專利名稱：一種原發(fā)性膽汁性肝硬化的特異性自身抗體及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及免疫學領域，具體地說，涉及一種原發(fā)性膽汁性肝硬化的特異性自身抗體、其相應抗原和它們的應用。
背景技術：
原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis, PBC)是一種慢性、進行性膽汁淤積性肝臟疾病，一般認為與自身免疫有關。病變特點是以肝內小膽管的非化膿性炎癥為特征。PBC在中老年女性中多見，男女比例為1:8。目前該病尚無治愈的方法，但早期及時治療能改善生化指標及肝臟組織學病變，從而延緩病情進展，一旦進入晚期，則肝移植為唯一可行的治療手段，因此早診斷早治療至關重要。但因該病早期臨床表現(xiàn)不典型及臨床重視程度不夠、診斷水平等原因，近年來，該病在城市人口中有增高的趨勢。PBC的具體病因與發(fā)病機制仍不清楚，該病常合并其他器官自身免疫性疾病。在該病中幾乎所有患者均存在特異性自身抗體和自身反應性T細胞反應，因此被稱為是一種器官特異性的自身免疫性疾病?？咕€粒體抗體(antimitochondrialautoantibodies, AMA)是該病的主要診斷指標，但仍有部分患者該抗體陰性，極易誤診。因此，尋找PBC患者除ΑΜΑ、抗核抗體(antinuclearantibodies, ANA)以外一種新的自身抗體及其祀抗原，分析其在PBC患者中的臨床意義，探討其與PBC發(fā)病機制的關系，以期有助于PBC患者的早期診斷、早期治療以及預后的判斷。近年來國外研究發(fā)現(xiàn)在PBC中存在一種新的自身抗原成分，它可以共價的連接SplOO和PML蛋白，被稱為微小泛素相關的修飾因子(small ubiquitin-relatedmodifiers, SUMO)。SUM0-1和SUM0-2及SUM0-3蛋白是存在于其他核點蛋白中的特殊蛋白質。它們能夠通過相似的泛素結合途徑，共價的連接到其他細胞蛋白上，但并不形成泛素化。SUMO結合的蛋白并不會導致其降解，而是穩(wěn)定的結合靶蛋白及調節(jié)細胞的結構和功能。有研究顯示，在99例抗SplO O和PML抗體陽性的PBC患者中可檢測到抗SuM0_2和SUM0-1抗體，其在PBC中的陽性率為42%和15%。但在抗核點抗體陰性的PBC患者中并沒有發(fā)現(xiàn)抗SUMO抗體，因此認為抗SUMO抗體也是PBC的一種新型自身抗體類型。最近AlessandroGranito等首次報道Spl40是一種新的、高度特異的PBC自身抗原。對135例PBC患者和157例疾病對照組(自身免疫性肝炎、原發(fā)性硬化性膽管炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡)血清抗Spl40抗體進行檢測陽性率為15% (20/135)，而在疾病對照組中未檢測到，由此可見，抗Spl40抗體是PBC高度特異的自身抗體。在AMA陰性的PBC患者中抗Spl40抗體的陽性率(53%)顯著高于AMA陽性的PBC患者(9%)。AMA是PBC診斷的重要血清學標志，超過90%的PBC患者出現(xiàn)AMA，仍有10%PBC患者AMA為陰性；而抗gp210、抗LBR、抗P62、抗Sp 140抗體僅出現(xiàn)在少部分PBC患者，因此，尋找新的特異性的自身抗體對PBC患者的早期診斷有重要意義，有助于對AMA陰性的PBC患者的診斷，以及AMA陽性的PBC患者的診斷，同時特異性抗原的鑒定是研究PBC發(fā)病機制的條件之一，有助于與其它自身免疫病的鑒別診斷。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種原發(fā)性膽汁性肝硬化的特異性自身抗體、其相應抗原和它們的應用。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種原發(fā)性膽汁性肝硬化的特異性自身抗體和相應抗原，所述特異性自身抗體是以膽管癌細胞RBE總蛋白作為抗原，利用免疫印跡法檢測原發(fā)性膽汁性肝硬化PBC患者血清，檢測到針對分子量約20kD蛋白(即，相應抗原)的自身抗體，將其命名為Sp20抗體，然后利用雙向電泳從PBC患者血清中分離得到該Sp20抗體。利用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜法對Sp20進行鑒定。間接免疫熒光法檢測抗Sp20抗體熒光模型，對結果進行分析。對比抗Sp20抗體陽性與陰性PBC患者在臨床表現(xiàn)、生化免疫指標、自身抗體、肝臟病理分期、對UDCA的治療反應及預后進行比較等方面指標，分析抗Sp20抗體的臨床意義。本發(fā)明還提供上述的Sp20抗體在制備診斷原發(fā)性膽汁性肝硬化試劑盒中的應用。本發(fā)明提供了一種新的PBC·特異性自身抗體，通過研究其在PBC發(fā)病中的機制，為PBC患者早期診斷、早期治療及預后的判斷提供理論依據(jù)。有助于對AMA陰性的PBC患者的診斷，以及有助于與其它自身免疫病的鑒別診斷。為臨床研發(fā)新的PBC診斷試劑提供科學依據(jù)。


