專利名稱：人hcrcn81的原核重組質(zhì)粒及其所表達(dá)的蛋白與兔抗人多克隆抗體及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種原核重組質(zhì)粒及其所表達(dá)的蛋白與兔抗人多克隆抗體及用途。
背景技術(shù)：
近年來，惡性腫瘤對人類的威脅日益突出，腫瘤已成為死亡常見原因之一，嚴(yán)重影響著人類的健康。癌癥是一種常見的惡性腫瘤，在其發(fā)生和發(fā)展過程中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些致癌基因的激活(如survivin、c_myc、Bcl-2等)和抑癌基因的失活(如p53、DCC> nm23、APC> PTEN、DPC4等)，所述致癌基因和抑癌基因與人癌癥的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系，但是至今還有許多的致癌基因、抑癌基因尚未發(fā)現(xiàn)。
人hcrcn81基因已在GenBank注冊，注冊號(hào)NM_001013649. 3，定量熒光PCR顯示，人hcrcn81基因的mRNA的表達(dá)在結(jié)直腸腺癌組織中下調(diào)，NM_001013649. 3在腫瘤組織中的低表達(dá)可能導(dǎo)致相應(yīng)蛋白在惡性腫瘤細(xì)胞中的低表達(dá)，從而導(dǎo)致相關(guān)癌基因的激活及抑癌基因的失活，hcrcn81可能與結(jié)直腸腺癌的發(fā)病有關(guān)(見Qin Jiang, Chunle Zhang, Yao Chen . NM_001013649. 3 gene is down-regulated in human colorectal adenocarcinoma. Molecular Medicine Reports. 2011 ;4(6) : 1279-1281)。因此，有必要進(jìn)一步研究HCRCN81蛋白質(zhì)在人惡性腫瘤中的作用。
抗體是在對抗原刺激的免疫應(yīng)答中，B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的一類糖蛋白。它是能與相應(yīng)抗原特異的結(jié)合，產(chǎn)生各種生理效應(yīng)的球蛋白。多克隆抗體是人類有目的地利用抗體的第一步，其在生物醫(yī)學(xué)等方面的應(yīng)用已有上百年的發(fā)展歷史。多克隆抗體能有效提高抗原攝取、加工和識(shí)別，因此，有必要制備新型多克隆抗體，為進(jìn)一步研究hcrcnSl基因的功能提供工具。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種人hcrcn81的原核重組質(zhì)粒、重組人HCRCN81蛋白質(zhì)和兔抗人多克隆抗體，并證明所述兔抗人多克隆抗體可用于檢測人癌細(xì)胞和人組織中 HCRCN81蛋白質(zhì)的表達(dá)，為研究hcrcn81基因在人癌癥發(fā)生發(fā)展中的作用和地位提供有用的工具。
人hcrcn81基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. I所述。本發(fā)明所述原核重組質(zhì)粒，由序列表中SEQ ID NO. I中的基因片段與原核表達(dá)載體構(gòu)建而成，所述基因片段是 SEQ ID NO. I中第73位至第573位的核苷酸序列，所述的基因片段正向插入原核表達(dá)載體。
本發(fā)明所述原核重組質(zhì)粒，其原核表達(dá)載體為pET質(zhì)粒系統(tǒng)，包括pET_28a、 pET_30a、pET_32a 或 pET32a (+)。
本發(fā)明所述重組人HCRCN81蛋白質(zhì)，由上述原核重組質(zhì)粒表達(dá)而成,其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 2所述。
本發(fā)明所述兔抗人多克隆抗體，由上述重組人HCRCN81蛋白質(zhì)免疫新西蘭大耳白兔后收集抗血清純化得到，其制備方法依次包括以下步驟
(I)通過RT-PCR反應(yīng)，獲得人HCRCN81蛋白質(zhì)編碼基因，即序列表SEQ ID NO. I中第73位至第573位的核苷酸序列；
(2)將步驟(I)擴(kuò)增的人HCRCN81蛋白質(zhì)編碼基因插入到原核表達(dá)載體構(gòu)建原核重組質(zhì)粒，再將所述原核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)菌中進(jìn)行培養(yǎng)，然后篩選出含有正確插入片段的克隆；
(3)利用PCR擴(kuò)增和限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析所述原核重組質(zhì)粒，并進(jìn)行DNA序列分析；
(4)將正確克隆的原核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化工程菌中進(jìn)行表達(dá)，分離純化表達(dá)的蛋白即獲得重組人HCRCN81蛋白質(zhì)；
