專利名稱：一種降低煙草尼古丁含量的基因及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及煙草尼古丁的合成及調(diào)控相關(guān)基因，特別涉及調(diào)控?zé)煵菽峁哦『铣傻幕蛟诮档蜔煵菽峁哦『糠矫娴膽?yīng)用。
背景技術(shù)：
吸煙嚴(yán)重危害人的身體健康，因而如何減少吸煙的危害已成為各國(guó)政府、醫(yī)學(xué)專家、植物學(xué)家傾カ關(guān)注、研究的課題之一。許多世界頂級(jí)煙草公司投入巨資對(duì)煙草次生代謝物的代謝途徑、調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究。尼古丁是ー種吡啶類生物堿，主要存在于茄科煙草屬(Nicotiana)植物中，是煙草體內(nèi)的ー種重要的次生代謝產(chǎn)物。目前對(duì)尼古丁生物合成的研究主要集中在克隆其代謝相關(guān)的酶并分析其生理和生化特性方面。尼古丁是在植物的根部形成并經(jīng)過(guò)木質(zhì)部轉(zhuǎn)運(yùn)到葉片沉積下來(lái)。尼古丁合成的前體是基本的氨基酸精氨酸和鳥氨酸以及天門冬氨酸。它們經(jīng)一系列的代謝合成途徑中的關(guān)鍵酶PMT，QPT和MPO等催化 最終生成尼古」一 I Chintapakorn and Hamili, 2003. Antisense-mediated down-r e gu I at i onof putrescine N-methyItransferase activity in transgenic Nicotiana tabacumLean lead to elevated levels of anatabine at the expense of nicotine. PlantMolecular Biology 53:87-105.)。尼古丁生物合成受多種因素的調(diào)控，發(fā)育調(diào)控的激素信號(hào)就是很重要的ー類。茉莉素(JAs)是茉莉酸及其衍生物的統(tǒng)稱，是植物體內(nèi)起全局調(diào)控作用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，廣泛分布于植物的幼嫩組織、花和發(fā)育的生殖器官中。并且在植物受到生物脅迫和非生物脅迫吋，JAs還能改變細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)和介導(dǎo)植物的防御反應(yīng)。研究證明尼古丁代謝途徑上的關(guān)鍵酶，如MPT，QPT和MPO均受植物傷誘導(dǎo)激素-茉莉素的誘導(dǎo)而表達(dá)，從而形成尼古丁。自1962年發(fā)現(xiàn)茉莉酸至今，人們對(duì)茉莉酸的合成途徑已經(jīng)非常了解，但對(duì)茉莉素的信號(hào)傳導(dǎo)途徑及其調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育和應(yīng)激反應(yīng)的分子機(jī)制并不清楚。2007年三個(gè)課題組相繼報(bào)道在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了ー類新的轉(zhuǎn)錄抑制調(diào)節(jié)子，被命名為榮莉素ZIM結(jié)構(gòu)域蛋白家族(簡(jiǎn)稱JAZ蛋白)。它通過(guò)抑制榮莉素響應(yīng)基因的表達(dá)而發(fā)揮其生 功倉(cāng)泛(Chini et al. , 2007. The JAZ family of repressors is the missing linkin jasmonate signalling. Nature 448:U664-U664;Thines et al. , 2007. JAZ repressorproteins are targets of the SCFCOllcomplex during jasmonate signalling. Nature448:U661-U662. ;Yan et al. ,2007. A Downstream Mediator in the Growth RepressionLimb ofthe Jasmonate Pathway. Plant Cell 19，2470-2483.)。