專利名稱：一種重組肝靶向干擾素的制備工藝的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，具體涉及一種重組肝靶向干擾素的制備工藝。
背景技術：
乙型病毒性肝炎(簡稱乙型肝炎)是由乙型肝炎病毒(h印atitis B virus，HBV) 引起的肝臟炎性損害。目前HBV感染已經成為全球性危害的態(tài)勢，全球60億人口中，約20 億人有過HBV感染經歷，3. 5億人為慢性HBV感染者，大約80%的患者有不同程度的肝細胞受損，并可能發(fā)展成肝硬化和肝癌。每年死于乙肝相關疾病的人數高達100多萬，WHO已將 HBV感染列為全球十大最常見致死病因之一。我國屬HBV高流行區(qū)，一般人群HBsAg攜帶率高達7. 18%，這不僅嚴重影響人民身體健康，同時也是一個嚴重的社會問題。
大量的臨床研究證明，HBV在體內長期存在和不斷復制引起肝臟病變的持續(xù)活動和發(fā)展是導致病情進展的根本原因，故抗病毒治療是慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)治療的關鍵。目前干擾素(Interferon, IFN)是慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)抗病毒治療的首選藥物之一。根據IFN的細胞來源、分子結構、理化性質和生物學活性的差別，將其分為α-干擾素(IFNci )、β-干擾素(IFNi3 )和Y-干擾素(IFNy)三型，每一型根據其組成氨基酸的差異又可分為多個亞型，如IFNa lb、IFNa 2b等。IFNa 2b 是FDA批準的第一個抗HBV藥，經過幾十年的臨床運用，其治療乙型肝炎得到了充分肯定。 然而作為抗HBV的首選藥物之一，IFN a 2b存在著用藥劑量大、療效不夠理想、毒副作用大等缺點，限制了其在臨床中的廣泛應用。這主要原因是由于HBV主要在肝細胞內寄生和復制，治療時IFN a 2b在體內容易擴散降解，導致相對平均的組織分布，未能在肝臟形成有效的抗病毒作用濃度。為了達到抗病毒效果，藥物劑量常要加大幾倍、幾十倍，藥物劑量的加大也加重了其不良反應，又容易產生耐藥性HBV，從而影響療效。
重組肝靶向干擾素是將來源于瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白的肝靶向肽CSP I-plus與 IFNa 2b進行融合，利用CSP I-plus高效特異的肝細胞靶向性將IFN a 2b導向肝臟，使其在肝臟富集，從而提高了干擾素治療慢性HBV感染的特異性，減少全身用量，降低毒副反應， 提高量效比，具有重大的開發(fā)應用潛力。但如何低成本、大量獲得肝靶向干擾素以滿足其開發(fā)與應用的需求目前未見報道。
大腸桿菌表達系統(tǒng)是基因表達技術中發(fā)展最早，應用最為廣泛的經典表達系統(tǒng)， 是生物技術研究和生物藥物產業(yè)化進程中的重要工具，目前用于臨床的干擾素多來源于大腸桿菌原核系統(tǒng)。但在采用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)表達時，表達出來的目的蛋白氨基酸序列上一般會多出蛋氨酸和限制性內切酶位點序列，增加了未知的用藥風險。另外，通過原核表達系統(tǒng)表達目的蛋白，多數以包涵體的形式表達，包涵體為蛋白折疊中間體聚集形成的非活性蛋白，必須通過變復性的方式獲得活性蛋白，由于復性效率低下，蛋白得率少等原因使的蛋白藥物制備成本居高不下、推廣應用受到限制?，F有技術中生產的重組人干擾素原液是采用單克隆抗體親合層析純化，單抗的制備煩瑣，成本很高，且配體容易脫落，對產品造成異源鼠IgG的污染。發(fā)明內容
為了克服現有技術的缺陷和不足，本發(fā)明提供一種重組肝靶向干擾素的制備工藝。本發(fā)明創(chuàng)造性地探索了重組肝靶向干擾素基因在大腸桿菌中的高效表達以及表達產物的純化工藝，通過簡便的步驟制備得到高純度高活性的符合藥用標準的重組肝靶向干擾素。
