專(zhuān)利名稱(chēng)：一種長(zhǎng)效人干擾素及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人工修飾的干擾素及其制備方法，屬于蛋白質(zhì)化學(xué)和生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
干擾素(interfeixm，IFN)是一種機(jī)體感染病毒時(shí)，白細(xì)胞通過(guò)抗病毒免疫應(yīng)答而產(chǎn)生的一種低分子量的糖蛋白，具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等生物活性。干擾素最早分為I型與II型。I型中又有兩種成分，雖然它們的受體成分相同，但兩者的免疫原性完全不同，可分為α與β兩類(lèi)，前者曾稱(chēng)白細(xì)胞干擾素，后者曾叫成纖維細(xì)胞干擾素。隨后發(fā)現(xiàn)的ε，Κ，ω，δ，T-1FN均屬于I型干擾素，還有I個(gè)I型干擾素相似因子系列，即I λ -干擾素(IFN-λ)，也有人將其作為III型干擾素。其中只有α-干擾素(IFN-α)是多基因 產(chǎn)物，包括a 1，a 2, a 3......等亞型；同一亞型又可因個(gè)別氨基酸的差異而細(xì)分，如a 2有
3 種，即 a 2a(Lys23, His34)、a 2b (Arg23, His34)和 a 2c(Arg23, Arg34)。II 型則定義為Y類(lèi)干擾素。ω -干擾素是奧地利科學(xué)家Rudelf Hamptan等人于1985年發(fā)現(xiàn)的I型干擾素，利用標(biāo)準(zhǔn)抗病毒試驗(yàn)，已經(jīng)測(cè)定出人ω-干擾素的比活性為2. 7-4X108U/mg。通過(guò)仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)，已經(jīng)成功地利用人外周血白細(xì)胞產(chǎn)生并純化出了人ω-干擾素。另外在不同的外源表達(dá)系統(tǒng)，如大腸桿菌、昆蟲(chóng)細(xì)胞和CHO細(xì)胞中表達(dá)了重組的人ω-干擾素。GuntherR-Adolf等在1987年發(fā)現(xiàn)ω-干擾素與α -干擾素功能相近，但是抗原性不同。1990年，單克隆抗體及酶聯(lián)免疫特異測(cè)試人ω-干擾素證明，ω-干擾素是人白細(xì)胞干擾素的組成成分。Tiefenthaler等在1997年發(fā)現(xiàn)，ω-干擾素與a _2a_干擾素在體外抑制腫瘤細(xì)胞活性，尤其是抑制慢性骨髓細(xì)胞性白血病(CML)的骨髓細(xì)胞增殖有非常相似的作用。對(duì)a-2a_干擾素有耐藥性的患者，ω-干擾素可能是更有效的藥物。1999年，Holly通過(guò)將人腫瘤組織移入小鼠體內(nèi)，證實(shí)ω-干擾素能有效地抑制人的腫瘤組織，在體內(nèi)有抗癌作用。利用人的肝癌細(xì)胞系，Hagelstein等人比較了各種干擾素對(duì)病毒復(fù)制的抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人ω-干擾素具有與α-干擾素、Y-干擾素以及腫瘤壞死因子相似的抗病毒復(fù)制與抗細(xì)胞增殖等作用。研究人員同時(shí)還發(fā)現(xiàn)人ω-干擾素比α-干擾素有更強(qiáng)地抑制病毒蛋白合成的作用。Che等也證實(shí)在注入小鼠體內(nèi)后，帶有編碼人ω-干擾素的DNA同樣具有抗腫瘤作用。Bergithe等人用放射免疫分析法研究了 ω -干擾素，其抗體在自身免疫性多內(nèi)分泌腺綜合癥I型的診斷中更靈敏、更具特定性。由于ω-干擾素具有較強(qiáng)的抗病毒復(fù)制，抗細(xì)胞增殖和免疫調(diào)節(jié)等作用，該細(xì)胞因子在多種腫瘤、病毒性疾病的治療及對(duì)α-干擾素具有耐藥的患者具有廣闊的應(yīng)用前景，其臨床應(yīng)用已經(jīng)逐漸展開(kāi)。干擾素是治療慢性乙型肝炎或慢性丙型肝炎的首選藥物，可以有效地抑制或清除病毒，療效持久，并可阻止肝硬化或肝癌的發(fā)生。