當(dāng)沒(méi)有茉莉素時(shí)，JAZ 蛋白的C-端結(jié)合在MYC2轉(zhuǎn)錄因子的N-端，抑制茉莉素誘導(dǎo)基因的表達(dá)；當(dāng)植物體內(nèi)有茉莉素存在時(shí)，JAZ蛋白同SCFam復(fù)合物相互作用，從而導(dǎo)致JAZ蛋白的聚泛素化而被26S蛋白酶體降解，釋放出MYC2轉(zhuǎn)錄因子激活茉莉素誘導(dǎo)基因的表達(dá)。研究尼古丁的代謝調(diào)控是非常有意義的ー項(xiàng)工作。尼古丁對(duì)人體有很強(qiáng)的生理刺激作用，是煙草商業(yè)性使用的物質(zhì)基礎(chǔ)。對(duì)煙草而言，尼古丁是ー種抵御昆蟲侵害的防御性物質(zhì)。在沒(méi)有受到傷害的煙草植株中，尼古丁含量大約為0.1%-1.0%。受到植食性昆蟲侵害或機(jī)械損傷后，煙草植株內(nèi)茉莉素含量可以增加到原來(lái)的9倍(Ziegler etal.，200丄 Herbivore—induced allene oxide synthase transcripts and jasmonic acidin Nicotiana attenuata. Phytochemistry 58:729-738.),而尼古丁含量可以達(dá)到 4-10倍(Baldwin, 1998. Jasmonate-1nduced responses are costly but benefit plants underattack in native populations. Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of America 95, 8113-8118.)，這個(gè)濃度會(huì)使大多數(shù)食葉性昆蟲立即死亡，從而保護(hù)受害蟲侵害的組織，達(dá)到抗蟲的目的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明茉莉素可以調(diào)控尼古丁的生成，但是其分子機(jī)制并不清楚。目前，對(duì)于JAZ蛋白的研究，在擬南芥中一共發(fā)現(xiàn)12個(gè)成員，這不難使我們思考，煙草中有沒(méi)有這樣的JAZ蛋白，以及這些蛋白是 否參與了茉莉素誘導(dǎo)的煙草尼古丁的合成。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于尋找與煙草尼古丁含量相關(guān)的功能基因，進(jìn)而提供ー種降低煙草尼古丁含量的方法，為低尼古丁含量煙草育種提供技術(shù)手段。本發(fā)明的研究發(fā)現(xiàn)，煙草中的某些NtJAZs是受茉莉素的誘導(dǎo)而表達(dá)。通過(guò)RNAi技術(shù)在煙草中干擾其各自的表達(dá)，獲得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)這些轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中尼古丁的含量相對(duì)野生型要低很多。由此推測(cè)，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，干擾、沉默或敲除某些NtJAZs，可為獲得低尼古丁含量煙草育種提供重要的科學(xué)依據(jù)。鑒于該類基因的應(yīng)用價(jià)值及其利用潛力的應(yīng)用前景，有必要通過(guò)專利加以保護(hù)。本發(fā)明提供的用于降低煙草尼古丁含量的基因?qū)儆贘AZ家族蛋白基因，來(lái)源于煙草(Nicotiana tabacum),命名為NtJAZ3,編碼下述蛋白質(zhì)(i)或(ii)⑴序列表中的SEQ ID No 1所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(ii)序列表中的SEQ ID No :1所示氨基酸序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而衍生的蛋白質(zhì)，并且所衍生的蛋白質(zhì)具有與(i)所述蛋白質(zhì)相同的功能。序列表中的SEQ ID No 1序列由207個(gè)氨基酸殘基組成，其中第93位至第98位氨基酸殘基是TIFY結(jié)構(gòu)域，第158位至第176位氨基酸殘基是jas結(jié)構(gòu)域。所述取代、缺失或添加的一至十個(gè)氨基酸殘基可以是非上述結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基，其改變不會(huì)對(duì)該蛋白的功能產(chǎn)生影響。