專利名稱：桑黃菌中苯乙酮的分離技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程制藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
桑黃，子實體無柄，菌蓋扁半球形或馬蹄形，2-12*3-21厘米，厚1. 5-10厘米，木質(zhì)，淺肝褐色至暗灰色或黑色，老時常龜裂，無皮殼，初期有細微絨毛，后變無毛，有同心環(huán)棱.邊緣鈍，深肉桂色至淺咖啡色，下側(cè)無子實層.菌肉深咖啡色，硬，木質(zhì).菌管與菌肉近同色，多層，但層次不明顯，年老的菌管層充滿白色菌絲.管口銹褐色至醬色，圓形，每毫米4-5個.孢子近球形，光滑，無色，5-6*3-4微米.剛毛頂端尖銳，基部膨大，10-25*5-7微米.菌絲不分枝，無橫隔，直徑3-5微米。目前，真菌產(chǎn)物的純化方法較多，主要有分級沉淀法、制備性高效液相層析、柱層析法、超濾法、離心沉淀色譜法、等幾種方法。而其中應(yīng)用最多的當屬柱層析法，分為兩類一是只有分子篩作用的凝膠柱層析，常用的凝膠有葡聚糖凝膠及瓊脂糖凝膠。二是離子交換層析。但，主要用于分離多糖，透明質(zhì)酸等，多數(shù)分離后得到的產(chǎn)物為混合物。本發(fā)明使用多種層析技術(shù)相結(jié)合，分離度高，應(yīng)用此發(fā)明可以精致到純品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了一種桑黃菌中苯乙酮的分離方法。首先制備桑黃粗提物，然后進行正相硅膠層析，采用石油醚與丙酮梯度洗脫，進行TLC檢測，再次使用正相硅膠層析，然后是甲醇凝膠層析，經(jīng)PLC檢測后，進行反相硅膠層析，適當合并洗脫液，減壓干燥，既得5’-甲基-3’， 4’-二羥基苯乙酮。本發(fā)明的技術(shù)方案如下
桑黃粗提物，由下述方法制得
(1)發(fā)酵培養(yǎng)基配方以克/100毫升計是
玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5%
蛋白胨 O. 1-0. 5%酵母膏 O. 1-0. 5%
硫酸鎂 O. 1-0. 5%磷酸二氫鉀O. 01-0. 05%
(2)將桑黃菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶內(nèi)，以20 35°C溫度，搖瓶轉(zhuǎn)速為80 280r/min，pH 3 8條件下，震動培養(yǎng)7 15天；培養(yǎng)中當pH值降到2. 5 4時，將搖瓶中的種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，以溫度20 35°C，發(fā)酵罐壓力O.1 O. 2公斤/平方厘米，pH 3 8，通氣量O. 5 1.1vvm,攪拌速度100 280轉(zhuǎn)/分的條件，培養(yǎng)7 15天，即可利用桑黃菌絲體發(fā)酵全液制備桑黃粗提物；
(3)取步驟(2)中所得桑黃菌絲體發(fā)酵全液，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/2 1/5 ；
(4)用體積百分比為60 95%的乙醇對上述步驟(3)濃縮后的發(fā)酵液進行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的2 5倍，能夠使提取液中乙醇濃度達到60 90% ；(5)對步驟(4)所得提取液在50 70°C條件下，加熱I 2小時；以常規(guī)方法進行分離，并通過二級過濾除去雜質(zhì)，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5 1/10 ；
(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進行干燥，得桑黃粗提物。分離5’ -甲基-3’，4’ - 二羥基苯乙酮的方法
桑黃菌粗提物一正相硅膠層析一氯仿與甲醇梯度洗脫一TLC檢測一正相硅膠層析一甲醇凝膠層析一TLC檢測一反相硅膠層析一TLC檢測一減壓蒸干一5’-甲基-3’，4’_ 二羥基苯乙酮。具體方法為
(1)首先制備桑黃菌粗提物；
(2)將上述步驟(I)所得的粗提物與正相硅膠混勻攪拌，并干燥，進行硅膠正相柱層析，用洗脫劑洗脫2-5次；
(3)收集步驟(2)中的最后一次洗脫液，減壓干燥，與等體積硅膠拌樣，再次進行正相硅膠層析，用洗脫劑洗脫；
(4)收集上述步驟(3)得到的洗脫液，減壓濃縮，使用甲醇溶解，甲醇凝膠柱層析，用洗脫劑洗脫，使用TLC檢測收集的洗脫液，適當合并洗脫液，減壓干燥；
(5)將步驟(4)得到的產(chǎn)物進行反相硅膠層析，洗脫劑為甲醇水=10%-80%；
(6)TLC檢測，適度合并洗脫液，加壓干燥，即為苯乙酮。

本發(fā)明由桑黃菌中苯乙酮的分離技術(shù)的顯著優(yōu)勢本方法采用多種層析技術(shù)相結(jié)合，可以精致到結(jié)構(gòu)明確，純度大于95%的苯乙酮。技術(shù)路線成熟明確，高效精確。

圖1為5’ -甲基-3’，4’ - 二羥基苯乙酮的結(jié)構(gòu)式；
圖2為5’ -甲基-3’，4’ - 二羥基苯乙酮的一維核磁共振H譜。
具體實施方式
實例1:
桑黃粗提物，由下述方法制得
