一種抗cp4 epsps單克隆抗體的制備方法、編碼序列及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種針對(duì)轉(zhuǎn)基因中常見的抗草甘膦抗性蛋白-5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate?synthase，EPSPS)的單克隆抗體及其制備方法，目的是提供一種新的可以檢測(cè)天然轉(zhuǎn)基因植物(大豆、玉米、棉花和水稻等)中是否存在CP4?EPSPS蛋白的單克隆抗體。制備該單克隆抗體的專用抗原，是根據(jù)已公布的CP4?EPSPS基因序列通過大腸桿菌進(jìn)行重組表達(dá)得到的。該單克隆抗體的亞型為IgG1，親和常數(shù)達(dá)到2.35×108。該單克隆抗體能識(shí)別轉(zhuǎn)基因植物中的CP4?EPSPS蛋白，可用于轉(zhuǎn)CP4?EPSPS基因植物的檢測(cè)。本發(fā)明還提供了該單克隆抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)編碼序列。
【專利說明】—種抗CP4 EPSPS單克隆抗體的制備方法、編碼序列及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種可以與轉(zhuǎn)基因植物中外源基因表達(dá)蛋白結(jié)合的抗體。具體而言，本發(fā)明提供了一種抗轉(zhuǎn)基因植物中常見的草甘膦抗性蛋白-5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvyl-shikimate_3-phosphate synthase,EPSPS)的單克隆抗體，可用于制備檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物中常見CP4 EPSPS蛋白的試劑盒，屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]草甘膦(Glyphosate)是一種廣泛使用的除草劑，具有高效、低毒、廣譜和易分解的特點(diǎn)，我國是草甘膦的生產(chǎn)和使用大國?？共莞熟⒌霓D(zhuǎn)基因植物是轉(zhuǎn)基因研究的重要對(duì)象，目前抗草甘膦轉(zhuǎn)基因植物是全球種植面積最大的轉(zhuǎn)基因品種，在抗草甘膦的基因中使用最多的是草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(glyphosate N acetyhransferase)基因，即GAT基因和5_烯醇丙酮酸-莽草酸-3-憐酸合成酶(5-enolpyruvyl-shikimate_3-phosphatesynthase),即EPSPS,其中又以孟山都(Monsato)從土壤農(nóng)桿菌的CP4株系(Agrobacteriumstrain CP4)克隆的 CP4EPSPS 基因(5_enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases,美國專利US5633435)使用最為廣泛，目前廣泛用于大豆、玉米和棉花等轉(zhuǎn)基因作物中。通過將該基因的5’端與來自矮牽牛(Petunia)EPSPS基因的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(Transitpeptide)融合而使其產(chǎn)物高效定位于植物的葉綠體。
[0003]隨著轉(zhuǎn)CP4 EPSPS基因植物的不斷發(fā)展及其商品化的種類不斷增加，轉(zhuǎn)基因生物本身的安全性以及它們對(duì)人類健康和生態(tài)環(huán)境的潛在威脅成為國際社會(huì)和廣大民眾廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)問題之一。包括我國在內(nèi)的越來越多的國家制定并實(shí)施了轉(zhuǎn)基因食品的強(qiáng)制標(biāo)識(shí)制度。因此，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的科學(xué)管理和應(yīng)用需要得到轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品及其成分檢測(cè)技術(shù)的支持。目前，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品及成分檢測(cè)最常用的方法有兩類:一類是針對(duì)其外源核酸成分的檢測(cè)技術(shù)；另一類是針對(duì)其外源蛋白質(zhì)成分的免疫學(xué)分析方法?；贒NA的檢測(cè)方法只能在核酸水平上反映轉(zhuǎn)基因樣品是否含有外源`DNA，不能檢測(cè)其外源基因是處于沉默還是表達(dá)，因此，其檢測(cè)結(jié)果與轉(zhuǎn)基因外源蛋白的實(shí)際含量并無直接關(guān)聯(lián)。加之，DNA在加工過程中會(huì)因降解掉而難以檢測(cè)，而核酸檢測(cè)方法必須經(jīng)過專門的核酸提取和純化過程，增加了額外的工作量。利用。基于外源蛋白的免疫學(xué)分析方法，如酶聯(lián)免疫分析法，采用高度特異性的抗原抗體反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因植物樣本快速、準(zhǔn)確、高效的檢測(cè)，其技術(shù)關(guān)鍵是制備具有高度特異性的抗體，為提高檢測(cè)的特異性和靈敏度，可以采用多克隆抗體與單克隆抗體配合或者單克隆抗體配合實(shí)現(xiàn)夾心ELISA檢測(cè)的方式。
