一種除去食源性低聚肽中細(xì)菌內(nèi)毒素的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種除去食源性低聚肽中細(xì)菌內(nèi)毒素的方法，它包括以下步驟：(1)用去離子水將食源性低聚肽配制成溶液；(2)卷式超濾膜進(jìn)行加壓過濾；(3)收集濾液，噴霧干燥法進(jìn)行干燥處理；(4)采用凝膠法檢測產(chǎn)品細(xì)菌內(nèi)毒素含量。最終制得的產(chǎn)品細(xì)菌內(nèi)毒素含量＜50EU/g，食源性低聚肽回收率＞75％。本發(fā)明具有細(xì)菌內(nèi)毒素去除率高、選擇性好、超濾膜可反復(fù)使用、工藝穩(wěn)定性強(qiáng)、過程簡單、易于放大等優(yōu)點，適用于多種食源性低聚肽的生產(chǎn)過程，為食源性低聚肽產(chǎn)品品質(zhì)的提高提供了技術(shù)基礎(chǔ)。
【專利說明】一種除去食源性低聚肽中細(xì)菌內(nèi)毒素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種除去食源性低聚肽中細(xì)菌內(nèi)毒素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)菌內(nèi)毒素(Endotoxin)是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁上的特有結(jié)構(gòu)，其本質(zhì)為脂多糖(LipopolySaccharide, LPS),在化學(xué)結(jié)構(gòu)上主要由兩部分組成，即多糖和類脂A,其中類脂A為活性中心。細(xì)菌內(nèi)毒素在細(xì)菌生活狀態(tài)時不釋放出來，只有當(dāng)細(xì)菌死亡解體或粘附于其它細(xì)胞上時才表現(xiàn)出其毒性。細(xì)菌內(nèi)毒素為主要的熱原物質(zhì)，微量的細(xì)菌內(nèi)毒素進(jìn)入人體循環(huán)系統(tǒng)就會引起發(fā)熱、腹瀉、血管擴(kuò)張、休克、甚至死亡。
[0003]食源性低聚肽為以動植物食物蛋白為原料，經(jīng)生物酶水解、分離純化等步驟得到的小分子肽類的混合物，可作為普通食品、保健食品、藥品及細(xì)胞培養(yǎng)基的原材料。由于食源性低聚肽的生產(chǎn)原料來源廣泛，無統(tǒng)一質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并且食源性低聚肽為蛋白質(zhì)酶解的產(chǎn)物，營養(yǎng)物質(zhì)豐富，在加工及儲藏過程中會有大量細(xì)菌繁殖，再加上加工輔料、生產(chǎn)環(huán)境、設(shè)備、操作等因素的影響，極易引起細(xì)菌內(nèi)毒素污染。因而從上游原料及相應(yīng)中間體的細(xì)菌內(nèi)毒素指標(biāo)極其不穩(wěn)定，進(jìn)而影響食源性低聚肽最終產(chǎn)品質(zhì)量。
[0004]食源性低聚肽可作為離體細(xì)胞生命活動所需營養(yǎng)物質(zhì)及功能因子的來源，有效代替血清，用于細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)及蛋白質(zhì)藥物、疫苗等生物制品的生產(chǎn)制備。由于各國藥審部門對生物制品中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量均有嚴(yán)格規(guī)定，因此應(yīng)對應(yīng)用于生物制藥領(lǐng)域的食源性低聚肽的細(xì)菌內(nèi)毒素含量進(jìn)行嚴(yán)格限制。此外，新生兒及嬰兒的自身呼吸道、消化道屏障相對脆弱，較高水平的內(nèi)毒素會導(dǎo)致高熱、呼吸急促、心律不齊、心音低鈍，血壓下降、休克等現(xiàn)象，因此應(yīng)嚴(yán)格控制應(yīng)用于嬰兒食品中的食源性低聚肽內(nèi)毒素含量。為了得到質(zhì)量穩(wěn)定、安全性高的食源性低聚肽產(chǎn)品，開發(fā)一種生產(chǎn)成本低、可行有效、易于擴(kuò)大的去除細(xì)菌內(nèi)毒素的方法越來越重要。