(1)發(fā)酵培養(yǎng)基配方以克/100毫升計是
玉米淀粉 1%葡萄糖 1%
蛋白胨 O. 1%酵母膏 O. 1%
硫酸鎂 O. 1%磷酸二氫鉀0.01%
(2)將桑黃菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶內(nèi)，以25°C溫度，搖瓶轉(zhuǎn)速為110r/min，pH 7條件下，震動培養(yǎng)7天；培養(yǎng)中當pH值降到3時，將搖瓶中的種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，以溫度25°C，發(fā)酵罐壓力O.1公斤/平方厘米，pH 3，通氣量
O.5-1. lvvm，攪拌速度100轉(zhuǎn)/分的條件，培養(yǎng)7天，即可利用桑黃菌絲體發(fā)酵全液制備桑黃粗提物；
(3)取步驟(2)中所得桑黃菌絲體發(fā)酵全液，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/3 ；
(4)用體積百分比為70%的乙醇對上述步驟(3)濃縮后的發(fā)酵液進行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的5倍，能夠使提取液中乙醇濃度達到55% ；(5)對步驟(4)所得提取液在70°C條件下，加熱I小時；以常規(guī)方法進行分離，并通過二級過濾除去雜質(zhì)，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5 ；
(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進行干燥，得桑黃粗提物。將上述粗提物稱取300g與等體積100目正相硅膠混勻攪拌，進行硅膠正相柱層析。層析固定相為200-300目正相硅膠，柱高lm，直徑20cm，洗脫劑為分別為氯仿，氯仿甲醇=100:1，氯仿甲醇=50:1，分別洗脫3，4，4個柱體積。并將所得洗脫液分別命名為Fr-1, Fr-2, Fr_3。將Fr_3等體積硅膠拌樣，使用硅膠為100目正相硅膠，五倍體積硅膠層析，使用的硅膠為200—300目正相硅膠。洗脫劑為石油醚與丙酮。減壓濃縮洗脫液，使用甲醇溶解，甲醇凝膠柱層析。使用TLC檢測收集的洗脫液適當合并，減壓蒸干，10%甲醇溶解，進行反相硅膠層析，洗脫劑為甲醇與水，對洗脫液進行TLC檢測，適當合并，加壓干燥，進行ID-HNMR核磁共振分析，頻率為400MHZ，分析結(jié)果為δ 7. 34 (s, 1H)，7. 28 (s, 1H)，
2.47 (d, J= 15. 2 Hz, 3H)，2. 23 (s, 3H) ·證明其是 5’-甲基-3’，4’- 二羥基苯乙酮。

實例2
桑黃粗提物，由下述方法制得
(1)發(fā)酵培養(yǎng)基配方以克/100毫升計是
玉米淀粉 3%葡萄糖 2%
蛋白胨 0.5%酵母膏 0.5%
硫酸鎂 0.5%磷酸二氫鉀0.05%
(2)將桑黃菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶內(nèi)，以30°C溫度，搖瓶轉(zhuǎn)速為180r/min，pH6條件下，震動培養(yǎng)15天；培養(yǎng)中當pH值降到2. 5時，將搖瓶中的種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，以溫度30°C，發(fā)酵罐壓力0.2公斤/平方厘米，pH 3，通氣量O. 5-1. lvvm,攪拌速度180轉(zhuǎn)/分的條件，培養(yǎng)15天，即可利用桑黃菌絲體發(fā)酵全液制備桑黃粗提物；
(3)取步驟(2)中所得桑黃菌絲體發(fā)酵全液，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5 ；
(4)用體積百分比為90%的乙醇對上述步驟(3)濃縮后的發(fā)酵液進行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的4倍，能夠使提取液中乙醇濃度達到70% ；
(5)對步驟(4)所得提取液在55°C條件下，加熱2.5小時；以常規(guī)方法進行分離，并通過二級過濾除去雜質(zhì)，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的I /10 ;
(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進行干燥，得桑黃粗提物。將上述粗提物稱取200g與等體積100目正相硅膠混勻攪拌，進行硅膠正相柱層析。層析固定相為200-300目正相娃膠,柱高Im,直徑15cm,洗脫劑為分別為氯仿,氯仿甲醇=100:1，氯仿甲醇=50:1，分別洗脫2，3，3個柱體積。并將所得洗脫液分別命名為Fr-1, Fr-2, Fr_3。將Fr_3等體積硅膠拌樣，使用硅膠為100目正相硅膠，五倍體積硅膠層析，使用的硅膠為200— 300目正相硅膠。洗脫劑為石油醚與丙酮。進行甲醇凝膠柱層析。進行反相硅膠層析，TLC檢測收集的洗脫液適當合并，減壓干燥，進行ID-HNMR核磁共振分析，頻率為 400MHZ，分析結(jié)果為 δ 7. 34 (s, 1H), 7. 28 (s, 1H)，2. 47 (d, J= 15. 2 Hz,3H), 2. 23 (s，3H).證明其是5’-甲基-3’ ，4’-二羥基苯乙酮。