[0004]用于抗草甘膦轉(zhuǎn)基因的抗(耐)性基因主要是草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(GAT)基因和5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)基因。對(duì)于轉(zhuǎn)CP4 EPSPS植物的檢測(cè)多采取基于PCR的核酸檢測(cè)方法(劉彩霞，高宏偉，梁成珠，徐彪，孫敏及林超，用于檢測(cè)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆及加工品EPSPS基因的引物，中國專利200910003367.8 ;沈文飚，黃明，吳洪洪，肖笑，周興虎，徐晟，謝彥杰，何健及周光宏，檢測(cè)轉(zhuǎn)cp4-印sps基因大豆及其深加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成份的方法及試劑盒，中國專利201010249480.7)及其它等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(汪琳，賴平安，柏亞鐸，羅英，周琦，蒲靜，張偉，高志強(qiáng)，張向東，齊瑋，凌鳳俊，張瑞宏，李東燕，喬彩霞，吳丹，谷強(qiáng)，張利峰，段向英及劉輝，一種檢測(cè)轉(zhuǎn)EPSPS基因作物的核酸恒溫?cái)U(kuò)增試劑盒及方法，中國專利201010233350.4，曹以誠，杜正平，陳洵，李志勇及高東微，Roundup Ready轉(zhuǎn)基因大豆EPSPS基因檢測(cè)用引物組、快速診斷試劑盒和檢測(cè)方法，中國專利200910213995.9)。在采用抗體檢測(cè)的研究中多數(shù)為多抗方法(黃明，沈文飚，吳洪洪，肖笑，徐晟，周興虎，何健及周光宏，與CP4-EPSPS蛋白發(fā)生特異性抗原抗體反應(yīng)的多克隆抗體及其應(yīng)用，中國專利201010225353.3 ;王保民，劉威，鄧艾興，李召虎，趙靜，何素平，南鐵貴，俞彩霞及何鐘佩，一種EPSPS酶的抗體及其制備方法與專用抗原及應(yīng)用，中國專利200610089306.4)。多抗的成分復(fù)雜，不同生產(chǎn)批次間的質(zhì)量穩(wěn)定性難以控制，并不適宜用于檢測(cè)產(chǎn)品的開發(fā)。此外，相關(guān)專利所涉及的均為單一抗原性多肽為免疫原，難以獲得親和力很高的抗體。在CP4 EPSPS的單抗制備及試劑盒開發(fā)中敬凌霞等利用重組的CP4 EPSPS蛋白制備了單克隆抗體，其效價(jià)達(dá)到I X IO6-1XlO8,相對(duì)親和力為IXlO5到I XlO6 (敬凌霞，蔡雪飛，慕生枝，劉湘，張君，唐霓，鄭建及黃愛龍，抗CP4-EPSPS單克隆抗體的制備和生物學(xué)特性的鑒定，細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志2007，(5))。因其所獲得的單抗親和力僅為IO6左右，且兩株抗體識(shí)別的表位相似或相同，故并不能滿足配對(duì)檢測(cè)和靈敏度的要求。其它相關(guān)基于抗體的免疫檢測(cè)試劑盒的文獻(xiàn)并未對(duì)所用抗體的性質(zhì)給予明確闡述(林敏；張維；陳明；平淑珍；陸偉，一種聯(lián)檢EPSPS和BT蛋白的試劑盒及方法，中國專利200510086760.X ;梅曼彤；許少鵬；趙均良；姚涓；穆虹；周峰及姜大剛，一種檢測(cè)耐除草劑大豆中EPSPS基因的酶聯(lián)免疫試劑盒及其使用方法，中國專利200710027712.2)。
[0005]目前國外已有多種檢測(cè)CP4 EPSPS的產(chǎn)品問世(Agdia的試紙條產(chǎn)品STX 74000及夾心ELISA產(chǎn)品PSP 74000) ，但這些產(chǎn)品以試紙條方法為主，且價(jià)格昂貴，不易推廣使用，國內(nèi)尚無同類產(chǎn)品生產(chǎn)和銷售。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種能針對(duì)轉(zhuǎn)基因植物中常見的CP4 EPSPS蛋白的單克隆抗體制備方法。
[0007]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種特異性好的單克隆抗體，該抗體能特異結(jié)合CP4EPSPS重組抗原和天然抗原。
