專利名稱：禽蛋中卵黃高磷蛋白的提取及純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及食品工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種禽蛋中卵黃高磷蛋白的提取及純化方法。
背景技術(shù)：
PVS即卵黃高磷蛋白是蛋黃中主要的磷蛋白，約占蛋黃蛋白質(zhì)的7%，有a-PVS(37、42和45Ku)和β-PVS (45Ku)兩種，其中β-PVS含量較a-PVS多，卵黃高磷蛋白具有獨(dú)特的物化特性，其分子中磷的含量約10%，是已知蛋白質(zhì)中磷酸化程度最高的，主要原因在于其分子中約50%的氨基酸殘基是絲氨酸殘基，且90%絲氨酸殘基被磷酸化，正是由于其高度磷酸化性質(zhì)，使其具有很強(qiáng)的乳化性、抗氧化性、殺菌性以及金屬離子螯合力(蛋黃中所含的約95%的鐵離子與其結(jié)合)，可應(yīng)用于制藥、食品以及化妝品等諸多領(lǐng)域。卵黃高磷蛋白最早是由Mecham和Olcott從雞蛋黃中分離出來(lái)。經(jīng)過半個(gè)多世紀(jì)的發(fā)展，現(xiàn)有的分離方法主要有鹽沉淀法、鹽浸提法、膜分離技術(shù)以及利用具有親和活性的鐵系無(wú)機(jī)納米材料來(lái)富集卵黃高磷蛋白，其純化方法都是采用色譜技術(shù)。1986年，WalIace和Morgan利用水溶液來(lái)提取卵黃高磷蛋白，其后的純化采用疏水作用色譜。盡管獲得了很高的純度，但其分離方法繁瑣，得率僅為O. 96% (占蛋黃干重)。1994年，Losso和Nakai在此基礎(chǔ)上建立了一種更為簡(jiǎn)便的鹽浸提方法，但其過程費(fèi)時(shí)費(fèi)力，大量使用有機(jī)溶劑(正己烷)，影響到最終產(chǎn)品的生物安全性。2003年，Castellani等利用卵黃高磷蛋白可以與鎂離子形成沉淀的特性來(lái)提取該蛋白質(zhì)，所得蛋白質(zhì)純度僅為85%，后續(xù)純化采用陰離子高效液相色譜得到高純度的卵黃高磷蛋白，但該技術(shù)不適于擴(kuò)大規(guī)模生產(chǎn)。2007年，徐芳等人用具有鐵原子親和活性位點(diǎn)的鐵系無(wú)機(jī)納米材料與粗制卵黃脂蛋白相互作用，得到特異性吸附有卵黃高磷蛋白的鐵系納米材料，最后經(jīng)煮沸處理得到卵黃高磷蛋白。與傳統(tǒng)技術(shù)比，該發(fā)明操作過程簡(jiǎn)單，但是納米材料價(jià)格昂貴，其最后的純度也僅有80%。2010年，日本和加拿大的研究人員嘗試使用膜超濾法來(lái)大規(guī)模富集卵黃高磷蛋白，并同時(shí)達(dá)到脫鹽的目的。盡管該方法簡(jiǎn)單易行，但其終產(chǎn)品純度不高，N/P比最高僅為
6.64，與sigma標(biāo)準(zhǔn)品的2. 49相差甚遠(yuǎn)。2011年，Ko等利用乙醇脫脂，10%的NaCl或(NH4)SO4來(lái)大規(guī)模提取卵黃高磷蛋白，回收率高達(dá)97%，整個(gè)分離過程可在一天內(nèi)完成。盡管文獻(xiàn)提到其蛋白質(zhì)含量大于85%，但是其檢測(cè)方法使得檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確文獻(xiàn)中使用的是6. 25這樣一個(gè)總氮含量轉(zhuǎn)換系數(shù)，因卵黃高磷蛋白中含有大量的磷，因此，并不能確切的表明其純度。而按照Ko的方法經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)制備的卵黃高磷蛋白，采用比較科學(xué)的N/P的表示方法，其N/P比只有4. 44，仍需要進(jìn)一步的純化，不足以應(yīng)用于食品醫(yī)藥等對(duì)純度要求較高的行業(yè)。2012年，加拿大學(xué)者Bo等人直接利用陰離子交換色譜法來(lái)純化卵黃高磷蛋白，獲得了很高的純度(N/P比為2. 5)但回收率僅為35. 4%,另外所使用的昂貴的高效液相色譜儀限制了其在食品工業(yè)上的應(yīng)用
