RAC-BSA。
6.根據(jù)權利要求I所述的一種萊克多巴胺單克隆抗體的制備方法，其特征在于步驟D)中所述PEG4000融合劑為預熱至42°C的質(zhì)量分數(shù)為50%PEG4000。
7.根據(jù)權利要求I所述的一種萊克多巴胺單克隆抗體的制備方法，其特征在于步驟E)中所述Balb/c小鼠為生育一次的雌性青年小鼠。
全文摘要
本發(fā)明提供一種萊克多巴胺單克隆抗體的制備方法，包括如下步驟A)制備完全抗原RAC-BSA和包被原RAC-OVA；B)動物免疫；C)沖擊免疫；D)制備雜交瘤細胞；E)制備腹水并純化萊克多巴胺單克隆抗體。利用本發(fā)明提供的制備方法制得的萊克多巴胺單克隆抗體靈敏度高、特異性強，可應用于萊克多巴胺的檢測中，假陽性、假陰性比率顯著降低，滿足實際應用的需要。
文檔編號C07K16/44GK102924601SQ201210424258
公開日2013年2月13日 申請日期2012年10月31日 優(yōu)先權日2012年10月31日
發(fā)明者李攀, 任琪, 謝桂華, 談宇清 申請人:深圳市寶凱侖科技有限公司