[0008]本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種可以用于實(shí)驗(yàn)室或田間檢測(cè)農(nóng)作物種籽或葉片中是否帶有CP4 EPSPS蛋白的檢測(cè)試劑。
[0009]解決技術(shù)問題所采用的技術(shù)手段
[0010]本發(fā)明對(duì)轉(zhuǎn)基因植物中常用的CP4 EPSPS蛋白，按照公布的序列合成引物，將編碼CP4 EPSPS完整基因的序列克隆進(jìn)帶有標(biāo)簽肽的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒載體pET-BPI中進(jìn)行重組表達(dá)，取表達(dá)產(chǎn)物的可溶部分進(jìn)行親和純化后作為免疫原，免疫Balb/c小鼠。經(jīng)細(xì)胞融合、重組CP4 EPSPS篩選克隆，獲得高效分泌單克隆抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞系。
[0011]利用該雜交瘤細(xì)胞系用小鼠進(jìn)行腹水制備，ProteinA/G柱親和層析純化腹水,獲得鼠單克隆抗體。用ELISA技術(shù)測(cè)定該單克隆抗體的亞類為IgGl型單克隆抗體，親和常數(shù)為2.35X 108。免疫印記(Western blotting)實(shí)驗(yàn)顯示該抗體能特異識(shí)別重組的CP4 EPSPS蛋白以及轉(zhuǎn)CP4 EPSPS的轉(zhuǎn)基因大豆標(biāo)準(zhǔn)品，而不識(shí)別其他轉(zhuǎn)基因蛋白，如CrylAb/lAc融合蛋白。與CP4 EPSPS多抗形成的雙抗體夾心可以檢測(cè)低至10ng/ml的CP4 EPSPS蛋白。
[0012]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及有益效果
[0013](I)本發(fā)明獲得的單克隆抗體，能識(shí)別重組蛋白CP4 EPSPS，具有檢測(cè)轉(zhuǎn)CP4 EPSPS基因的轉(zhuǎn)基因植物的用途。
[0014](2)本發(fā)明獲得的單克隆抗體與從轉(zhuǎn)基因大豆的種子的蛋白提取物中的CP4EPSPS蛋白的結(jié)合有極強(qiáng)特異性和敏感性。
[0015](3)本發(fā)明獲得的單克隆抗體可應(yīng)用于免疫印記(Western blotting)、雙抗體夾心ELISA、間接ELISA、抗體芯片制備等轉(zhuǎn)基因植物的檢測(cè)與篩查，特異性和靈敏度高，具有很高的使用價(jià)值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1:純化的CP4-EPSPS蛋白
[0017]所純化的重組CP4 EPSPS為可溶狀態(tài)，其純度在90%左右，濃度高于1.5mg/ml。I:經(jīng)純化的CP4 EPSPS重組蛋白；2:分子量標(biāo)記。
[0018]圖2:CP4-EPSPS抗體的識(shí)別特性和實(shí)際應(yīng)用效果
[0019]應(yīng)用純化的CP4 EPSPS單克隆抗體可以特異的檢出CP4 EPSPS重組蛋白及轉(zhuǎn)基因大豆種籽中的CP4 EPSPS蛋白，但對(duì)于非轉(zhuǎn)基因大豆和無關(guān)蛋白則沒有結(jié)合活性。1:分子量標(biāo)記；2:重組CP4 EPSPS 10ng;3:重組CP4 EPSPS 5ng ;4:轉(zhuǎn)基因大豆RRS蛋白提取物10 μ I ；5:非轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)照10 μ I ；6:無關(guān)蛋白對(duì)照CryIAb/IAc IOng0 [0020]圖3:CP4-EPSPS抗體用于雙抗夾心ELISA的檢測(cè)效果
[0021]CP4 EPSPS單克隆抗體與多克隆抗體配對(duì)，可檢測(cè)低至10ng/ml的CP4 EPSPS蛋白。包被抗體為本發(fā)明的CP4 EPSPS單克隆抗體，檢測(cè)抗體為CP4 EPSPS多抗。檢測(cè)樣品為重組的標(biāo)準(zhǔn)CP4 EPSPS蛋白。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合圖表和具體實(shí)施的方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步闡述，以使本領(lǐng)域技術(shù)人員可以更清楚地得知本發(fā)明的技術(shù)方案，并非對(duì)本發(fā)明的限制。
[0023]實(shí)施例1重組CrylA蛋白的制備
[0024]一、基因克隆