對(duì)氨基酸殘基進(jìn)行取代、缺失或添加，以及對(duì)相關(guān)功能的檢測(cè)可以通過(guò)本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的煙早JAZ蛋白基因NtJAZ3可以是其cDNA序列，也可以是基因組DNA序列，或者是與這些序列具有90 %以上同源性且編碼相同功能蛋白的DNA序列。例如序列表中SEQ ID NO 2所示的DNA序列。通過(guò)對(duì)煙草轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行de novo拼接，利用所獲得的煙草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)以及NCBI公布的煙草基因組序列片段和EST片段進(jìn)行擬南芥同源JAZ的Blast分析，本發(fā)明的相關(guān)研究獲得了一系列煙草JAZ蛋白(NtJAZs)成員。其中，設(shè)計(jì)引物克隆了 NtJAZ3的ORF全長(zhǎng)序列(SEQ ID NO :2)，其編碼的蛋白序列如序列表中的SEQ ID No:l所示。序列分析結(jié)果表明，該蛋白含有保守的TIFY結(jié)構(gòu)域和jas結(jié)構(gòu)域。其次，利用通過(guò)RT-PCR及Real-time PCR發(fā)現(xiàn)該基因是受茉莉素誘導(dǎo)而表達(dá)的(圖1)。
基于上述研究，本發(fā)明通過(guò)RNAi技術(shù)構(gòu)建了 NtJAZ3基因的RNAi轉(zhuǎn)基因載體，成功獲得了抑制NtJAZ3在煙草細(xì)胞中表達(dá)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，所獲得的轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞系擁有尼古丁含量相對(duì)對(duì)照明顯降低的特異表型?？梢?jiàn)，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，干擾、沉默或敲除NtJAZ3基因能夠獲得尼古丁含量降低的轉(zhuǎn)基因煙草，這使得低尼古丁含量煙草育種成為可能，為降低煙草尼古丁含量提供了一種有效的技術(shù)手段。在本發(fā)明的ー個(gè)具體實(shí)例中，首先，為構(gòu)建NtJAZ3的RNAi雙元表達(dá)載體，選擇此基因中較特異的一段核酸片段(序列表SEQ ID NO 2的第l-499bp序列)為RNAi的引導(dǎo)序列，設(shè)計(jì)引物獲得此序列。然后，將此核酸片段以正反兩個(gè)方向插入到植物表達(dá)載體pHZPR1-Hyg中構(gòu)建成為NtJAZ3的RNAi雙元表達(dá)載體。如圖2所示，該載體中的兩個(gè)NtJAZ3特異片段由一段⑶S序列隔開(kāi)，由CaMV 35S啟動(dòng)子引導(dǎo)表達(dá)。之后，將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404，并經(jīng)由農(nóng)桿菌將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)入煙草BY-2懸浮細(xì)胞中。進(jìn)而，通過(guò)Real-time PCR方法對(duì)RNAi的效率進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，所獲得的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中NtJAZ3的表達(dá)被有效 抑制(圖3)。針對(duì)NtJAZ3_RNAi轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞系，利用氣質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜分析技術(shù)測(cè)定了茉莉素處理72小時(shí)后細(xì)胞中尼古丁的含量。相比對(duì)照野生型煙草細(xì)胞，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的尼古丁含量有明顯的降低(圖4)。因此，本發(fā)明為獲得低尼古丁含量煙草育種提供重要的科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐。