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)缺陷，而提供一種可直接在食品、醫(yī)藥等純度要求較高的行業(yè)應(yīng)用，所得產(chǎn)品純度高，操作簡(jiǎn)單，易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的禽蛋中卵黃高磷蛋白的提取及純化方法。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的所采用的技術(shù)方案是—種禽蛋中卵黃高磷蛋白的提取及純化方法，其特征在于，包括如下步驟( I)取禽蛋中的卵黃去除水溶性物質(zhì)，采用乙醇脫脂后，用高濃度鹽溶液浸提得到卵黃聞憐蛋白粗品；(2)利用陰離子交換層析法純化上述卵黃高磷蛋白粗品并除鹽，得到高純度的卵黃聞憐蛋白。所述卵黃去除水溶性物質(zhì)的過程為取禽蛋中的卵黃加入1-3倍體積(w/v)、溫度為l-10°c的去離子水，在l-10°c低速攪拌O. 5-2h;然后在l-10°c、4000-6000Xg離心10-30min,棄掉含有水溶性物質(zhì)的上清液，取沉淀得到粗制卵黃脂蛋白。 所述乙醇脫脂的過程為向粗制卵黃脂蛋白中加入3-6倍體積(w/v)的乙醇，3000-6000rpm均質(zhì) l_5min，然后在 1_10°C、4000-6000 X g離心 10_30min，取沉淀，重復(fù)上述脫脂過程1-3次，得到脫脂后的卵黃脂蛋白；所述乙醇濃度為60-90%。所述高濃度鹽溶液浸提的過程為用5-15倍體積(w/v)、濃度為8-12%的鹽溶液浸提上述脫脂后的卵黃脂蛋白，并用HCl溶液調(diào)節(jié)pH值為3. 0-7. 0，于1-10°C攪拌O. 5_2h，然后在l-10°C、4000-6000Xg離心10_30min，棄沉淀取含有卵黃高磷蛋白的上清液，將含有卵黃聞憐蛋白的上清液脫鹽凍干，得到卵黃聞憐蛋白粗品。所述鹽溶液為NaCl溶液或(NH4) 2S04溶液。所述陰離子交換層析法包括下述步驟a、將卵黃高磷蛋白粗品溶于pH值為5. 0-7. 0、20-50mmol/L含NaCl的平衡緩沖液，至卵黃高磷蛋白終濃度為10_50mg/mL，得到卵黃高磷蛋白溶液；b、將上述卵黃高磷蛋白溶液以恒定流速加入裝有陰離子交換樹脂且已用平衡緩沖液平衡的層析柱內(nèi)，然后再以平衡緩沖液洗脫層析柱；C、采用pH值為5.0-7.0、20-50mmol/L含NaCl的洗脫液進(jìn)行一步洗脫，收集洗脫峰，透析凍干后得到高純度的卵黃高磷蛋白；所述洗脫峰是指在PH值為5. 0-7.0、20-50mmol/L且NaCl濃度為O. 5-1. OmoI/L的洗脫液下紫外吸收峰對(duì)應(yīng)的流出液。所述平衡緩沖液為磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀或乙酸-乙酸鈉緩沖液，所含NaCl的濃度為O. 2-0. 4mol/L。所述洗脫液為磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀或乙酸-乙酸鈉緩沖液。所述陰離子交換樹脂為指交聯(lián)葡聚糖系、瓊脂糖系或大孔苯乙烯系。所述高純度的卵黃高磷蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定，主要條帶有三條，符合該蛋白質(zhì)的電泳圖譜特征，其N/P摩爾比為2. 