專利名稱：一種豬ii型圓環(huán)病毒orf2蛋白的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種豬II型圓環(huán)病毒0RF2蛋白的制備方法。
背景技術：
豬II型圓環(huán)病毒(PCV2)是近年來新發(fā)現(xiàn)的動物病毒之一，屬于圓環(huán)病毒科，是一種二十面體對稱、無囊膜、單股環(huán)狀DNA病毒，病毒粒子直徑為17nm，是目前發(fā)現(xiàn)的最小的動物病毒。該病最早于1991年在加拿大西部發(fā)現(xiàn)，根據(jù)致病性的不同，被分為PCV-1和 PCV-2。其中PCV-2對豬有較強的感染性，可經口腔、呼吸道途徑感染不同年齡的豬，引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)等。感染豬出現(xiàn)進行性消瘦、行動遲緩、呼吸困難、黃疸、 皮膚蒼白，甚至死亡，病原學及血清學調查表明，該病在許多國家都廣泛存在，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了很大的損失。PCV-2基因組含ORFl和0RF2，ORFl編碼Rep蛋白，參與病毒復制，0RF2編碼233個氨基酸，是病毒的核衣殼蛋白(Cap)，具有良好的免疫原性，是構建重組疫苗和臨床檢測的首選抗原。大腸桿菌表達系統(tǒng)不僅具有遺傳背景清楚，培養(yǎng)操作簡單、轉導效率高、生長繁殖快、 成本低廉、可以快速大規(guī)模地生產目的蛋白等優(yōu)點，而且其表達外源基因產物的水平遠高于其它基因表達系統(tǒng)，因此大腸桿菌是目前應用最廣泛的蛋白 質表達系統(tǒng)。另外，誘導劑乳糖是一種二糖，沒有毒性，價格低廉，其本身作為一種碳源，可以被菌體代謝利用，乳糖所具備的無毒和價廉的優(yōu)點，使得其在重組蛋白的大規(guī)模發(fā)酵生產中，仍具有優(yōu)于IPTG的潛在價值和優(yōu)勢。豬II型圓環(huán)病毒(PCV2)細胞培養(yǎng)滅活疫苗產量低且國內缺乏對PCV2疫苗統(tǒng)一的生產檢驗方法及標準，這些問題已成為限制該類產品開發(fā)和應用的瓶頸；新型的疫苗如DNA疫苗，免疫效率還有待證實，而國外已有亞單位疫苗上市，能顯著降低病毒血癥，但價格昂貴。豬II型圓環(huán)病毒0RF2蛋白亞單位疫苗中已有關于使用酵母和桿狀病毒表達0RF2蛋白的報道，但酵母表達系統(tǒng)繁瑣，可能存在蛋白切割的問題，而桿狀病毒則存在表達成本高，蛋白純化困難等缺點。發(fā)明內容
本發(fā)明的主要目的在于提供一種降低蛋白的損耗和生產成本的豬II型圓環(huán)病毒 0RF2蛋白的制備方法。本發(fā)明采用如下技術方案包括以下步驟1.序列合成通過序列比對，在保證編碼的氨基酸相同的前提下改變核苷酸序列，把序列中的稀有密碼子替換成大腸桿菌偏愛密碼子，并在序列兩端分別加上EcoR I和Not I限制性酶切位點，合成cap基因，連接到PES載體上，按照設定的限制性內切酶進行酶切，將目的片段克隆至pMD18-T質粒載體上，轉化感受態(tài)DH5a細胞，挑取陽性菌落，OMEGA試劑盒小量提取質粒，酶切鑒定陽性質粒；2.原核表達載體的構建與鑒定將質粒pES-Cap經EcoR I和Not I雙酶切，回收702bp的目的片段，與同樣經EcoR I 和Not I雙酶切的線性表達載體pET-28a+連接，連接體系目的片段5uL，pET_28a+載體 3uL，T4 DNA Ligase luL，10*buffer luL，4°C連接過夜；取 ΙΟμ 連接產物與 ΙΟΟμ BL21 感受態(tài)細胞混合，冰浴30min，42°C熱激90s后迅速置冰浴中靜置2min，加入800μ 無抗生素的LB培養(yǎng)基，370C 150 rpm搖床培養(yǎng)45min后，5000rpm離心5min,棄上清，留200uL將菌體吹勻后涂布含kana，100 μ g/mL的LB平板，37°C溫箱倒置培養(yǎng)12_16h ;次日挑取白色單菌落，用含kana的LB培養(yǎng)基小量擴增培養(yǎng)；0MEGA試劑盒小量提取質粒；分別經PCR鑒定和EcoR ,Not I雙酶切鑒定，將鑒定陽性的重組質粒命名為pET-28-Cap并進行序列測定分析；3.