圖1、Real-time PCR檢測(cè)茉莉素誘導(dǎo)下NtJAZ3的表達(dá)變化，其中左圖顯示了NtJAZ3基因受茉莉素(JA)誘導(dǎo)，井隨著JA作用的延長(zhǎng)表達(dá)量逐漸增加的表達(dá)情況；右圖是正對(duì)照，尼古丁合成途徑中的關(guān)鍵酶PMT在JA誘導(dǎo)處理下的表達(dá)情況；以Actin為內(nèi)參。圖2、NtJAZ3-RNAi植物表達(dá)載體構(gòu)建示意圖，該載體中，NtJAZ3的RNAi引導(dǎo)序列以正反兩個(gè)方向插入植物表達(dá)載體⑶S序列的兩側(cè)；圖中，RB、LB示序列的左右邊界；2X35S示啟動(dòng)子，Hyg示潮霉素抗性基因。圖3、煙草轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的分子鑒定所示為轉(zhuǎn)化NtJAZ3_RNAi表達(dá)載體的煙草懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平的Real-time PCR鑒定結(jié)果，其中WT為煙草野生型BY-2細(xì)胞。圖4、煙草轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系尼古丁含量檢測(cè)利用RNAi技術(shù)反義抑制NtJAZ3在煙草BY-2細(xì)胞中的表達(dá)，收集未經(jīng)MeJA處理和MeJA處理72小時(shí)樣品，利用氣質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜分析技術(shù)(GC-MS)進(jìn)行尼古丁含量檢測(cè)，反義抑制NtJAZ3后尼古丁含量大幅度降低，WT為煙草野生型BY-2細(xì)胞對(duì)照。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)驗(yàn)方法所用的試劑，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑公司購(gòu)買得到。植物材料煙草懸浮細(xì)胞系BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2)1、實(shí)驗(yàn)材料的獲得和RNA的提取■不同時(shí)間MeJA處理BY_2細(xì)胞的取材方法煙草懸浮細(xì)胞BY-2 在 MS (4. 3g/l MS, 100mg/l 肌醇，30g/l 蔗糖，200mg/l 磷酸ニ氫鉀，lmg/1 VB1，0. 2mg/l 2，4_D，pH=5. 8)的液體培養(yǎng)基中24。C，120rpm搖床中懸浮培
養(yǎng)，7天ー個(gè)周期。Real-time PCR實(shí)驗(yàn)所用材料在進(jìn)行茉莉素(Me JA)處理時(shí)，將生長(zhǎng)4天的懸浮細(xì)胞傳至無(wú)2，4-D的MS培養(yǎng)基中，24小時(shí)后，加入50 u M茉莉素(終濃度)進(jìn)行處理，分別在0、0. 5、2、6、12、24小時(shí)收集樣品，裝入預(yù)冷的離心管中。液氮速凍后，轉(zhuǎn)移到_80°C低溫冰箱中保存，以用于Real-time PCR分析。尼古丁含量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)所用材料同上Real-time PCR實(shí)驗(yàn)所用材料處理，在MeJA處理72小時(shí)收集樣品，_80°C低溫冰箱中保存，以用于尼古丁含量檢測(cè)。■玻璃制品、塑料制品和電泳槽的去RNA酶處理RNA相關(guān)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所用的玻璃制品在使用前于180°C烘烤8h。塑料制品，包括 各種類型的槍頭和離心管，用0. 1%DEPC水溶液浸泡過(guò)夜，高壓滅菌后置于80°C干燥箱中干燥。用于RNA電泳的電泳槽經(jīng)清洗后,用無(wú)水こ醇中浸泡30min,然后在30%H202中浸泡30min，最后用滅菌的DEPC處理水沖洗5次。 ■不同時(shí)間MeJA處理BY-2細(xì)胞總RNA的提取Trizol法提取細(xì)胞總RNA，首先取分裝于1. 