圖1為本發(fā)明較佳實施例采用免疫印跡法檢測患者血清，1-8為PBC患者血清，9為SS患者血清，均出現(xiàn)針對分子量20kD蛋白的自身抗體，N為陰性對照血清。圖2為Sp20抗體陽性和陰性PBC患者I年至7年的平均生存概率的比較。圖3為Sp20抗體陽性和陰性PBC患者5年的生存率。圖4為以RBE細胞裂解液的細胞核、細胞漿、全細胞為抗原，以含有抗TOC-E2、抗Sp20的PBC患者血清為抗體利用免疫印跡法的檢測結果，I以全細胞為抗原；2以細胞漿為抗原；3以細胞核為抗原。其中74kD條帶對應H)C-E2，20kD條帶對應Sp20。圖5為Sp20在細胞核、細胞漿、全細胞中相對灰度值的比較。圖6為采用免疫印跡法檢測Sp20在來自人不同器官組織的細胞系、大鼠肝細胞及大腸桿菌中的分布，1-8分別為人肝癌細胞株H印G2. 2. 15、人宮頸癌細胞株HeLa、人乳腺癌細胞株Mcf-7、人黑色素瘤細胞株Mel-edl、人低分化胃腺癌細胞株BCG-823、人小細胞肺癌細胞株NC1-H446、人膽管癌細胞株RBE及大鼠肝細胞株BRL，在以上細胞中均出現(xiàn)sp20 ；9為大腸桿菌E. col1. JM109。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。除非特殊說明，以下實施例中使用的試劑和材料均為市售商品。實施例1 Sp20自身抗體在PBC患者中的檢測一、病例選擇1. 35例PBC患者為來自北大人民醫(yī)院肝病科1995年至2004年的住院病人，其中女性34例，男性I例，年齡34-77歲，平均(54± 10)歲。對照組選擇慢性乙型肝炎患者8例，慢性丙型肝炎患者5例，干燥綜合征20例，自身免疫性肝炎8例，9例健康獻血者。干燥綜合征患者血清為北大人民醫(yī)院免疫科實驗室提供，健康獻血者血清為北大人民醫(yī)院血庫提供，原發(fā)性膽汁性肝硬化、慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎和自身免疫性肝炎患者血清由肝病科提供，研究所用的血清均_20°C保存。2.診斷標準PBC參考2000年AASLD (美國肝病學會)的診斷指南I)血清堿性磷酸酶水平等膽汁淤積的指標升高；2)通過腹部B超或CT排除其他膽道梗阻因素；3)血清AMA或AMA-M2亞型陽性；4)AMA陰性患者則進行肝臟組織學檢查，符合PBC的病理改變。干燥綜合征采用2002年歐洲-美國干燥綜合征的診斷標準，自身免疫性肝炎診斷參照國際自身免疫性肝炎聯(lián)盟的診斷指標。慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎診斷符合2000年全國傳染病及肝病年會所制定標準。3.肝臟病理學檢查共對32例PBC患者進行肝臟病理檢查，肝組織常規(guī)石蠟包埋，HE及Masson染色，由同一位病理醫(yī)師閱片。組織學分期參照以下標準I期為僅限于匯管三角的膽管炎癥；II期為顯著的匯管區(qū)及匯管周圍炎癥，無間隔纖維化或橋接樣壞死；III為小葉纖維化和/或橋接樣壞死；IV期為肝硬化。二、膽管癌細胞株人膽管癌細胞株RBE由北京大學肝病研究所提供，凍存于液氮中，復蘇后培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI1640中，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。三、實驗方法