[0025]按照公布的CP4 EPSPS 的基因編碼序列(Genbank Accession N0.AF464188),設(shè)計(jì)特異性上游引物(SEQ ID N0.3)和下游引物(SEQ ID N0.4)從Roundup Ready (RR)轉(zhuǎn)基因大豆DNA標(biāo)準(zhǔn)品中擴(kuò)增CP4 EPSPS基因，在PCR的方法在該融合蛋白基因的5’和3’端分別加入NcoI和BamHI酶切位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后回收，分別對(duì)回收的融合蛋白基因和用于表達(dá)的質(zhì)粒載體pET-BPI進(jìn)行NcoI和BamHI酶切，再次電泳回收，以T4DNA連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21，挑取平板上的克隆接種，提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行PCR鑒定。PCR顯示融合蛋白基因陽性的克隆進(jìn)行測(cè)序分析，序列完全正確的克隆用于表達(dá)重組的CP4 EPSPS蛋白。
[0026]二、蛋白表達(dá)和純化[0027]按1: 100的比例將單菌落培養(yǎng)的過夜菌轉(zhuǎn)接至100ml LB培養(yǎng)基，加入終濃度為50 μ g/ml的卡那霉素，37°C振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6~0.8。加入0.lmol/L的IPTG，25°C震蕩培養(yǎng)8h，收菌后超聲破碎。該重組蛋白帶有組氨酸標(biāo)簽，使用Ni柱進(jìn)行蛋白質(zhì)的親和純化。用不同濃度的咪唑溶液進(jìn)行洗脫后，將各組分和流穿分別上樣進(jìn)行SDS-PAGE分離檢測(cè)，圖1為重組CP4 EPSPS蛋白的表達(dá)和純化結(jié)果。重組CP4 EPSPS蛋白的純度在90%以上，濃度約為1-1.5mg/mL，可以滿足免疫動(dòng)物和抗體篩選與鑒定的要求。
[0028]實(shí)施例2雜交瘤細(xì)胞系的建立
[0029]一、免疫
[0030]將實(shí)施例1中交聯(lián)的多肽用弗氏完全佐劑(Sigma公司)乳化，免疫4_6周齡雌性Balb/c小鼠(由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供)，腹部皮下注射每只小鼠6點(diǎn)，劑量為60yg/只。每14天加強(qiáng)免疫一次，抗原使用弗氏非完全佐劑(Sigma公司)乳化，劑量為30 μ g/只。第3次加強(qiáng)免疫后7天以間接ELISA(波長(zhǎng)450nm)檢測(cè)小鼠血清中抗免疫原的多抗效價(jià)，效價(jià)最高的小鼠以尾靜脈注射沖擊免疫，抗原用生理鹽水混勻，劑量為50 μ g/只。
[0031]二、細(xì)胞融合
[0032]無菌制備免疫達(dá)標(biāo)的小鼠脾細(xì)胞懸液，與小鼠骨髓瘤細(xì)胞sp2/0 (ATCC)以5: I比例混合，離心1500rpm，5min。棄上清后離心管放入37°C水浴中，在I分鐘內(nèi)緩慢加入Iml的PEG1500(ROche公司)，并攪動(dòng)細(xì)胞。在溫水中靜置Imin后，加入IOml無血清的IMDM (Sigma公司),混勻，離心1000rpm, 5min。棄上清后，加入IOml血清(PAA公司)小心的將細(xì)胞吹打起來，并加入5ml混合IOxHAT (Sigma公司)的胸腺細(xì)胞，混勻。再加入25ml含有2.1%硝基纖維素(Sigma公司)的半固體培養(yǎng)基充分混勻，然后均勻的倒入20個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中。將細(xì)胞培養(yǎng)皿放入到濕盒中，放入37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0033]三、挑克隆
[0034]融合后7天克隆細(xì)胞團(tuán)大小密度適中，在解剖鏡下，吸取圓、實(shí)、大的克隆團(tuán)打入事先準(zhǔn)備好培養(yǎng)基的96孔培養(yǎng)板中，放入37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0035]四、ELISA篩選陽性雜交瘤細(xì)胞
[0036]3天后，細(xì)胞量大約占底面積2/3，取100 μ I上清用免疫原和合成多肽分別進(jìn)行ELISA篩選。陽性克隆完全換液，加入200 μ I含飼養(yǎng)細(xì)胞和I % HT (Sigma公司)的完全培養(yǎng)基。兩天后進(jìn)行第二次ELISA篩選，陽性克隆轉(zhuǎn)入事先準(zhǔn)備好培養(yǎng)基(含飼養(yǎng)細(xì)胞和HT)的24孔板培養(yǎng)。五天后取100 μ I上清進(jìn)行第三次ELISA篩選，陽性克隆逐次轉(zhuǎn)入6孔板和細(xì)胞培養(yǎng)瓶擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存。
[0037]實(shí)施例3腹水誘生法制備單克隆抗體
[0038]一、腹水制備
[0039]對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基洗滌并懸起，計(jì)數(shù)~5X105，lml。懸浮的細(xì)胞腹腔注射事先用石蠟油致敏的小鼠。7天后開始收集腹水。取出的腹水于4°C離心4000rpm，IOmin。小心吸出中間的腹水 收集于離心管中，4°C或-20°C保存。
[0040]二、單克隆抗體的純化