自1986年以來(lái)，干擾素成為第一個(gè)被美國(guó)FDA批準(zhǔn)，且被應(yīng)用于臨床的細(xì)胞因子。目前已有57個(gè)國(guó)家批準(zhǔn)生產(chǎn)和使用重組干擾素制齊U。由于肝炎病毒的動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，病毒RNA復(fù)制很快，干擾素治療時(shí)需要維持恒定的血藥濃度以發(fā)揮最大的病毒抑制作用。普通干擾素一般為每隔一天給藥一次，給藥后血藥濃度迅速達(dá)到高峰，并導(dǎo)致一些不良反應(yīng)。用藥后24小時(shí)和給藥的間歇日，血藥濃度降至很低，病毒重新開(kāi)始復(fù)制，這就是普通干擾素的“峰-谷”效應(yīng)。這主要是由于干擾素分子量小、在體內(nèi)易被蛋白酶降解，導(dǎo)致其在體內(nèi)的循環(huán)半衰期短。另外，干擾素在臨床應(yīng)用中還同時(shí)存在血小板減少、心律失常、流感樣癥狀、蕁麻疹、斑丘疹等過(guò)敏反應(yīng)和一系列的毒副作用。這些問(wèn)題是由外源性蛋白在人體內(nèi)產(chǎn)生免疫反應(yīng)而引起的，嚴(yán)重制約了其臨床應(yīng)用。因此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者競(jìng)相開(kāi)展了長(zhǎng)效干擾素的研究。目前延長(zhǎng)干擾素半衰期的方法主要基于以下3個(gè)方面①增大干擾素的分子量，減少腎小球過(guò)濾減少異源蛋白的免疫原性，從而減少其體內(nèi)清除率；③持續(xù)緩慢釋放，維持藥物濃度，延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間等。常用的技術(shù)包括緩釋制劑、聚乙二醇修飾、血清白蛋白融合、構(gòu)建突變體等。聚乙二醇(PEG)修飾是目前制備長(zhǎng)效蛋白 質(zhì)和多肽藥物最為成功的策略之一。PEG修飾對(duì)蛋白質(zhì)藥物有空間屏蔽作用，能有效地減少蛋白水解酶的降解作用，降低其抗原性和免疫原性，延長(zhǎng)循環(huán)半衰期，同時(shí)提高穩(wěn)定性和溶解性。PEG修飾在干擾素的長(zhǎng)效劑型開(kāi)發(fā)中得到了成功的應(yīng)用，如PEG化的干擾素a -2a(Pegasys，Roche公司)和PEG化的干擾素 a -2b (PEG-1ntron, Schering 公司)等。白蛋白修飾技術(shù)是另一種能夠有效延長(zhǎng)蛋白質(zhì)和多肽藥物半衰期的方法。它是將蛋白質(zhì)和多肽藥物通過(guò)基因工程或化學(xué)偶聯(lián)的方法與分子量較大，半衰期較長(zhǎng)的血清白蛋白進(jìn)行融合表達(dá)或者化學(xué)偶聯(lián)。這種內(nèi)源性蛋白不會(huì)產(chǎn)生毒性和免疫反應(yīng)；同時(shí)具有良好的穩(wěn)定性，不會(huì)因人體內(nèi)環(huán)境的變化或免疫反應(yīng)而變性或降解，從而提高大多數(shù)外源性藥物的穩(wěn)定性。最近發(fā)展出一種利用長(zhǎng)鏈脂肪酸與蛋白進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)的技術(shù)。這種技術(shù)利用長(zhǎng)鏈脂肪酸能非共價(jià)結(jié)合血清白蛋白的特點(diǎn)，當(dāng)目的蛋白與長(zhǎng)鏈脂肪酸偶聯(lián)并進(jìn)入體內(nèi)后，長(zhǎng)鏈脂肪酸可以結(jié)合體內(nèi)的血清白蛋白，從而達(dá)到提高目的蛋白半衰期的目的。目前國(guó)內(nèi)外大多利用PEG修飾技術(shù)或者是蛋白融合技術(shù)來(lái)提高干擾素體內(nèi)的循環(huán)半衰期。其中，PEG修飾后的消除半衰期αι/2β )從O. 86小時(shí)提高到了 2. 8小時(shí)，生物活性只有原蛋白的15%。通過(guò)和抗體Fe片段融合表達(dá)的方法，ω-干擾素的循環(huán)半衰期提高到了 53. 