1.免疫印跡法1. 1SDS-PAGE :安裝電泳儀及灌膠玻片；參照分子克隆提供的配膠方案配制18%分離膠和4%積層膠；于玻片間隙灌注分離膠，上鋪一層雙蒸水保持液面平整同時防止空氣接觸凝膠抑制聚合反應；待分離膠凝固后(約20分鐘)，倒去雙蒸水，用面巾紙將殘余水分吸干，灌入積層膠，插入梳子；積層膠聚合時，蛋白樣品與2X上樣緩沖液等體積混合，100°C煮沸5分鐘使蛋白變性；待積層膠凝固后，拔出梳子，電泳槽內加入IXTris-電泳緩沖液以電泳緩沖液，用電泳緩沖液沖洗上樣孔；用微量移液器按預定順序加樣，每孔上樣20μ I總蛋白。上樣后，60V穩(wěn)壓條件下進行電泳，直至溴酚蘭到達分離膠底部，關閉電源結束電泳。電泳結束時，拆開玻璃板，把分離膠切成適當大小準備轉膜。1. 2轉膜裁剪NC膜，使其與分離膠的大小一致，漂浮于去離子水的水面上使排凈NC膜上氣泡；將六張大小與分離膠相同的3Μ濾紙和經(jīng)上述處理的NC膜一起浸泡于轉移緩沖液中；按如下的步驟安裝電轉移裝置；平放夾板，3層3Μ濾紙放于其上，精確對齊，擠出氣泡；將浸泡好的NC膜放在濾紙上，中間不留氣泡；將凝膠轉移到去離子水中漂洗一下，然后準確平放于NC膜上，排出氣泡；另外3張濾紙放在凝膠之上，確保各層精確對齊，防止濾紙接觸發(fā)生短路；根據(jù)凝膠面積按O. 65mA/cm2穩(wěn)流電轉移8小時。1. 3抗原抗體特異性結合把NC膜轉移到小塑料盒中，按O. lml/cm2膜面積加入6%脫脂奶的I X TBST封閉液，排凈氣泡，37°C下?lián)u床封閉3小時；將NC膜切成小條，按O.1ml/cm2膜面積加入6%脫脂奶的I X TBST封閉液及1:1000稀釋度的待測患者的血清，排凈氣泡，4°C搖床反應2小時；1 XTBST漂洗五次，每次10分鐘；按O. lml/cm2膜面積加入6%脫脂奶的I X TBST封閉液及1:5000稀釋度的辣根過氧化物酶標記的二抗IgG抗體，室溫下?lián)u床反應45分鐘；I X TBST漂洗五次，每次10分鐘。1. 4顯影按O. 125ml/cm2膜面積取ECL A液與B液等量混合，將NC膜浸入顯色液中，反復振蕩并翻轉NC膜，30秒鐘 45秒鐘后取出，用面巾紙稍蘸干，置于壓片盒內兩張透明塑料膜間，覆以X光片，合夾曝光。3分鐘后洗片，同時再壓一張膠片，根據(jù)第一張膠片的顯影情況，調整曝光時間。2.圖像分析軟件Quantity One對Sp20抗體滴度進行相對灰度值的測定。3.統(tǒng)計學方法應用SPSS10. O統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學處理，計量資料比較用t檢驗計量資料以均數(shù)土標準差表示。計數(shù)資料用Fisher確切概率法，計數(shù)資料用例數(shù)或百分數(shù)表示，P<0. 05為差異有統(tǒng)計學意義。四、實驗結果(一)抗-Sp20的檢測結果利用免疫印跡法觀察到8(8/35)例PBC患者和I (1/20)例干燥綜合征患者出現(xiàn)抗_Sp20的陽性條帶，而在8例AIH患者、8例慢性乙型肝炎、5例慢性丙型肝炎和9例健康獻血者則未出現(xiàn)抗_Sp20的陽性條帶。每次實驗均設立一抗和二抗的陰性對照。每份血清均檢測三次，三次結果均出現(xiàn)抗_Sp20的陽性條帶者被判定為抗-Sp20陽性。抗-Sp20在PBC患者中的陽性率為22. 8%,特異性為98%。結果見表I及圖1o表I不同患者抗_Sp20的檢測結果
權利要求
1.一種原發(fā)性膽汁性肝硬化的特異性自身抗體和相應抗原，其特征在于，所述特異性自身抗體是以膽管癌細胞RBE總蛋白作為抗原，利用免疫印跡法檢測原發(fā)性膽汁性肝硬化PBC患者血清，檢測到針對分子量20kD蛋白的自身抗體，將其命名為Sp20抗體，然后利用雙向電泳從PBC患者血清中分離得到該Sp20抗體。
2.權利要求1所述的特異性自身抗體所對應的抗原，其分子量為分子量20kD。
3.權利要求1所述的特異性自身抗體和權利要求2所述的相應抗原在制備診斷原發(fā)性膽汁性肝硬化試劑盒中的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種原發(fā)性膽汁性肝硬化的特異性自身抗體和相應抗原，所述特異性自身抗體是以膽管癌細胞RBE總蛋白作為抗原，利用免疫印跡法檢測原發(fā)性膽汁性肝硬化PBC患者血清，檢測到針對分子量約20kD蛋白的自身抗體，將其命名為Sp20抗體，然后利用雙向電泳從PBC患者血清中分離得到該Sp20抗體。本發(fā)明還提供該Sp20抗體在制備診斷原發(fā)性膽汁性肝硬化試劑盒中的應用。通過研究Sp20抗體在PBC發(fā)病中的機制，為PBC患者早期診斷、早期治療及預后的判斷提供理論依據(jù)。有助于對AMA陰性的PBC患者的診斷，以及有助于與其它自身免疫病的鑒別診斷。
文檔編號C07K14/47GK103044548SQ201210560268
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月20日 優(yōu)先權日2011年12月23日
發(fā)明者魏來, 張?，? 王江華 申請人:北京大學人民醫(yī)院