權(quán)利要求
1.桑黃菌中苯乙酮的分離方法，其步驟順序如下 (1)制備桑黃粗提物； (2)將上述步驟(I)所得的乙醇沉淀物與正相硅膠混勻攪拌，并干燥，進行硅膠正相柱層析，用洗脫劑洗脫2-5次； (3)收集步驟(2)中的最后一次洗脫液，減壓干燥，與等體積硅膠拌樣，再次進行正相硅膠層析，用洗脫劑洗脫； (4)收集上述步驟(3)得到的洗脫液，減壓濃縮，使用甲醇溶解，甲醇凝膠柱層析，用洗脫劑洗脫，使用TLC檢測收集的洗脫液，適當合并洗脫液，減壓干燥； (5)將步驟(4)得到的產(chǎn)物進行反相硅膠層析，洗脫劑為甲醇冰=10%-80%； (6)TLC檢測，適度合并洗脫液，加壓干燥，即為苯乙酮。
2.如權(quán)利要求1所述的一種從桑黃菌中分離苯乙醇的方法，其特征在于所述桑黃粗提物，由下述方法制得 (1)發(fā)酵培養(yǎng)基配方以克/100毫升計是 玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5% 蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5% 硫酸鎂 O. 1-0. 5%磷酸二氫鉀O. 01-0. 05% (2)如權(quán)利要求1所述桑黃粗提物的發(fā)酵培養(yǎng)方法是，將桑黃菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶內(nèi)，以20 35 °C溫度，搖瓶轉(zhuǎn)速為80 280r/min，pH 3 8條件下，震動培養(yǎng)7 15天；培養(yǎng)中當pH值降到2. 5 4時，將搖瓶中的種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，以溫度20 35°C，發(fā)酵罐壓力O.1 O. 2公斤/平方厘米，pH 3 8，通氣量O. 5 1.1vvm,攪拌速度100 280轉(zhuǎn)/分的條件，培養(yǎng)7 15天，即可利用桑黃菌絲體發(fā)酵全液制備桑黃粗提物； (3)取步驟(2)中所得桑黃菌絲體發(fā)酵全液，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/2 1/5 ； (4)用體積百分比為60 95%的乙醇對上述步驟(3)濃縮后的發(fā)酵液進行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的2 5倍，能夠使提取液中乙醇濃度達到60 90% ； (5)對步驟(4)所得提取液在50 70°C條件下，加熱I 2小時；以常規(guī)方法進行分離，并通過二級過濾除去雜質(zhì)，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5 1/10 ； (6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進行干燥，得桑黃粗提物。
3.如權(quán)利要求1所述的桑黃菌中苯乙酮的分離方法，其特征在于所述的的化合物5’-甲基-3’，4’-二羥基苯乙酮。
4.如權(quán)利要求1所述的桑黃菌中苯乙酮的分離方法，其特征在于，步驟(2)中所述的拌樣硅膠為100-200目正相硅膠。
5.如權(quán)利要求1所述的桑黃菌中苯乙酮的分離方法，其特征在于，步驟(2)中所述的層析硅膠為正相200-300目，洗脫劑為氯仿和/或甲醇。
6.如權(quán)利要求1所述的桑黃菌中苯乙酮的分離方法，其特征在于，步驟(3)中所述的硅膠用量為等體積，洗脫劑為石油醚與丙酮。
7.如權(quán)利要求1所述的桑黃菌中苯乙酮的分離方法，其特征在于，步驟(4)中所述的凝膠為Sephadex LH-20,洗脫劑為甲醇。
8.如權(quán)利要求1所述的桑黃菌中苯乙酮的分離方法，其特征在于，步驟(5)所述的反相材料為C-18，C-8。
9.如權(quán)利要求1所述的桑黃菌中苯乙酮的分離方法，其特征在于，步驟(5)所述的洗脫劑為甲醇水=10%-80%。
10.如權(quán)利要求1所述的桑黃菌中苯乙酮的分離方法，其特征在于，步驟(6)所述的TLC檢測，展開劑為氯仿甲醇=12:1-15:1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種桑黃菌(火木層孔菌Phellinusigniarius(LexFr)Quel、裂蹄木層孔菌phellinuslinteus(BerketCurt)Teng、鮑氏層孔菌、哈蒂針層孔菌Phellinushartigii(AlleschetSchnabl)Imaz)中苯乙酮的分離方法。首先制備桑黃菌粗提物，然后進行正相硅膠層析，采用石油醚與丙酮梯度洗脫，進行TLC檢測，再次使用正相硅膠層析，然后是甲醇凝膠層析，經(jīng)PLC檢測后，進行反相硅膠層析，適當合并洗脫液，減壓干燥，既得苯乙酮。
文檔編號C07C45/79GK103044229SQ201210546070
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月15日
發(fā)明者趙晨, 宋愛榮, 孫效樂, 黃芳, 王進平 申請人:青島農(nóng)業(yè)大學