78，接近于sigma標(biāo)準(zhǔn)品的N/P (2. 49)，回收率57. 6%，直接證明了本方法的有效性。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明的方法采用陰離子交換層析法對(duì)卵黃高磷蛋白粗品進(jìn)行純化，因卵黃高磷蛋白含有大量的磷酰絲氨酸殘基，在大于其等電點(diǎn)的PH條件下，所帶的凈負(fù)電荷要遠(yuǎn)高于卵黃中其它的蛋白質(zhì)。在pH值為5-7的條件下，卵黃高磷蛋白帶有大量的凈負(fù)電荷，同其它帶有凈負(fù)電荷的蛋白質(zhì)吸附在層析柱上，而帶有凈正電荷的蛋白質(zhì)會(huì)直接穿柱而出。本發(fā)明通過調(diào)整平衡緩沖液中NaCl的濃度，可以使那些吸附作用弱的雜蛋白隨同平衡緩沖液一起流出，而留在柱子上的則是吸附作用強(qiáng)的卵黃高磷蛋白，然后通過一步洗脫便可得到純度較高的卵黃高磷蛋白。本發(fā)明的方法通過各個(gè)參數(shù)的選擇和合理的工藝路線的確定，與傳統(tǒng)工藝中的連續(xù)梯度洗脫相比，本發(fā)明采用單一洗脫液一步洗脫，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝，所得產(chǎn)品的純度高，產(chǎn)率得到了很大的提升。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。實(shí)施例II、卵黃高磷蛋白的分離鮮雞蛋蛋黃8個(gè)(共112g)加2倍體積溫度為4°C的去離子水于4°C下低速攪拌lh，然后在4000Xg、4°C條件下離心30min，棄上清液取沉淀得到粗制卵黃脂蛋白。所得沉淀加入4倍體積(w/v)80%的乙醇后3000rpm條件下均質(zhì)2min，在4000 X g、4°C條件下再離心lOmin，取沉淀重復(fù)上述脫脂過程3次，所得沉淀為脫脂后的卵黃脂蛋白。所得沉淀用9倍體積10%的NaCl溶液浸提，并用HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至4. 0，于4°C下攪拌30min后在4000Xg、4°C條件下離心30min,棄沉淀取上清液。上清液再經(jīng)透析、凍干得卵黃高磷蛋白粗品(Ρ\)2. 335g，利用凱氏定氮法測(cè)定氮含量和蛋白質(zhì)含量，采用鑰藍(lán)法測(cè)磷含量，經(jīng)測(cè)定計(jì)算得蛋白質(zhì)含量63. 04%，磷含量(百分比)為5. 629%，N/P為3. 967，回收率為97. 80%，得率為2. 08%ο2、卵黃高磷蛋白的純化Q Sepharose FF (QSFF)離子交換層析純化卵黃高磷蛋白粗品層析所采用層析柱規(guī)格為01. O cmx IOcmjQ Sepharose FF強(qiáng)堿型陰離子交換樹脂填充高度為8cm，平衡緩沖液為NaAc/HAc (20mM、pH值為5. O,NaCl的濃度為O. 3mol/L)，使用前用該平衡緩沖液平衡層析柱。將步驟I所提取的卵黃高磷蛋白粗品I. OOg溶于平衡緩沖液中，配成卵黃高磷蛋白濃度為lOmg/mL的得到卵黃高磷蛋白溶液，然后以lmL/min的速度用恒流泵加所配溶液3mL于層析柱內(nèi)，再使用平衡緩沖液洗脫層析柱，最后采用NaCl濃度為O. 6mol/L的NaAc/HAc (20mM、pH值為5. O)作為洗脫液進(jìn)行一步洗脫，流速lmL/min，收集該洗脫液下紫外光對(duì)應(yīng)的洗脫峰，透析凍干后得到純化后的卵黃高磷蛋白O. 277g，經(jīng)測(cè)量計(jì)算后得蛋白質(zhì)含量85. 30%，磷含量(百分比)為10. 79%, N/P為2. 80，回收率57. 34%，得率O. 64%。實(shí)施例2I、卵黃高磷蛋白的分離。鮮雞蛋蛋黃5個(gè)(共80g)，加3倍體積溫度為10°C的去離子水于10°C下低速攪拌30min,然后在4500 X g、10°C條件下離心20min,棄上清液取沉淀得到粗制卵黃脂蛋白。所得沉淀加入5倍體積(w/v)85%的乙醇后4000rpm條件下均質(zhì)Imin,在4500 X g、10°c條件下再離心lOmin，取沉淀重復(fù)上述脫脂過程2次，所得沉淀為脫脂后的卵黃脂蛋