5ml離心管的植物材料(約0.1g),液氮研磨，每管加入1ml Trizol液，迅速混勻，室溫下靜置5_10分鐘以利于核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體的解離，離心12000g, IOmin,取新離心管加入Iml的氯仿,加入上一步的上清液,小心不要吸到下層沉淀，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15s，室溫靜置5min，12000g離心10分鐘，取上清液(水相)轉(zhuǎn)入一新的離心管，加入等體積異丙醇，_20°C放置2h，4°C，12000g離心IOmin,棄去上清液,加入Iml 75%こ醇,緩慢顛倒離心管,離心棄上清,重復(fù)一次。室溫干燥。加適量DEPC處理水溶解RNA?！?RNA質(zhì)量檢測(cè)在GBC Cintra IOe紫外分光光度計(jì)上測(cè)RNA樣品在260nm和280nm的光吸收值，通過(guò)吸收值計(jì)算RNA樣品的濃度和判斷RNA樣品的純度。RNA光吸收值和濃度換算公式10D26(l=40ii g/mL。純度判斷方法純的RNA，其OD26tlAD28tl為2. 0，若污染了蛋白質(zhì)或酚，OD26tl/OD280比值明顯低于此值。然后通過(guò)I %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性?！?RNA樣品中少量DNA的去除通過(guò)無(wú)RNase的DNase消化RNA樣品中殘留的DNA，反應(yīng)體系包括Ix RQlRNase-free DNase Buffer^RNase inhibitor 20 unit、RQl RNase-free DNase luL、RNA樣品50 u g，用DEPC-H2O補(bǔ)足體系至50 uし上述體系于37°C溫育30min。DNA酶解反應(yīng)結(jié)束后，用酚/氯仿抽堤，こ醇沉淀回收RNA樣品。2、NtJAZ3 全長(zhǎng) cDNA 的克隆提取茉莉素處理2小時(shí)的BY-2細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以此cDNA為模板PCR擴(kuò)增Nt JAZ3全長(zhǎng)序列。具體流程如下利用Fermentas 公司的 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)，獲得cDNA,配制反應(yīng)體系I如下2 ii g總RNA、1 ii L Oligo dT及加DEPC處理水補(bǔ)齊至12 ii L,于65°C溫育5min后迅速置于冰上。然后加入反應(yīng)體系I1:4 y L 5Xreactionbuffer、I u L RNase inhibitor、2 u L IOmM dNTP Mix 和 I u L M-MuLV reversetranscriptase?；靹蚍磻?yīng)體系I和II，42°C逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)60min, 70°C處理5min,置于冰上2min，分裝并保存于-20°C。PCR擴(kuò)增NtJAZ3編碼基因根據(jù)Blast分析序列，設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物，使用高保真DNA聚合酶pfu擴(kuò)增NtJAZ3編碼基因。反應(yīng)體系如下2XPCR pfu Mix 25 y L、上游引物I y M、下游引物luM、cDNA 1.0iiL，_dd H2O補(bǔ)充反應(yīng)體系至50. OiiしPCR反應(yīng)條件95 °C預(yù)變性 5min ;95°C變性 45sec, 55°C退火 45sec, 72°C延伸 2min, 30 個(gè)循環(huán)；最后 72°C延伸 7min。其中引物序列如下上游引物5’-CACCATGGCATCATCGGAGATTGTGGA-3’ (SEQ ID No 3)；下游引物5’-CTAGAATTGCTCAGCTTTCACTGG-3’(SEQ ID No :4)。PCR產(chǎn)物連入ENTY載體克隆利用博邁德生物的多功能DNA純化回收試劑盒，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，并使用pENTR/D-TOPO cloning kit試劑盒將克隆的基因與pENTR/D-TOPO 載體相連,使用連接體系如下PCR product 0. 5-4 u I, Salt solution In I, T0P0vetor I V-1, Sterile water補(bǔ)至6 ii I體系。輕輕混合均勻，25°C連接過(guò)夜,此后進(jìn)行DH5 a轉(zhuǎn)化，得到質(zhì)粒pENTY-NtJAZ3。