(5)采用SDS-PAGE、質(zhì)譜分析鑒定重組人HCRCN81蛋白質(zhì)的正確性；
(6)將所述重組人HCRCN81蛋白質(zhì)免疫新西蘭大耳白兔后收集抗血清；
(7)采用抗原親和純化方法從步驟(6)所收集的抗血清中獲得兔抗人多克隆抗體 (Anti-HCRCN81)。
本發(fā)明用雷帕霉素處理結(jié)腸癌細(xì)胞，并對處理之前和處理之后的結(jié)腸癌細(xì)胞所表達(dá)的總蛋白進(jìn)行Western blot試驗(yàn),驗(yàn)證所述兔抗人多克隆抗體(Anti_HCRCN81)對結(jié)腸癌細(xì)胞表達(dá)的HCRCN81蛋白的檢測效果。
本發(fā)明提取人結(jié)直腸癌組織和正常結(jié)直腸組織的總蛋白，并對所提取的總蛋白進(jìn)行Western blot試驗(yàn),驗(yàn)證所述兔抗人多克隆抗體(Anti_HCRCN81)對人結(jié)直腸癌組織和正常結(jié)直腸組織所表達(dá)的HCRCN81蛋白的檢測效果。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明所述兔抗人多克隆抗體(Anti_HCRCN81)對人癌細(xì)胞和人組織所表達(dá)的HCRCN81天然蛋白均具有檢測作用，可在制備檢測人癌細(xì)胞和人組織中 hcrcn81基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)的檢測劑方面應(yīng)用。
本發(fā)明具有以下有益效果
本發(fā)明首次制備了重組人HCRCN81蛋白質(zhì)，并提供了一種新型兔抗人多克隆抗體，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明所述兔抗人多克隆抗體對人癌細(xì)胞和人組織中的所表達(dá)的 HCRCN81天然蛋白均具有檢測作用，因而有助于研究hcrcnSl基因在人癌癥發(fā)生發(fā)展中的作用和地位。


圖I是原核表達(dá)載體pET32a(+)的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2是本發(fā)明所述人hcrcn81的原核重組質(zhì)粒pET32a(+)/hcrcn81的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖3是本發(fā)明所述人hcrcn81的原核重組質(zhì)粒pET32a(+)/hcrcn81的測序圖。
圖4是本發(fā)明所述人hcrcn81的原核重組質(zhì)粒pET32a(+)/hcrcn81的PCR電泳圖，圖中 M:DM2000 Plus Marker，從上到下依次為 8000、5000、3000、2000、1000、750、500、 250、lOObp。
圖5是本發(fā)明所述人hcrcn81的原核重組質(zhì)粒pET32a⑴/hcrcn81轉(zhuǎn)化BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)菌所表達(dá)的HCRCN81蛋白的SDS-PAGE電泳圖，圖中，M :PageRuler Unstained Broad Range Protein Ladder (Fermentas),從上到下分別是 250、150、100、70、50、40、30、20、15kD ;1，2 : BL21 (DE3) pLysS (pET32a)分別 0，ImM IPTG 誘導(dǎo)；3-6 :BL21(DE3)pLysS (pET32a: :hcrcn81)分別 0，0· 01，0· 1，ImM IPTG 誘導(dǎo)。
圖6是本發(fā)明所述人hcrcn81的原核重組質(zhì)粒pET32a (+) /hcrcn81轉(zhuǎn)化 BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)菌超聲后上清和沉淀所表達(dá)的HCRCN81蛋白的SDS-PAGE電泳圖，圖中，M :PageRuler Unstained Broad Range Protein Ladder (Fermentas),從上到下分別是250、150、100、70、50、40、30、20、15kD ；1, 2 0mM IPTG誘導(dǎo)上清和沉淀；3, 4 0. ImM IPTG誘導(dǎo)上清和沉淀。
圖7是純化后的重組人HCRCN81蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳圖，圖中，M =PageRuler Unstained Broad Range Protein Ladder (Fermentas),從上到下分別是 250、150、100、70、 50、40、30、20、15、10kD ;1 :流穿液；2-7 :分別為 10、20、50、100、250、500mM 咪唑洗脫液。