3小時(shí)，且保留了原蛋白22%的生物活性，但存在著動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)成本高，且表達(dá)量低的缺點(diǎn)。因此現(xiàn)有技術(shù)還缺乏一種在體內(nèi)具有較長(zhǎng)半衰期，且具有較高生物活性的長(zhǎng)效干擾素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題就是在延長(zhǎng)干擾素的體內(nèi)半衰期的同時(shí)，還要盡可能降低其對(duì)生物活性的影響，保持較高的生物活性。基于上述目的，本發(fā)明首選提供了一種經(jīng)人工修飾的干擾素，其特征在于，所述干擾素如式(I)所示
權(quán)利要求
1.一種經(jīng)人工修飾的干擾素，其特征在于，所述干擾素如式(I)所示
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干擾素，其特征在于，Y代表的PEG分子量為20000道爾頓。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干擾素，其特征在于，X為長(zhǎng)鏈脂肪酸衍生物十六胺。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干擾素，其特征在于，所述短肽如序列SEQIDNO I所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的干擾素，其特征在于，所述干擾素為干擾素。
6.一種制備權(quán)利要求1所述干擾素的方法，由以下步驟組成 (1)將干擾素巰基化； (2)將聚乙二醇修飾劑Mal-PEG-NHS與X偶聯(lián)； (3)使步驟(I)和(2)獲得的反應(yīng)混合物進(jìn)行混合發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)； (4)收集步驟(3)的偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(2)中的X為十六胺。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述干擾素為干擾素。
9.一種制備權(quán)利要求3所述干擾素的方法， (1)將干擾素溶解在pH7. 0-7. 4的20mM磷酸緩沖液中，配制成0. 2-10mg/ml的溶液； (2)按干擾素2_亞氨基硫烷為1: 1-50的摩爾比加入2-亞氨基硫烷，于4-37°C下反應(yīng)2-24小時(shí)； (3)將聚乙二醇修飾劑Mal-PEG-NHS和十六胺溶解在pH值為7.0-7. 4的20mM的磷酸緩沖液中，配制成為0. 2-50mg/ml的溶液，按修飾劑十六胺為I 1-50的摩爾比，于4_37°C下反應(yīng)2-6小時(shí)； (4)將步驟2和3中的反應(yīng)混合物進(jìn)行混合，于4-37°C下反應(yīng)2-24小時(shí)； (5)收集步驟(4)所得到的反應(yīng)混合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述干擾素為干擾素。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人工修飾的干擾素及其制備方法，所述干擾素經(jīng)PEG修飾并與長(zhǎng)鏈脂肪酸或其衍生物或短肽偶聯(lián)。本發(fā)明提供的干擾素既具有較長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期，還保持了較高的體內(nèi)生物活性。
文檔編號(hào)C07K1/107GK103012579SQ20121052558
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月10日
發(fā)明者陳薇, 胡濤, 于長(zhǎng)明, 房婷, 王俊, 付玲, 張金龍 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所, 中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所