質(zhì)粒PENTY_NtJAZ3的小量提取使用北京索萊寶公司質(zhì)粒小提試劑盒，接菌至l-5mlLB/Kan培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，次日離心13000rpm Imin收集菌體。加入250 y L溶液I(請(qǐng)先檢查是否已加入RNaseA)，振蕩混勻后，加入250 U I溶液II，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6_8次使菌體充分裂解，加入350 u I溶液III，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12000rpm離心lOmin，用移液器小心地將上清轉(zhuǎn)移到吸附柱中(吸附柱加入收集管中)，室溫放置2分鐘，12000rpm離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中，加入500 u l漂洗液(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水こ醇)，12000rpm離心I分鐘，棄廢液，將吸附柱放入收集管中，重復(fù)一次，然后12000rpm空離2min。室溫干燥，向吸附膜中央懸空滴加50 ul經(jīng)65°C水浴預(yù)熱的H2O,室溫放置5min，12000rpm離心2min，得到質(zhì)粒。質(zhì)粒pENTY-Nt JAZ3的PCR鑒定通過(guò)PCR對(duì)Nt JAZ3的全長(zhǎng)進(jìn)行電泳鑒定，將得到有全長(zhǎng)插入片段的陽(yáng)性克隆，送公司進(jìn)行測(cè)序，最終鑒定得到NtJAZ3基因ORF的全長(zhǎng)序列。3、茉莉素誘導(dǎo)NtJAZ3基因的表達(dá)■ NtJAZ3保守區(qū)序列分析NtJAZ3保守區(qū)序列分析對(duì)克隆得到的NtJAZ3蛋白進(jìn)行序列比對(duì)和結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)其N端含有保守的tify結(jié)構(gòu)域(第93位至第98位氨基酸殘基)和C末端含有Jas結(jié)構(gòu)域(第158位至第176位氨基酸殘基)，與擬南芥JAZs蛋白的保守結(jié)構(gòu)域相同。■ Real time-PCR 引物設(shè)計(jì)同一家族基因序列類似性比較高，因此根據(jù)NtJAZ3與其它NtJAZs的序列比對(duì)情況，挑取特異序列片段進(jìn)行Real time-PCR引物設(shè)計(jì)，具體引物序列如下上游引物5’-GGTTCCTTTGGAGATCTCAGC-3，(SEQ ID No 5)；下游引物5’-GACCGCCGTAGAATATCGTC-3’(SEQ ID No :6)。同吋，以尼古丁合成途徑中的關(guān)鍵酶PMT在JA誘導(dǎo)處理下的表達(dá)情況為正對(duì)照，對(duì)其進(jìn)行Real time-PCR的引物如下上游引物5’-TATGCACACAGGCTGAAAGC-3’ (SEQ ID No 7)；下游引物5，-AGTCAACTTCTGGCCCTTCA-3’(SEQID No :8)。
以Actin為內(nèi)參，對(duì)其進(jìn)行Real time-PCR的引物如下上游引物5’-AGCACCTCTTAACCCGAAGG-3’ (SEQ ID No 9)；下游引物5’-GGACAGTGTGGCTAACACCA-3’(SEQ ID No :10)?！?BY-2細(xì)胞不同時(shí)間下NtJAZ3的表達(dá)檢測(cè)取材煙草BY-2懸浮細(xì)胞時(shí)間50μΜMeJA 處理 0、0· 5、2、6、12、24 小時(shí)Real-time PCR :使用 Trizol Plant 試劑盒(Invitrogen)提取總 RNA,去 DNA 后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，將cDNA稀釋5倍并保存于-20°C待用。在8聯(lián)定量PCR管中加入IOyL2 X ABI powerSYBR green PCR master mix,上、下游引物(10 μ Μ)和 cDNA 各 I μ L,加 ddH2O補(bǔ)足反應(yīng)體系至20 μ L，混勻并短暫離心。將上述反應(yīng)體系置于ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中，按標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行PCR反應(yīng)。