為了實現上述目的，本發(fā)明通過以下技術方案予以實現一種重組肝靶向干擾素的制備工藝，包括如下步驟(1)將含有重組肝靶向干擾素融合蛋白基因的原核工程菌進行發(fā)酵；(2)提取包涵體；(3)用洗滌液洗滌包涵體；(4)變性用溶解液溶解洗滌后的包涵體獲得包涵體溶出液；(5)復性采用對倍稀釋加梯度透析的方法去除變性劑；(6)重組Enterokinase 酶切；(7)HisTrap HP 柱和 HiTrap Heparin HP 柱組合純化；步驟(3)中所述洗滌液為含有2%脫氧膽酸鈉、2M尿素、5mM EDTA、50mM Tris-HCl的緩沖液；步驟(4)中所述溶解液為含有6M鹽酸胍、2. 5mM DTT、5mM EDTA、50mM Tris-HCl pH8. O 的緩沖液；步驟(5)中所述對倍稀釋是采用含有4M鹽酸胍、2. 5mM DTT、5%甘油、IOOmM精氨酸、 50mM Tris-HCl pH8. O的稀釋液,稀釋至蛋白濃度為100ng/ml ；步驟(5)中所述梯度透析是采用含O. 5 3 M鹽酸胍、0.2mM MGSH、2mM GSH、50mM Tris-HCl pH8. 0的緩沖液對包涵體稀釋液進行梯度透析，透析外液的換液間隔最少5小時。
作為一種優(yōu)選方案，步驟(2)所述提取包涵體采用高滲蔗糖溶液聯合超聲破菌的方法；所述高滲蔗糖溶液聯合超聲破菌采用30%蔗糖、50mM Tris-HCl按1:10 (g/ml)的比例重懸菌體，37°C和-20°C之間反復凍融3次，置冰浴中超聲破碎，2s/次，間歇2s，超聲30 分鐘；作為一種優(yōu)選方案，上述制備工藝中，步驟(6)中所述Enterokinase酶切條件為10°C 用I. OU的重組Enterokinase酶切5天；作為一種優(yōu)選方案，上述制備工藝中，步驟(7 )中所述Hi sTrap HP柱純化用Tri s-HCl 緩沖體系在PH8.0的條件下進行，收集穿透樣品得到目的蛋白，再用500 mM咪唑洗脫雜蛋白；作為一種優(yōu)選方案，上述制備工藝中，步驟(7)中所述HiTrap Heparin HP柱純化用 Tris-HCl緩沖體系在pH7. 5的條件下進行，先用O. IM氯化鈉沖洗，再用O. 4M的氯化鈉洗脫目的蛋白。
與現有技術相比，本發(fā)明提供的重組肝靶向干擾素的制備方法，具有如下有益效果(I)通過融合蛋白Trx-His-IFN-CSP的方式表達，將標簽蛋白切除后最終獲得的肝靶向干擾素完全忠實于原始設計，保持了與目的蛋白氨基酸序列完全一致的序列，不同于現有其它表達方式通常會多出的不必要的蛋氨酸和限制性內切酶位點序列，有助于減少未知的用藥風險。
(2)通過變性、透析復性后所得的融合蛋白Trx-His-IFN-CSP的純度可達到95%以上，無需融合蛋白的過柱純化過程，減少處理步驟中可能的污染與損失。
(3)以融合蛋白方式表達，融合蛋白中Trx標簽有助于蛋白的聞效表達，提聞蛋白復性效率，保護融合蛋白免受蛋白酶降解；而His標簽可特異性結合Ni柱，酶切后進行親和層析，一步純化所得的IFN-CSP可達到85%以上。通過肝素親和層析再次純化，精純后獲得 IFN-CSP的純度可達98%以上。內毒素檢測結果小于〈O. 25 Eu/4X107 IU，無需去內毒素過程，簡化了工藝，減少了損失。同時獲得高效復性，IFN-CSP的生物學活性達到2. 5 X IO8 IU/mg以上。