白?！?br> 所得脫脂沉淀用10倍體積9%的NH4SO4溶液浸提，并用HCl溶液調(diào)pH值至5. 0，于10°C下攪拌Ih后在4500Xg、10°C條件下離心20min，棄沉淀取上清液。上清液再經(jīng)透析、凍干得卵黃高磷蛋白粗品(PVi) I. 998g，利用凱氏定氮法測(cè)定氮含量和蛋白質(zhì)含量，采用鑰藍(lán)法測(cè)磷含量，經(jīng)測(cè)定計(jì)算得蛋白質(zhì)含量58. 75%，磷含量(百分比)為4. 49%，N/P為4. 64，回收率93. 40%,得率2. 50%ο2、卵黃高磷蛋白的純化。QAE Sephadex A-25離子交換層析純化卵黃高磷蛋白層析所采用層析柱規(guī)格為
02.O cmx 20cm, QAE Sephadex A-25陰離子交換樹脂填充高度為18cm，平衡緩沖液為磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(50mM、pH值為7. O、NaCl的濃度為O. 2mol/L),使用前用該平衡緩沖液平衡層析柱。將步驟I所提取卵黃高磷蛋白粗品I. OOg溶于平衡緩沖液中，配成卵黃高磷蛋白 濃度為20mg/mL的卵黃高磷蛋白溶液，然后以2mL/min的速度用恒流泵加所配溶液50mL于層析柱內(nèi)，再使用平衡緩沖液洗脫層析柱，最后采用NaCl濃度為O. 6mol/L的磷酸氫二鈉-檸檬酸(50mM、pH值為7. O)作為洗脫液進(jìn)行一步洗脫，流速為2mL/min，收集該洗脫液下的紫外光對(duì)應(yīng)的洗脫峰，透析凍干后得到純化后的卵黃高磷蛋白O. 567g，經(jīng)測(cè)量計(jì)算后得蛋白質(zhì)含量84. 90%，磷含量(百分比)為10. 74%，N/P為2. 73，回收率56. 70%，得率O. 64%。實(shí)施例3I、卵黃高磷蛋白的分離。鮮雞蛋蛋黃7個(gè)(共103g)，加I倍體積溫度為4°C的去離子水于4°C下低速攪拌
I.5h,然后在5000Xg、8°C條件下離心IOmin,棄上清液取沉淀得到粗制卵黃脂蛋白。所得沉淀加入3倍體積(w/v)75%的乙醇后5000rpm條件下均質(zhì)Imin,在5000 X g、8°C條件下再離心lOmin，取沉淀重復(fù)上述脫脂過程I次，所得沉淀為脫脂后的卵黃脂蛋白。所得脫脂沉淀用11倍體積12%的NaCl溶液浸提，并用HCl溶液調(diào)pH值至6. O，于8°C下攪拌IOmin后在5000 X g、8°C條件下離心IOmin,棄沉淀取上清液。上清液再經(jīng)透析、凍干得卵黃高磷蛋白粗品(PVi) 2. 459g，利用凱氏定氮法測(cè)定氮含量和蛋白質(zhì)含量，采用鑰藍(lán)法測(cè)磷含量，經(jīng)測(cè)定計(jì)算得蛋白質(zhì)含量63. 29%，磷含量(百分比)為4. 76%，N/P為4. 71，回收率94. 70%，得率2. 39%ο2、卵黃高磷蛋白的純化。D301大孔樹脂交換層析純化卵黃高磷蛋白，層析所采用層析柱規(guī)格為02. OX 20cni,D3Ol交換樹脂填充高度為18cm，平衡緩沖液為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀(50mM、pH值為6. O、NaCl的濃度為O. 3mol/L)。