循環(huán)條件為50°C 2min，94°C預(yù)變性IOmin ;95°C變性15sec,60°C退火及延伸Imin,40個(gè)循環(huán)；最后添加一個(gè)溶解曲線測(cè)定循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后應(yīng)用軟件ABI 7500 Software v2. O分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。以尼古丁合成途徑中的關(guān)鍵酶PMT為正對(duì)照，以ACTIN (GenBank:ACH69153.1)的表達(dá)為內(nèi)參。結(jié)果如圖1所示，用50 μ M MeJA處理煙草ΒΥ-2細(xì)胞，分別在Oh、O. 5h、2h、6h、12h和24h收集細(xì)胞材料，提取RNA，通過(guò)Real_timePCR發(fā)現(xiàn)NtJAZ3基因受茉莉素誘導(dǎo)而表達(dá)，并隨著JA作用時(shí)間的延長(zhǎng)，基因的表達(dá)量逐漸增加，在12h達(dá)到最大值，正對(duì)照PMT的表達(dá)量在受茉莉素處理后被顯著誘導(dǎo)。4、NtJAZ3基因沉默的轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞系的獲得■基因沉默trigger序列的克隆及測(cè)序根據(jù)序列比對(duì)，在NtJAZ3的ORF框中選取特異性較高的片段(引物設(shè)計(jì)如下)，以茉莉素處理2小時(shí)的樣品材料為模板，進(jìn)行PCR克隆，得到用作RNAi的DNA片段，連接ENTY載體并測(cè)序。將測(cè)序正確的基因沉默trigger序列利用Gateway LR Clonase II EnzymeMix試劑盒進(jìn)行LR重組反應(yīng)連接至雙元載體pHZPR1-Hyg中形成RNAi載體NtJAZ3_RNAi。引物序列如下上游引物5’-CACCATGGCATCATCGGAGATTGTGGA-3’ (SEQ ID No 11)；下游引物5’-TTCTTTTCTCTAAAAACCTAGT-3’(SEQ ID No :12)。應(yīng)用農(nóng)桿菌侵染法將構(gòu)建好的NtJAZ3基因沉默轉(zhuǎn)基因載體(NtJAZ3_RNAi)轉(zhuǎn)入煙草BY-2懸浮細(xì)胞中。5、轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞系的鑒定及尼古丁含量測(cè)定■煙草轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的分子鑒定將農(nóng)桿菌侵染后的BY-2懸浮細(xì)胞在潮霉素抗性培養(yǎng)基上篩選培養(yǎng)，待2-4周后，挑取抗性愈傷組織進(jìn)行再篩選，之后進(jìn)行懸浮培養(yǎng)及繼代培養(yǎng)并通過(guò)RT-PCR及Real-timePCR的方法對(duì)轉(zhuǎn)基因愈傷進(jìn)行篩選鑒定，獲得的陽(yáng)性愈傷組織。具體操作為將篩選后的陽(yáng)性愈傷組織進(jìn)行懸浮細(xì)胞，并進(jìn)行茉莉素處理，收集Ohour和12hour樣品提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)NtJAZ3的表達(dá)(圖3)，篩選得到轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性細(xì)胞系?！鰺煵蒉D(zhuǎn)基因細(xì)胞系尼古丁含量檢測(cè) 將篩選后的陽(yáng)性愈傷組織進(jìn)行懸浮細(xì)胞，并進(jìn)行茉莉素處理，收集72h樣品進(jìn)行尼古丁含量的檢測(cè)(圖4)，具體操作如下-80°C冰箱取出收集保存的72h處理材料，放入液氮備用，液氮預(yù)冷鉆頭，用電鉆將細(xì)胞研碎。取1. 5ml離心管，稱量約O. Γ0. 15g研碎的細(xì)胞放入，加入1. 5mol/L的氫氧化鈉1. 25mL，再加入0. 0002 u g/ml的喹啉內(nèi)標(biāo)溶液20 u L,超聲波處理Imin(總超聲時(shí)間lmin，超聲2s，間隔8s，強(qiáng)度36%)。37°C孵育4h，取出加入5ml的ニ氯甲烷和甲醇的混合溶劑(體積比3:1)，震搖5min。靜置，待分層。取下層有機(jī)相