圖I為正交實驗16個實驗號的SDS-PAGE分析圖，其中M為蛋白分子量marker，I 為未誘導的全菌蛋白，2-17為16個正交實驗號的全菌蛋白；圖2誘導表達和破菌的SDS-PAGE分析，其中，M為蛋白分子量marker，I為未誘導的全菌蛋白，2為誘導后的全菌蛋白，3為超聲破菌上清，4為超聲破菌沉淀；圖3包涵體洗滌的SDS-PAGE分析，其中，M為蛋白分子量marker，I為包涵體，2為洗滌上清，3為洗滌后的包涵體；圖4包涵體溶解的SDS-PAGE分析，其中，M為蛋白分子量marker，I為洗滌后的包涵體，2為不溶解的蛋白，3為溶解上清；圖5復性的SDS-PAGE分析，其中，M為蛋白分子量marker，I為溶解上清，2為透析聚沉蛋白，3為復性后蛋白；圖6重組Enterokinase酶切的SDS-PAGE分析，圖A為室溫條件下，使用重組 Enterokinase酶切重組肝祀向干擾素,其中，M為蛋白分子量marker, I為經復性的融合蛋白，2-8為酶切用量分別為O. 1U、0. 2U、0. 4U、0. 6U、0. 8U、1. 0U、1. 2U ;圖B為4°C條件下，使用重組Enterokinase酶切重組肝靶向干擾素，其中，M為蛋白分子量marker，I為經復性的融合蛋白，2-8為酶切用量分別為O. 1U、0. 2U、0. 4U、0. 6U、0. 8U、1. 0U、1. 2U ;圖C為10。。條件下，使用重組Enterokinase酶切重組肝祀向干擾素,其中，M為蛋白分子量marker, I為經復性的融合蛋白；2-7為酶切用量分別為O. 1U、0. 2U、0. 4U、0. 6U、0. 8U、1. OU ；圖7 HisTrap HP柱純化和HiTrap Heparin HP柱純化的SDS-PAGE分析，其中，M 為蛋白分子量marker，I為復性后的重組肝靶向干擾素，2為酶切后的重組肝靶向干擾素，3 為HisTrap HP柱穿透蛋白，4為HisTrap HP柱洗脫蛋白5為HiTrap Heparin HP柱穿透蛋白，6為HiTrap Heparin HP柱洗脫蛋白；圖8 HPLC檢測重組肝靶向干擾素純度；圖9 Wish-VSV系統(tǒng)測定重組肝靶向干擾素活性；具體實施方式
下面結合附圖和實施例來進一步解釋本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。實施例中未注明具體條件的實驗方法，可參照本領域常規(guī)方法條件，如J.薩姆布魯克(Sambrook)等編寫的《分子克隆實驗指南》中所述的方法和條件，或按照制造產品廠商所建議的條件進行。本發(fā)明所使用的含有重組肝靶向干擾素融合蛋白基因的原核工程菌是專利申請?zhí)?01110175065. 6 一種肝靶向肽與人干擾素a2b融合蛋白及其制備方法和應用中所述含有IFN-CSP/pET32a重組質粒的大腸桿菌BL21 (DE3 )。實施例中使用的Hi sTrap HP 柱(GE healthcare)、HiTrap Heparin HP 柱(GE healthcare)、重組 Enterokinase 購自Novagen公司。
實施例I工程菌發(fā)酵條件的優(yōu)化用正交設計軟件正交設計助手II設計L16 (45)正交表(正交表見表I)。選取溫度(A)、 誘導時間(B)、起始菌體濃度(C)、誘導劑IPTG濃度⑶及培養(yǎng)基pH (E)五個因素作為觀察因素，每個因素各選取4個水平，分16個組進行誘導表達，各實驗組的發(fā)酵液經離心收集菌細胞，加入 I X SDS-PAGE Buffer (50mM Tris-HCl ρΗ6· 8，IOOmM DTT，2%SDS，0. 1% 溴酚藍， 10%甘油)，煮沸8min，離心，取上清加樣。制作5%的濃縮膠，15 %的分離膠，電泳電壓濃縮膠80V，分離膠120V。電泳結束后，凝膠進行考馬斯亮藍染色、脫色、掃描分析(結果見圖I)。 進而對結果進行直觀分析及方差分析，以確定誘導的最優(yōu)表達條件。極差分析可知(結果見表1)，C>A>D>B>E,即對IFN-CSP表達量影響的因素為起始菌體濃度 > 誘導溫度 > 誘導劑濃度 > 誘導時間>pH。在實驗條件下優(yōu)化水平的最佳組合為A3B1C3D1E1，即將含100 μ g/ ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(1%蛋白胨、O. 5%酵母抽提粉、1%氯化鈉)的pH調為6. 0，按 I 100接種活化工程菌液，置振蕩培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)，待菌體密度0D600達到O. 8時，加入終濃度為O. 4 mM的IPTG誘導培養(yǎng)6 h，高速離心收集菌體。在此誘導條件下，融合蛋白的表達比例高達74. 3%，是非優(yōu)化條件下的I. 2倍。