重組菌的誘導表達將鑒定為陽性的BL21菌液按1:100的比例轉接到含kana的LB液體培養(yǎng)基中，37°C 振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期時，0D_值為O. 6，加入不同終濃度的乳糖分別誘導2h、3h、4h、5h、 6h，同時設未誘導菌液對照和pET-28a/BL21誘導對照；取ImL菌液，13000rpm離心Imin 后，棄上清，加入 50uL PBS 和 50uL 2*SDS_PAGE Loading Buffer 重懸，沸水煮 5 min，進行12%SDS-PAGE，結果顯示，pET-28-cap在30kDa處有一條很濃的蛋白條帶，與預期目的條帶大小相符；而未經誘導的重組菌則無此條帶，空載體質粒pET-28a+轉化菌經誘導后在約 7kDa處出現(xiàn)組氨酸標簽蛋白條帶，說明蛋白已經得到了表達；4.重組菌的可溶性表達及蛋白純化通過對誘導溫度，誘導時間，誘導劑濃度等誘導條件的摸索，重組菌在37°C，10g/L乳糖濃度等誘導條件下誘導表達6h ，蛋白的可溶性表達量最大；凍融菌體并進行超聲破碎 30min，設置為間隔I秒，超聲3秒，離心后收集上清和沉淀；上清和沉淀中的蛋白樣品進行 12%SDS-PAGE電泳；對可溶性的重組蛋白進行His-蛋白質鎳親和層析。本發(fā)明豬II型圓環(huán)病毒0RF2蛋白的制備方法的有益效果是利用大腸桿菌表達系統(tǒng)， 不斷摸索誘導條件，實現(xiàn)了蛋白的可溶性表達，避免了蛋白變性、復性等的繁瑣過程，降低了生產成本,適宜于規(guī)模化發(fā)酵生產。


圖1為pET-28-cap重組菌在大腸桿菌中的蛋白表達；圖 2 western blot 鑒定圖。在圖1中，1、2、4、5為誘導的pET-28-cap重組菌；M為低分子量蛋白marker ;3為未誘導的pET-28-cap重組菌；6為空載體pET_28a(+)對照；在圖2中，M為低分子量預染蛋白marker ;1為目的蛋白；2為未誘導菌體對照。
具體實施方式
請參閱圖1和圖2所示，本發(fā)明的一種豬II型圓環(huán)病毒0RF2蛋白的制備方法，包括以下步驟1.序列合成通過序列比對，在保證編碼的氨基酸相同的前提下改變核苷酸序列，把序列中的稀有密碼子替換成大腸桿菌偏愛密碼子，并在序列兩端分別加上EcoR I和Not I限制性酶切位點，合成cap基因，連接到PES載體上，按照設定的限制性內切酶進行酶切，將目的片段克隆至pMD18-T質粒載體上，轉化感受態(tài)DH5a細胞，挑取陽性菌落，OMEGA試劑盒小量提取質粒，酶切鑒定陽性質粒。2.原核表達載體的構建與鑒定 將質粒pES-Cap經EcoR I和Not I雙酶切，回收702bp的目的片段，與同樣經EcoR I 和Not I雙酶切的線性表達載體pET-28a(+)連接，連接體系目的片段5uL，pET_28a(+) 載體 3uL，T4 DNA Ligase luL，10*buffer luL，4°C連接過夜。取 ΙΟμ 連接產物與 ΙΟΟμ BL21 (DE3)感受態(tài)細胞混合，冰浴30min，42°C熱激90s后迅速置冰浴中靜置2min，加入 800μ 無抗生素的LB培養(yǎng)基，37°C 150 rpm搖床培養(yǎng)45min后，5000rpm離心5min，棄上清，留200uL將菌體吹勻后涂布含kana (100 μ g/mL)的LB平板，37°C溫箱倒置培養(yǎng)12_16h。 次日挑取白色單菌落，用含kana的LB培養(yǎng)基小量擴增培養(yǎng)。OMEGA試劑盒小量提取質粒。 分別經PCR鑒定和EcoR ,Not I雙酶切鑒定，將鑒定陽性的重組質粒命名為pET-28-Cap并進行序列測定分析。3.重組菌的誘導表達將鑒定為陽性的BL21菌液按1:100的比例轉接到含kana的LB液體培養(yǎng)基中，37°C 振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期(0D_值約O. 6)時，加入不同終濃度的乳糖分別誘導2h、3h、4h、5h、 6h,同時設未誘導菌液對照和pET-28a/BL21誘導對照。