使用前用該平衡緩沖液平衡層析柱。將步驟I所提取卵黃高磷蛋白粗品I. OOg溶于平衡緩沖液中，配成卵黃高磷蛋白濃度為50mg/mL的卵黃高磷蛋白溶液，然后以2mL/min的速度用恒流泵加所配溶液20mL于層析柱內(nèi)，再使用平衡緩沖液洗脫層析柱，最后采用NaCl濃度為O. 7mol/L的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀(50mM、pH值為6. O)作為洗脫液進(jìn)行一步洗脫，流速2mL/min，收集該洗脫液下紫外光對(duì)應(yīng)的的洗脫峰，透析凍干后得到純化后的卵黃高磷蛋白O. 586g，經(jīng)測(cè)量計(jì)算后得蛋白質(zhì)含量86. 78%，磷含量(百分比)為10. 98%，N/P為2. 81，回收率58. 60%，得率
O.65%。本發(fā)明與傳統(tǒng)技術(shù)相比，采用改進(jìn)后的利用廉價(jià)無(wú)毒的乙醇和鹽提取卵黃高磷蛋白的方法，不僅避免采用非食品級(jí)的有機(jī)溶劑實(shí)現(xiàn)卵黃高磷蛋白與脂質(zhì)的分離，而且其很高的卵黃高磷蛋白回收率為下一步的純化奠定了良好的基礎(chǔ)。介于上一步產(chǎn)品中，卵黃高磷蛋白純度偏低(N/P比為4. 44)，不足以應(yīng)用于食品醫(yī)藥等對(duì)純度要求較高的行業(yè)，采用陰離子交換樹脂純化卵黃高磷蛋白，大幅提高了卵黃高磷蛋白的純度(N/P比為2. 73、
2.81、2. 80)，而且其回收率也較高。本工藝各環(huán)節(jié)操作簡(jiǎn)單，設(shè)備成本低廉，易于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，所得卵黃高磷蛋白可直接用于食品醫(yī)藥行業(yè)。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種禽蛋中卵黃高磷蛋白的提取及純化方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)取禽蛋中的卵黃去除水溶性物質(zhì)，采用乙醇脫脂后，用高濃度鹽溶液浸提得到卵黃聞憐蛋白粗品； (2)利用陰離子交換層析法純化上述卵黃高磷蛋白粗品并除鹽，得到高純度的卵黃高憐蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的卵黃高磷蛋白的提取及純化方法，其特征在于，所述卵黃去除水溶性物質(zhì)的過程為取禽蛋中的卵黃加入1-3倍體積(w/v)、溫度為1-10°C的去離子水，在1-10°C低速攪拌O. 5-2h ;然后在1-10°C、4000-6000Xg離心10_30min，棄掉含有水溶性物質(zhì)的上清液，取沉淀得到粗制卵黃脂蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的卵黃高磷蛋白提取及純化工藝，其特征在于，所述乙醇脫脂的過程為向粗制卵黃脂蛋白中加入3-6倍體積(w/v)的乙醇,3000-6000rpm均質(zhì)l_5min,然后在1-1CTC、4000_6000 X g尚心10_30min,取沉淀,重復(fù)上述脫脂過程1-3次，得到脫脂后的卵黃脂蛋白；所述乙醇的濃度為60-90%。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的卵黃高磷蛋白的提取及純化方法，其特征在于，所述高濃度鹽溶液浸提的過程為用5-15倍體積(w/v)、濃度為8-12%的鹽溶液浸提上述脫脂后的卵黃脂蛋白，并用HCl溶液調(diào)節(jié)pH值為3. 0-7. O,于1-10°C攪拌O. 5_2h，然后在1_10°C、4000-6000 X g離心10-30min，棄沉淀取含有卵黃高磷蛋白的上清液，將含有卵黃高磷蛋白的上清液脫鹽凍干，得到卵黃高磷蛋白粗品。