[0005]常用的去除細(xì)菌內(nèi)毒素的方法包括活性炭吸附法、離子交換樹脂法，酸堿化學(xué)處理法、熱處理法、親和層析法、超濾法等。食源性低聚肽屬于生物活性物質(zhì)，酸堿化學(xué)處理法及熱處理法會破壞其結(jié)構(gòu)和活性；活性炭吸附法選擇性差、不易解吸、不易重復(fù)利用?’離子交換樹脂法及親和層析等方法具有成本較高、處理量有限、生產(chǎn)不易擴(kuò)大等缺點，因而均不適宜用于工業(yè)化水平的食源性低聚肽中細(xì)菌內(nèi)毒素的去除；超濾法具有選擇性好、易于重復(fù)利用、成本較低、處理量大等優(yōu)點，是去除生物活性物質(zhì)中細(xì)菌內(nèi)毒素的合理選擇。中國專利CN102631842A采用平均孔徑為2~50nm的無機(jī)超濾膜去除大批量生物醫(yī)藥制劑中的細(xì)菌內(nèi)毒素，去除效果好，并有效保留了制劑中的活性成分。中國專利CN102327605A公布了四價腦膜炎球菌多糖疫苗的制備工藝，其中涉及采用截留分子量為6000Da的超濾膜進(jìn)行除細(xì)菌內(nèi)毒素處理，保證了疫苗的純度及活性，同時減少了工藝成本。中國專利CN102086234A在制備藥用級中等分子量羥乙基淀粉的過程中，先后采用截留分子量為30萬和10萬的濾膜對料液進(jìn)行超濾，能有效去除細(xì)菌內(nèi)毒素，使產(chǎn)品內(nèi)毒素含量符合國家藥典規(guī)定。目前超濾法已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥制劑的生產(chǎn)中，而尚無報道采用此法去除食源性低聚肽中的細(xì)菌內(nèi)毒素。細(xì)菌內(nèi)毒素分子量從幾千至數(shù)千萬不等，而食源性低聚肽分子量90%以上均小于lOOODa，二者之間存在很大差異，因此可選擇合適孔徑及材質(zhì)的超濾膜將二者有效分離。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)不足，提供一種利用卷式超濾膜去除食源性低聚肽中細(xì)菌內(nèi)毒素的方法。該方法既能保證有效去除多種食源性低聚肽中的細(xì)菌內(nèi)毒素，又能高效回收食源性低聚肽，并且具有選擇性好、可重復(fù)使用、易于放大、生產(chǎn)成本低、工藝設(shè)計合理、不破壞食源性低聚肽結(jié)構(gòu)及活性的優(yōu)點。
[0007]本發(fā)明是利用細(xì)菌內(nèi)毒素和食源性低聚肽分子量之間的差異來設(shè)計的，通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn):
[0008]一種除去食源性低聚肽中細(xì)菌內(nèi)毒素的方法，它包括以下步驟:
[0009](I)用細(xì)菌內(nèi)毒素含量< 0.125EU/mL的去離子水將食源性低聚肽配制成濃度為
0.15g/ml~0.3g/ml的溶液,其中溶液可采用磁力攪拌3~15min及超聲波處理2~IOmin的方法加速其溶解；
[0010](2)待低聚肽充分溶解后，采用截留分子量為5000~13000Da的卷式超濾膜進(jìn)行加壓過濾，過膜壓力為8~12psi ；
[0011](3)收集濾液，并立即采用噴霧干燥法進(jìn)行干燥處理，所得產(chǎn)品水分含量為
1.5%~5% ；
[0012](4)采用凝膠法檢測產(chǎn)品細(xì)菌內(nèi)毒素含量。最終制得的產(chǎn)品細(xì)菌內(nèi)毒素含量