取ImL菌液，13000rpm離心Imin 后，棄上清，加入50uL PBS和50uL 2*SDS_PAGE Loading Buffer重懸，沸水煮5 min，進行 12%SDS-PAGE，結果顯示，pET-28-cap在約30kDa處有一條很濃的蛋白條帶，與預期目的條帶大小相符。而未經誘導的重組菌則無此條帶，空載體質粒pET-28a(+)轉化菌經誘導后在約7kDa處出現(xiàn)組氨酸標簽蛋白條帶。說明蛋白已經得到了表達。4.重組菌的可溶性表達及蛋白純化通過對誘導溫度，誘導時間，誘導劑濃度等誘導條件的摸索，重組菌在37°C，10g/L乳糖濃度等誘導條件下誘導表達6h，蛋白的可溶性表達量最大。凍融菌體并進行超聲破碎 30min，設置為間隔I秒，超聲3秒，離心后收集上清和沉淀。上清和沉淀中的蛋白樣品進行 12%SDS-PAGE電泳。對可溶性的重組蛋白進行His-蛋白質鎳親和層析。按照His · Bind Purification Kit 說明書進行。5.重組蛋白的免疫原性鑒定將表達蛋白進行12%SDS-PAGE電泳分離后，利用半干轉印儀進行電轉印，具體操作過程按分子克隆實驗指南方法進行。將轉印的PVDF膜用5%的脫脂奶4°C封閉過夜，然后以1:100稀釋的標準陽性血清為一抗，1:5000稀釋的HRP標記的兔抗豬IgG為二抗進行 ffestern-blot分析。二抗孵育結束后進行洗滌，將洗滌充分的轉印膜轉移至新鮮配制的 DAB底物溶液中作用5-10min，待有條帶清晰顯現(xiàn)時，立即用水沖洗終止反應，拍照保存。結果表明表達蛋白在DAB底物溶液顯色后，分別出現(xiàn)了與預期大小一致的約30kDa的融合蛋白，表明表達蛋白具有良好的反應原性。6.重組蛋白的應用(I)特異性強、敏感性高的免疫學血清學技術是規(guī)?；i場進行豬圓環(huán)病毒2型感染和流行狀況調查所必備的手段。該重組蛋白與PCV2抗血清具有良好的反應性，可代替全病毒抗原作為ELISA檢測的包被抗原，通過對抗原最適包被濃度和兔抗豬IgG最佳稀釋濃度的選擇，待檢血清稀釋度的選擇，陰陽性臨界值的確定，建立檢測PCV2抗體的間接ELISA方法，優(yōu)化反應條件后確定的抗原最適包被濃度為2. 8ug/mL,抗原最佳包被條件為4°C過夜, 血清最適稀釋度為1:40，酶標抗體最適稀釋度為1:5000，最佳封閉液為1%明膠。阻斷試驗表明，建立的間接ELSA對PCV2抗體具有很好的特異性。經對臨床疑似PCV2感染的100 份血清樣品進行檢測，陽性檢出率為72%。實驗表明，建立的檢測PCV2抗體的間接ELISA方法具有特異性強、重復性和穩(wěn)定性好等特點，可用于PCV2抗體的血清學診斷和流行病學調查。(2)重組菌經乳糖誘導表達純化后，進行濃縮，按一定比例與佐劑混合，進行乳化，可用于制備亞單位疫苗來進行PCV2感染的防治(其疫苗具體制備方法，效果評價不在此累述)。安全性試驗方法取21 25日齡健康仔豬4頭，超劑量肌肉注射疫苗3ml/頭，觀察28日。結果安全檢驗表明所有免疫豬健活，精神狀態(tài)、行為活動和飲食正常；呼吸和體溫均在正常范圍內，全身及接種部位無其它不良反應。效力試驗方法取25 28日齡健康仔豬15頭。經檢測圓環(huán)病毒抗體為陰性。隨機分為3組， 每組5頭。第I組為免疫組，頸部肌肉注射自制亞單位疫苗，2ml/頭，14日后加強免疫I次。第 2組為不免疫攻毒組。第3組為不免疫不攻毒的空白對照組。3組豬隔離飼養(yǎng)。二免后第 21日，對所有豬采血，分離血清，測定血清中的PCV2抗體效價，并用SD株強毒(本實驗室分離)病毒液(含IO5 5TCID5tZml)對第1、2組豬攻毒，逐日測定體溫并觀察25日。攻毒到期后對所有豬進行剖檢，觀察各組織器官病理變化。結果通過ELISA方法對免疫前和免疫后21日的豬血清進行圓環(huán)病毒抗體的檢測(結果見表1)，結果表明二免后21日免疫組豬圓環(huán)病毒抗體滴度明顯高于免疫前抗體滴度，不免疫攻毒組攻毒后仔豬出現(xiàn)體溫持續(xù)升高，大于40°C的癥狀，明顯食欲減退，精神沉郁，被毛粗亂，消瘦和生長速度減慢，剖檢可見肺臟輕度水腫，腎臟有點狀出血壞死，PCR方法檢測其淋巴結組織，可檢測到PCV2存在。而免疫對照組攻毒后10天僅有一頭豬表現(xiàn)精神沉郁，食欲減退，其余四頭與空白對照組豬精神狀態(tài)、行為活動和飲食正常；呼吸和體溫也在正常范圍內，無全身及局部不良反應。表I各組試驗豬PCV2抗體檢測及攻毒情況