圖8是重組人HCRCN81蛋白質(zhì)電洗脫后SDS-PAGE電泳圖，圖中，M =PageRuler Unstained Broad Range Protein Ladder (Fermentas),從上到下分別是 250、150、100、 70、50、40、30、20、15kD ;1 :電洗脫蛋白；2 :濃縮濾液；3 :lmg/ml BSA 標(biāo)準(zhǔn)品。
圖9是重組蛋白質(zhì)HCRCN81的質(zhì)譜分析圖表。
圖10是本發(fā)明所述兔抗人多克隆抗體(Anti-HCRCN81)純化后的SDS-PAGE檢測圖，圖中，I為蛋白Marker ；2為CWRA320抗原親和純化兔抗人多克隆抗體；3為CWRA321抗原親和純化兔抗人多克隆抗體。
圖11的圖(a)是使用兔抗人多克隆抗體(Anti_HCRCN81),通過Western blot方法檢測結(jié)腸腺細(xì)胞株SW480中HCRCN81的蛋白表達(dá)圖，圖(b)是使用兔抗人多克隆抗體 (Anti-HCRCN81)，通過Western blot方法檢測結(jié)腸腺細(xì)胞株LoVo中HCRCN81的蛋白表達(dá)圖；圖中，SDS-PAGE 顯示 HCRCN81 蛋白在結(jié)腸腺細(xì)胞株 SW48(TKAPA、SW48(Tdms° 和 LoVc^APA、 LoVo_dms°中的電泳條帶，SW480_kapa代表經(jīng)雷帕霉素處理的結(jié)腸腺細(xì)胞株SW480，SW480_dms°代表經(jīng)DMSO處理的結(jié)腸腺細(xì)胞株SW480，L0V0-kapa代表經(jīng)雷帕霉素處理的結(jié)腸腺細(xì)胞株LoVo， LoVo_dms°代表經(jīng)DMSO處理的結(jié)腸腺細(xì)胞株LoVo，β -actin為內(nèi)參照蛋白。
圖12是使用兔抗人多克隆抗體(Anti_HCRCN81)、通過Western blot方法檢測結(jié)腸結(jié)腸癌組織和正常組織中HCRCN81的蛋白表達(dá)圖，其中，圖(a)為第一病人的檢測圖，圖中，Tl為第一病人直腸癌的腫瘤組織樣本，NI為第一病人腫瘤旁5cm正常組織樣本；圖(13) 為第二病人的檢測圖，T2為第二病人直腸癌的腫瘤組織樣本，N2為第二病人腫瘤旁5cm正常組織樣本。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例I :人hcrcn81的原核重組質(zhì)粒的構(gòu)建
根據(jù)目的序列(序列表SEQ ID NO. I中第73位至第573位的核苷酸序列)， 設(shè)計(jì)全基因合成引物，表 I 中 hcrcn81_lF、hcrcn81_3F、hcrcn81_5F、hcrcn81_7F、 hcrcn81_9F、hcrcn81_llF、hcrcn81-13F 為正義鏈引物，表 I 中 hcrcn81_2R、hcrcn81_4R、 hcrcn81_6R、hcrcn81_8R、hcrcn81_10R、hcrcn81_12R、hcrcn81-14R 為反義鏈引物，上游引物hcrcn81_lF添加EcoRI酶切位點(diǎn)(劃線處)，下游引物hcrcn81_14R添加HindIII酶切位
表I :全基因合成引物序列
引物名稱序列(5’ 一3’)hcrcn81-lFCCGGAATTCATGGAGGCGGGGCCGCATCCCCGGCCGGGGCACTGCTGhcrcn81-3FCGGCTGGACATGAACCACGGCTTCGTGCACCATATCCGACGGAACCAGATCGCTCGGGAhcrcn81-5FGAAGCAGGCGGCCAAGGAGAAGGTGAGGAGGCGGCACACGCCCGCGCCGAChcrcn81-7FGCAGGTGTACCTGCCGCGACACCGAGATGTCTCTGCCCACCCACGCAACCCAGACTAhcrcn81—9FAGCAGTAGTGGAGGCTCTGAGCTGGAGCCTTCTGGCCATCAGCTCTTCTGCTTAGAATAhcrcn81-llFGGTCACATCAGTTATCGTCTATCAGGGTGATGACCCAGGAAAGGTGAGTGAGAAGGhcrcn81-13FCGCCTCTGGATCCACCCATGCGAGAAGCCCTCAAGTTGCGTATCCAGGAGGAhcrcn81-2RCGTGGTTCATGTCCAGCCGCCCCCCAGGCTTGCAGCAGTGCCCCGGCCGGGGATGCGGChcrcn81—4RCTTCTCCTTGGCCGCCTGCTTCACCTTCTTGTCATAGTCGTCCCGAGCGATCTGGTTCChcrcn81-6RTCGCGGCAGGTACACCTGCAGGTCTGGCTTGCGGGGCCGCGTCGGCGCGGGCGTGTGhcrcn81-8RCTCAGAGCCTCCACTACTGCTGCTTTCACCGGACTCTTCATAGTCTGGGTTGCGTGGGhcrcn81-IORGACGATAACTGATGTGACCTCTCCACTGTCTGCCTCGTATTCTAAGCAGAAGAGCThcrcn81-12RATGGGTGGATCCAGAGGCGTGTGTGCCGACACCTTCTCACTCACCTTTCChcrcn81-14RCCCAAGCTTTTATCAGTGTTGGCTCTGGCGCTTTGCAATCTCCTCCTGGATACGCAACT