<50EU/g，食源性低聚肽回收率> 75%。
[0013]上述步驟(1)中所述食源性低聚肽為玉米低聚肽、小麥低聚肽、大豆低聚肽、豌豆低聚肽、大米低聚肽、棉籽低聚肽等植物源低聚肽，或膠原低聚肽、乳清低聚肽、烏雞低聚肽、牡蠣低聚肽等動物源低聚肽。根據(jù)不同低聚肽的溶解度不同，選擇合適的溶液濃度。所述食源性低聚肽分子量低于1000Da的組分占90%以上，細(xì)菌內(nèi)毒素含量> 200EU/g。
[0014]上述步驟(2)中所述超濾膜材料為聚偏氟乙烯(PVDF)、聚醚砜(PES)、聚丙烯(PP)、聚砜(PS)等，在使用前后經(jīng)細(xì)菌內(nèi)毒素含量<0.125EU/mL的去離子水清洗，可循環(huán)使用。
[0015]上述步驟(3)中所述噴霧干燥凈化空氣進(jìn)口溫度為120~180°C，出口溫度為65 ~90?。
[0016]上述步驟中與食源性低聚肽溶液及粉末直接接觸的器皿均去除細(xì)菌內(nèi)毒素，所用方法為IM的NaOH溶液浸泡I小時以上后經(jīng)細(xì)菌內(nèi)毒素含量< 0.125EU/mL的去離子水洗至中性，或250°C烘烤lh。
[0017]上述步驟(4)中所述細(xì)菌內(nèi)毒素測定采用特異性鱟試劑，排除(1，3) β-D-葡聚糖干擾，并同時做靈敏度復(fù)核實驗及干擾實驗，確保檢測結(jié)果的可靠性。
【具體實施方式】
[0018]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于以下所述。
[0019]實施例1:
[0020]一種除去玉米低聚肽中細(xì)菌內(nèi)毒素的方法，它包括以下步驟:
[0021](I)玉米低聚肽原料細(xì)菌內(nèi)毒素含量〉2X105EU/g，用細(xì)菌內(nèi)毒素含量
<0.125EU/mL的去離子水將其配制成濃度為0.22g/ml的溶液，并采用磁力攪拌7min及超聲波處理5min的方法加速其溶解；
[0022](2)待玉米低聚肽充分溶解后，米用截留分子量為8000Da、材質(zhì)為聚偏氟乙烯(PVDF)的卷式超濾膜進(jìn)行加壓過濾，過膜壓力為IOpsi ；
[0023](3)收集濾液，并立即采用噴霧干燥法進(jìn)行干燥處理，噴霧干燥凈化空氣進(jìn)口溫度為150°C，出口溫度為79°C，液體流速為220ml/h，所得產(chǎn)品水分含量為2.3% ；
[0024](4)采用特異性凝膠鱟試劑法檢測產(chǎn)品細(xì)菌內(nèi)毒素含量。最終制得的產(chǎn)品細(xì)菌內(nèi)毒素含量< 50EU/g，清除率> 99.9%，玉米低聚肽回收率為80.3%。
[0025]上述步驟中與玉米低聚肽溶液及粉末直接接觸的器皿均去除細(xì)菌內(nèi)毒素，所用方法為IM的NaOH溶液浸泡I小時以上后經(jīng)細(xì)菌內(nèi)毒素含量< 0.125EU/mL的去離子水洗至中性，或250°C烘烤Ih。
[0026]實施例2:
[0027]一種除去小麥低聚肽中細(xì)菌內(nèi)毒素的方法，它包括以下步驟:
[0028](I)小麥低聚肽原料細(xì)菌內(nèi)毒素含量> 5 X IO3EU/g,用細(xì)菌內(nèi)毒素含量
<0.125EU/mL的去離子水將其配制成濃度為0.18g/ml的溶液，并采用磁力攪拌12min及超聲波處理8min的方法加速其溶解；
[0029](2)待小麥低聚肽充分溶解后，采用截留分子量為5000Da、材質(zhì)為聚醚砜(PES)的卷式超濾膜進(jìn)行加壓過濾，過膜壓力為Spsi ；
[0030](3)收集濾液,并立即采用噴霧干燥法進(jìn)行干燥處理,噴霧干燥凈化空氣進(jìn)口溫度為175°C，出口溫度為86°C，液體流速為180ml/h，所得產(chǎn)品水分含量為1.6% ；