[0041]用HiTrap rProtein A FF(GE公司)親和層析法按說明書從腹水中純化抗體。SDS-PAGE膠鑒定純度，Bradford法測(cè)定濃度。純化的抗體保存于_20°C。
[0042]實(shí)施例4單克隆抗體特性鑒定[0043]一、亞類鑒定
[0044]用IOOmM PBS(pH7.4)稀釋包被羊抗鼠IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)至0.5μ g/ml，每孔加100μ 1，4°C，過夜。傾空液體，用含0.05% Tween的PBS (PBS-T)洗3次，每孔加入200 μ I封閉液(含2% BSA和3%蔗糖的PBS)，37°C孵育lh。傾空液體，用PBS-T清洗3次。每孔加入0.1ml雜交瘤上清，37°C孵育Ih。傾空液體用PBS-T清洗3次。用封閉液1: 1000稀釋HRP標(biāo)記的羊抗鼠(K，λ )抗體或1: 2000稀釋HRP標(biāo)記的羊抗鼠(IgM, IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA)抗體(Southern Biotech 公司)0.1ml 每孔分別加入適當(dāng)?shù)目字校?7°C孵育lh。傾空液體，用PBS-T清洗3次。每孔加50μ1含0.15%ABTS (Southern Biotech公司)和0.03 % H2O2的檸檬酸緩沖液(PH4.0)進(jìn)行顯色反應(yīng)，10-20min內(nèi)測(cè)定405nm波長(zhǎng)下的OD值。結(jié)果顯示，本發(fā)明單克隆抗體為IgGl型鼠源單克隆抗體。
[0045]二、親和常數(shù)測(cè)定
[0046]包被重組CP4EPSPS蛋白，包被濃度為2yg/ml，100y I/孔，4°C包被過夜，PBS-T洗3次。每孔加200 μ I封閉液37°C封閉2h，PBS-T洗3次。實(shí)施例4中純化的單克隆抗體，從1: 200開始2倍梯度稀釋，最后I孔留空白對(duì)照，37°C孵育Ih，PBS-T洗3次。HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗1: 20000稀釋，每孔100 μ 1，37°C孵育lh，PBS-T洗3次。每孔加入100μ I含0.1% TMB (Sigma公司)和0.03 % H2O2的檸檬酸-磷酸緩沖液顯色lOmin，加50 μ I 0.5Μ硫酸溶液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450nm的吸光值。畫出OD值對(duì)應(yīng)抗體稀釋倍數(shù)的曲線，找出> 1/2“平臺(tái)OD值”對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)A。利用下列公式計(jì)算出親和常數(shù)為 2.35X 108。
[0047]
【權(quán)利要求】
1.一種單克隆抗體，其特征在于其輕鏈和重鏈可變區(qū)序列具有SEQ ID No:5和6所示的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于其可變區(qū)序列與SEQID No:5和6具有90%以上的同源性。
3.權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于其免疫小鼠用的抗原是將具有序列表中SEQ ID No:1的核苷酸序列編碼經(jīng)由大腸桿菌重組表達(dá)而獲得的重組CP4 EPSPS蛋白。
4.權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于其為小鼠IgGl亞型單克隆抗體。
5.權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于其識(shí)別重組和天然的CP4EPSPS蛋白。
6.權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于其用于免疫印跡，酶聯(lián)免疫檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物(大豆、玉米、棉花和水稻等)中的CP4 EPSPS蛋白。
7.權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于可以作為檢測(cè)試劑用于轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)試劑盒的制備 。
【文檔編號(hào)】C07K16/40GK103848916SQ201210499173
【公開日】2014年6月11日 申請(qǐng)日期:2012年11月29日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月29日
【發(fā)明者】尹長(zhǎng)城, 劉國振, 吳 琳, 郝育杰, 韋漢福, 潘秦, 韓宇寧, 奚文輝, 劉斯奇 申請(qǐng)人:北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司