將第一組引物hcrcn81-lF,hcrcn81- 2R, hcrcn81- 3F, hcrcn81-4R, hcrcn81-5F, hcrcn81-6R, hcrcn81_7F,hcrcn81_8R 混合,PCR 擴(kuò)增得 hcrcn81 片段 I,PCR 反應(yīng)體系見表2 ;將第二組引物hcrcn81-9F, hcrcn81-10R, hcrcn81-llF, hcrcn81-12R, hcrcn81-13F, hcrcn81_14R 混合，PCR 擴(kuò)增得 hcrcn81 片段 2，PCR 反應(yīng)體系見表 3。
表2 PCR反應(yīng)體系I
體系I成分體積(μ I)IOXEs Taq buffer5dNTP(2. 5mM each)4MgCl2 (25mM)權(quán)利要求
1.一種人hcrcn81的原核重組質(zhì)粒，其特征在于由序列表中SEQ ID NO. I中的基因片段與原核表達(dá)載體構(gòu)建而成，所述基因片段是SEQ ID NO. I中第73位至第573位的核苷酸序列，所述的基因片段正向插入原核表達(dá)載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述人hcrcnSl的原核重組質(zhì)粒，其特征在于原核表達(dá)載體為pET 質(zhì)粒系統(tǒng)，包括 pET-28a、pET-30a、pET_32a 或 pET32a (+)。
3.—種重組人HCRCN81蛋白質(zhì)，其特征在于由權(quán)利要求I或2所述的原核重組質(zhì)粒表達(dá)而成，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 2所述。
4.一種兔抗人多克隆抗體，由權(quán)利要求3所述重組人HCRCN81蛋白質(zhì)免疫新西蘭大耳白兔后收集抗血清純化得到。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述兔抗人多克隆抗體，其特征在于制備方法依次包括以下步驟(1)通過RT-PCR反應(yīng)，獲得人HCRCN81蛋白質(zhì)編碼基因，即序列表SEQID NO. I中第 73位至第573位的核苷酸序列；(2)將步驟(I)擴(kuò)增的人HCRCN81蛋白質(zhì)編碼基因插入到原核表達(dá)載體構(gòu)建原核重組質(zhì)粒，再將所述原核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)菌中進(jìn)行培養(yǎng)，然后篩選出含有正確插入片段的克??；(3)利用PCR擴(kuò)增和限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析所述原核重組質(zhì)粒，并進(jìn)行DNA序列分析；(4)將正確克隆的原核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入工程菌中進(jìn)行表達(dá)，分離純化表達(dá)的蛋白即獲得重組人HCRCN81蛋白質(zhì)；(5)采用SDS-PAGE、質(zhì)譜分析鑒定重組人HCRCN81蛋白質(zhì)的正確性；(6)將所述重組人HCRCN81蛋白質(zhì)免疫新西蘭大耳白兔后收集抗血清；(7)采用抗原親和純化方法從步驟(6)所收集的抗血清中獲得兔抗人多克隆抗體。
6.權(quán)利要求4所述兔抗人多克隆抗體在制備檢測人癌細(xì)胞和人組織中hcrcnSl基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)的檢測劑方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明通過基因工程技術(shù)構(gòu)建人hcrcn81的原核重組質(zhì)粒，將原核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)人HCRCN81蛋白質(zhì) ，并進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物的提取、純化，用人HCRCN81蛋白質(zhì)免疫新西蘭大耳白兔，制備兔抗人多克隆抗體(Anti-HCRCN81)。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明所述兔抗人多克隆抗體 (Anti-HCRCN81)能夠檢測癌細(xì)胞和人組織中HCRCN81蛋白質(zhì)的表達(dá)，為研究hcrcn81基因在人癌癥發(fā)生發(fā)展中的作用和地位提供了有用的工具。
文檔編號(hào)C07K14/47GK102936604SQ20121044586
公開日2013年2月20日 申請日期2012年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月9日
發(fā)明者陳堯, 溫曉霞, 王凱程 申請人:四川大學(xué)