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的卵黃高磷蛋白的提取及純化方法，其特征在于，所述鹽溶液為NaCl溶液或(NH4)2SO4溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的卵黃高磷蛋白的提取及純化方法，其特征在于，所述陰離子交換層析法包括下述步驟 a、將卵黃高磷蛋白粗品溶于pH值為5.0-7.0、20-50mmol/L含NaCl的平衡緩沖液，至卵黃高磷蛋白終濃度為10_50mg/mL，得到卵黃高磷蛋白溶液； b、將上述卵黃高磷蛋白溶液以恒定流速加入裝有陰離子交換樹脂且已用所述平衡緩沖液平衡的層析柱內(nèi)，然后再以所述平衡緩沖液洗脫層析柱； C、采用pH值為5. 0-7. 0、20-50mmol/L含NaCl的洗脫液進(jìn)行一步洗脫，收集洗脫峰，透析凍干后得到高純度的卵黃高磷蛋白；所述洗脫峰是指在PH值為5. 0-7. 0、20-50mmol/L且NaCl濃度為O. 5-1. OmoI/L的洗脫液下紫外吸收峰對(duì)應(yīng)的流出液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的卵黃高磷蛋白的提取及純化方法，其特征在于，所述平衡緩沖液為磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀或乙酸-乙酸鈉緩沖液，所含NaCl 的濃度為 O. 2-0. 4mol/L0
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的卵黃高磷蛋白的提取及純化方法，其特征在于，所述洗脫液為磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀或乙酸-乙酸鈉緩沖液，所述洗脫液中NaCl的濃度為O. 5-1. OmoI/Lο
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的卵黃高磷蛋白提取及純化工藝，其特征在于，所述陰離子交換樹脂為指交聯(lián)葡聚糖系、瓊脂糖系或大孔苯乙烯系。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種禽蛋中卵黃高磷蛋白的提取及純化方法，而提供一種可直接在食品醫(yī)藥等純度要求較高的行業(yè)應(yīng)用，所得產(chǎn)品純度高，操作簡(jiǎn)單，易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的禽蛋中卵黃高磷蛋白的提取及純化方法。包括如下步驟取禽蛋中的卵黃去除水溶性物質(zhì)，采用乙醇脫脂后，用高濃度鹽溶液浸提得到卵黃高磷蛋白粗品；利用陰離子交換層析法純化上述卵黃高磷蛋白粗品并除鹽，得到高純度的卵黃高磷蛋白。本發(fā)明的方法采用陰離子交換樹脂純化卵黃高磷蛋白，大幅提高了卵黃高磷蛋白的純度，而且其回收率也較高。本工藝各環(huán)節(jié)操作簡(jiǎn)單，設(shè)備成本低廉，易于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，所得卵黃高磷蛋白可直接用于食品醫(yī)藥行業(yè)。
文檔編號(hào)C07K14/465GK102936280SQ20121047578
公開日2013年2月20日 申請(qǐng)日期2012年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月21日
發(fā)明者吳子健, 王亮, 呂瑜峰, 李建穎, 孫佩佩 申請(qǐng)人:天津商業(yè)大學(xué)