[0031](4)采用特異性凝膠鱟試劑法檢測產(chǎn)品細(xì)菌內(nèi)毒素含量。最終制得的產(chǎn)品細(xì)菌內(nèi)毒素含量< 50EU/g，清除率> 99%，小麥低聚肽回收率為76.6%。
[0032]上述步驟中與小麥低聚肽溶液及粉末直接接觸的器皿均去除細(xì)菌內(nèi)毒素，所用方法為IM的NaOH溶液浸泡I小時以上后經(jīng)細(xì)菌內(nèi)毒素含量< 0.125EU/mL的去離子水洗至中性，或250°C烘烤Ih。
[0033]實施例3:
[0034]一種除去膠原低聚肽中細(xì)菌內(nèi)毒素的方法，它包括以下步驟:
[0035](I)膠原低聚肽原料細(xì)菌內(nèi)毒素含量〉2X 104EU/g，用細(xì)菌內(nèi)毒素含量
<0.125EU/mL的去離子水將其配制成濃度為0.28g/ml的溶液，并采用磁力攪拌5min及超聲波處理6min的方法加速其溶解；
[0036](2)待膠原低聚肽充分溶解后，采用截留分子量為13000Da、材質(zhì)為聚砜(PS)的卷式超濾膜進(jìn)行加壓過濾，過膜壓力為12psi ；
[0037](3)收集濾液，并立即采用噴霧干燥法進(jìn)行干燥處理，噴霧干燥凈化空氣進(jìn)口溫度為135°C，出口溫度為71°C，液體流速為240ml/h，所得產(chǎn)品水分含量為4.6% ；
[0038](4)采用特異性凝膠鱟試劑法檢測產(chǎn)品細(xì)菌內(nèi)毒素含量。最終制得的產(chǎn)品細(xì)菌內(nèi)毒素含量< 50EU/g，清除率> 99.7%，膠原低聚肽回收率為82.9%。[0039]上述步驟中與膠原低聚肽溶液及粉末直接接觸的器皿均去除細(xì)菌內(nèi)毒素，所用方法為IM的NaOH溶液浸泡I小時以上后經(jīng)細(xì)菌內(nèi)毒素含量< 0.125EU/mL的去離子水洗至中性，或250°C烘烤Ih。
【權(quán)利要求】
1.一種除去食源性低聚肽中細(xì)菌內(nèi)毒素的方法，其特征在于所述方法包括下述步驟: (1)用細(xì)菌內(nèi)毒素含量<0.125EU/mL的去離子水將食源性低聚肽配制成濃度為0.15g/ml~0.3g/ml的溶液,磁力攪拌3~15min及超聲波處理2~IOmin,加速其溶解； (2)待低聚肽充分溶解后，采用截留分子量為5000~13000Da的卷式超濾膜進(jìn)行加壓過濾，過膜壓力為8~12psi ； (3)收集濾液，并立即采用噴霧干燥法進(jìn)行干燥處理； (4)采用凝膠法檢測食源性低聚肽產(chǎn)品細(xì)菌內(nèi)毒素含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于步驟(2)中所述超濾膜材料為聚偏氟乙烯(PVDF)、聚醚砜(PES)、聚丙烯(PP)、聚砜(PS)，在使用前后經(jīng)細(xì)菌內(nèi)毒素含量< 0.125EU/mL的去離子水清洗，可循環(huán)使用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于最終制得的產(chǎn)品細(xì)菌內(nèi)毒素含量<50EU/g，食源性低聚肽回收率> 75%。
【文檔編號】C07K1/34GK103833825SQ201210479142
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年11月23日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月23日
【發(fā)明者】蔡木易, 谷瑞增, 林峰, 劉艷, 張海欣, 易維學(xué), 魯軍, 馬勇, 董哲, 潘興昌, 馬永慶, 徐亞光, 金振濤, 陳亮, 劉文穎, 魏穎, 陸路 申請人:中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院