權利要求
1.一種豬II型圓環(huán)病毒0RF2蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 1.序列合成 通過序列比對，在保證編碼的氨基酸相同的前提下改變核苷酸序列，把序列中的稀有密碼子替換成大腸桿菌偏愛密碼子，并在序列兩端分別加上EcoR I和Not I限制性酶切位點，合成cap基因，連接到PES載體上，按照設定的限制性內切酶進行酶切，將目的片段克隆至pMD18-T質粒載體上，轉化感受態(tài)DH5a細胞，挑取陽性菌落，OMEGA試劑盒小量提取質粒，酶切鑒定陽性質粒；
2.原核表達載體的構建與鑒定 將質粒pES-Cap經EcoR I和Not I雙酶切，回收702bp的目的片段，與同樣經EcoR I和Not I雙酶切的線性表達載體pET-28a(+)連接，連接體系目的片段5uL，pET-28a(+)載體 3uL，T4 DNA Ligase luL，10*buffer luL，4°C連接過夜；取 ΙΟμ 連接產物與 ΙΟΟμ BL21感受態(tài)細胞混合，冰浴30min，42°C熱激90s后迅速置冰浴中靜置2min，加入800μ 無抗生素的LB培養(yǎng)基，370C 150 rpm搖床培養(yǎng)45min后，5000rpm離心5min,棄上清，留200uL將菌體吹勻后涂布含kana，100 μ g/mL的LB平板，37°C溫箱倒置培養(yǎng)12_16h ;次日挑取白色單菌落，用含kana的LB培養(yǎng)基小量擴增培養(yǎng)；0MEGA試劑盒小量提取質粒；分別經PCR鑒定和EcoR ,Not I雙酶切鑒定，將鑒定陽性的重組質粒命名為pET-28-Cap并進行序列測定分析；
3.重組菌的誘導表達 將鑒定為陽性的BL21菌液按1:100的比例轉接到含kana的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期時，0D_值為O. 6，加入不同終濃度的乳糖分別誘導2h、3h、4h、5h、6h，同時設未誘導菌液對照和pET-28a/BL21誘導對照；取ImL菌液，13000rpm離心Imin后，棄上清，加入50uL PBS和50uL 2*SDS_PAGE Loading Buffer重懸，沸水煮5 min，進行12%SDS-PAGE，結果顯示，pET-28-cap在30kDa處有一條很濃的蛋白條帶，與預期目的條帶大小相符；而未經誘導的重組菌則無此條帶，空載體質粒pET-28a(+)轉化菌經誘導后在約7kDa處出現(xiàn)組氨酸標簽蛋白條帶，說明蛋白已經得到了表達；
4.重組菌的可溶性表達及蛋白純化 通過對誘導溫度，誘導時間，誘導劑濃度等誘導條件的摸索，重組菌在37°C，10g/L乳糖濃度等誘導條件下誘導表達6h，蛋白的可溶性表達量最大；凍融菌體并進行超聲破碎30min，設置為間隔I秒，超聲3秒，離心后收集上清和沉淀；上清和沉淀中的蛋白樣品進行12%SDS-PAGE電泳；對可溶性的重組蛋白進行His-蛋白質鎳親和層析。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種豬II型圓環(huán)病毒ORF2蛋白的制備方法，將編碼PCV2核衣殼蛋白的Cap基因連接到pET-28a(+)質粒上構建成表達質粒pET-28-Cap，轉化BL21(DE3)感受態(tài)細胞，得到基因工程菌種pET-28-Cap/BL21。通過誘導表達及檢測表明該重組蛋白具有良好的反應原性。可進一步用來作為診斷抗原或制備亞單位疫苗。產物在大腸桿菌中以可溶性形式表達，表達量大且避免了蛋白變性再復性的繁瑣過程，降低了蛋白的損耗和生產成本。
文檔編號C07K14/01GK102994518SQ20121050931
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月4日 優(yōu)先權日2012年12月4日
發(fā)明者李朝陽, 李明義, 石喬 申請人:山東信得科技股份有限公司