表I L16 (45)正交設計及實驗結果與分析權利要求
1.一種重組肝靶向干擾素的制備工藝，其特征在于包括如下步驟 (1)將含有重組肝靶向干擾素融合蛋白基因的原核工程菌進行發(fā)酵； (2)提取包涵體； (3)用洗滌液洗滌包涵體； (4)變性用溶解液溶解洗滌后的包涵體獲得包涵體溶出液； (5)復性采用對倍稀釋加梯度透析的方法去除變性劑； (6)重組Enterokinase 酶切； (7)HisTrap HP 柱和 HiTrap Heparin HP 柱組合純化； 步驟(3)中所述洗滌液為含有2%脫氧膽酸鈉、2M尿素、5mM EDTA、50mM Tris-HCl的緩沖液； 步驟(4)中所述溶解液為含有6M鹽酸胍、2. 5mM DTT、5mM EDTA、50mM Tris-HCl pH8. O的緩沖液； 步驟(5)中所述對倍稀釋是采用含有4M鹽酸胍、2. 5mM DTT、5%甘油、IOOmM精氨酸、50mM Tris-HCl pH8. O的稀釋液,稀釋至蛋白濃度為100ng/ml ； 步驟(5)中所述梯度透析是采用含0.5 3 M鹽酸胍、0.2mM MGSH、2mM GSH、50mMTris-HCl pH8. 0的緩沖液對包涵體稀釋液進行梯度透析，透析外液的換液間隔最少5小時。
2.如權利要求I所述的重組肝靶向干擾素的制備方法，其特征在于步驟(2)所述提取包涵體采用高滲蔗糖溶液聯合超聲破菌的方法。
3.如權利要求2所述的重組肝靶向干擾素的制備方法，其特征在于所述高滲蔗糖溶液聯合超聲破菌采用30%蔗糖、50mM Tris-HCl按1:10(g/ml)的比例重懸菌體，37°C和_20°C之間反復凍融3次，置冰浴中超聲破碎，2s/次，間歇2s，超聲30分鐘。
4.如權利要求I所述的重組肝靶向干擾素的制備方法，其特征在于步驟(6)中所述Enterokinase酶切條件為10°C用I. OU的重組Enterokinase酶切5天。
5.如權利要求I所述的重組肝靶向干擾素的制備方法，其特征在于步驟(7)中所述HisTrap HP柱純化用Tris-HCl緩沖體系在pH8. O的條件下進行，收集穿透樣品得到目的蛋白，再用500 mM咪唑洗脫雜蛋白。
6.如權利要求I所述的重組肝靶向干擾素的制備方法，其特征在于步驟(7)中所述HiTrap Heparin HP柱純化用Tris-HCl緩沖體系在ρΗ7· 5的條件下進行，先用O. IM氯化鈉去除雜蛋白，再用O. 4Μ的氯化鈉洗脫目的蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組肝靶向干擾素的制備工藝。本發(fā)明對整合有重組肝靶向干擾素基因的原核工程菌發(fā)酵條件進行優(yōu)化，然后破菌提取包涵體、洗滌、變性溶解、梯度透析復性、重組Enterokinase酶切、HisTrap HP柱和HiTrap HeparinHP柱組合純化，制備得到藥用重組肝靶向干擾素。本發(fā)明通過變性、透析復性后得到的融合蛋白Trx-His-IFN-CSP的純度可達到95%以上，無需融合蛋白的過柱純化過程，減少處理步驟中可能的污染與損失；另外，本發(fā)明將標簽蛋白切除后得到的重組肝靶向干擾素完全忠實于原始設計，有助于減少未知的用藥風險；最后，通過肝素親和層析再次純化，無需去內毒素過程，簡化了工藝，減少了損失。
文檔編號C07K1/22GK102925519SQ20121045615
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月14日 優(yōu)先權日2012年11月14日
發(fā)明者朱家勇, 盧雪梅, 黃演婷, 金小寶, 汪潔 申請人:廣東藥學院