2.5ml于新離心管中，加入冰こ酸20 yl，混勻。用氮?dú)鈱⒂袡C(jī)相吹干，加入0. 2ml ニ氯甲烷溶解待測(cè)物，漩渦混勻，2000rpm，5min離心，吸出溶液放入色譜管中待上機(jī)檢測(cè)。
利用氣質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜分析技術(shù)(GC-MS)檢測(cè)樣品中尼古丁含量，結(jié)果表明，反義抑制NtJAZ3后尼古丁含量有很大幅度的降低(如圖4所示)，WT為煙草野生型BY-2細(xì)胞。
權(quán)利要求
1.一種煙草JAZ蛋白，是下述蛋白質(zhì)⑴或(ii)(i)序列表中的SEQ ID No I所不氣基酸序列的蛋白質(zhì)；( )序列表中的SEQ ID No :1所示氨基酸序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而衍生的蛋白質(zhì)，并且所衍生的蛋白質(zhì)具有與(i)所述蛋白質(zhì)相同的功能。
2.—種煙草JAZ蛋白基因，命名為NtJAZ3，編碼下述蛋白質(zhì)⑴或(ii)(i)序列表中的SEQID No I所不氣基酸序列的蛋白質(zhì)；(ii)序列表中的SEQID No :1所示氨基酸序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而衍生的蛋白質(zhì)，并且所衍生的蛋白質(zhì)具有與(i)所述蛋白質(zhì)相同的功能。
3.如權(quán)利要求2所述的煙草JAZ蛋白基因，其特征在于，所述煙草JAZ蛋白基因是所述蛋白質(zhì)基因的cDNA序列或基因組DNA序列。
4.如權(quán)利要求3所述的煙草JAZ蛋白基因，其特征在于，所述煙草JAZ蛋白基因的序列如序列表中SEQ ID No :2所示。
5.權(quán)利要求2所述的煙草JAZ蛋白基因在降低煙草尼古丁含量中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)干擾、沉默或敲除所述煙草JAZ蛋白基因，獲得尼古丁含量降低的煙草轉(zhuǎn)化植株。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，構(gòu)建所述煙草JAZ蛋白基因的RNAi載體并轉(zhuǎn)化煙草，獲得尼古丁含量降低的轉(zhuǎn)基因煙草。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述煙草JAZ蛋白基因的RNAi載體通過(guò)下述方法構(gòu)建以所述煙草JAZ蛋白基因的特異性核酸片段作為引導(dǎo)序列，將該特異性核酸片段以正反兩個(gè)方向插入到植物表達(dá)載體中。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述煙草JAZ蛋白基因的特異性核酸片段是序列表中SEQ IDNo 2的第1-499位核苷酸序列。
10.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述煙草JAZ蛋白基因的RNAi載體中，兩個(gè)插入方向相反的所述煙草JAZ蛋白基因特異性核酸片段由一段GUS基因序列隔開(kāi)，并由CaMV 35S啟動(dòng)子引導(dǎo)表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種降低煙草尼古丁含量的基因及其應(yīng)用。所述基因是一種煙草JAZ蛋白基因，命名為NtJAZ3，該基因編碼的蛋白具有典型的TIFY結(jié)構(gòu)域和jas結(jié)構(gòu)域，且受茉莉素的誘導(dǎo)表達(dá)。通過(guò)構(gòu)建NtJAZ3基因的RNAi轉(zhuǎn)基因載體并轉(zhuǎn)化煙草，成功抑制了NtJAZ3在煙草細(xì)胞中的表達(dá)，所獲得的轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞系的尼古丁含量較野生型明顯降低。本發(fā)明為獲得低尼古丁含量煙草育種提供了重要的科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐。
文檔編號(hào)C07K14/415GK103012572SQ20121051755
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月5日
發(fā)明者韓生成, 王英典, 趙和平, 楊玉萍 申請(qǐng)人:北京師范大學(xué)