專(zhuān)利名稱(chēng)：合成和純化寡聚物的新方法
合成和純化寡聚物的新方法發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明總體上涉及寡核苷酸的試劑、合成和純化領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
寡核苷酸是短鏈核酸聚合物，典型地含有幾個(gè)至幾百個(gè)核苷酸。它們是基因組研究和生物技術(shù)的重要工具。雖然寡核苷酸可以通過(guò)較長(zhǎng)前體的分裂產(chǎn)生，但是現(xiàn)在它們更通常是由單體以序列特異性的方式合成。它們典型地是在固體載體上使用亞磷酰胺化學(xué)或磷酸酯化學(xué)合成。

圖1A顯示了一個(gè) 使用亞磷酰胺的固相寡核苷酸合成的典型合成循環(huán)。四個(gè)主要步驟包括:1)脫三苯甲基化；2)偶聯(lián)；3)封端；和4)氧化。如圖1中所示，第一核苷酸被化學(xué)鍵合到固體載體(例如，可控孔度玻璃珠(controlled pore glass bead))上。這些可以以預(yù)鍵合到固體載體上的第一核苷酸的形式從商業(yè)來(lái)源購(gòu)買(mǎi)。要啟動(dòng)合成，使用溫和的酸(例如，惰性溶劑如二氯甲烷或甲苯中2%或3%的三氯乙酸)將第一核苷酸的5,-羥基的保護(hù)基團(tuán)(常用的5,-羥基的保護(hù)基團(tuán)是三苯甲基(B卩，-C(Ph)3)或4，4' - 二甲氧基三苯甲基，其可以縮寫(xiě)為DMT，DMTr)除去。然后，將具有3’ -亞磷酰胺基團(tuán)(例如，3' -O- (2-氰乙基-N-N- 二異丙基)亞磷酰胺)的5' -DMTr保護(hù)的第二核苷酸偶聯(lián)到固體載體上的第一核苷酸上游離的5,-羥基基團(tuán)上。該偶聯(lián)可以通過(guò)使用酸性唑催化劑(例如，IH-四唑)在乙腈中活化亞磷酰胺而實(shí)現(xiàn)。然后將活化的亞磷酰胺與游離的5'-羥基反應(yīng)，以形成亞磷酸三酯鏈接(linkage)。因?yàn)榕悸?lián)反應(yīng)的效率永遠(yuǎn)不會(huì)是100%，所以一些游離的5'-羥基將會(huì)保留。使用乙酸酐和?；呋瘎?例如N-甲基咪唑)將任何未反應(yīng)的5'-羥基封端，以防止失敗序列(failure sequence)在下一個(gè)循環(huán)中反應(yīng)。封端之后，將亞磷酸三酯氧化，從而將它轉(zhuǎn)化成磷酸酯鏈接。氧化可以用碘在弱堿(例如吡啶)的存在下完成。這些步驟完成了第一偶聯(lián)循環(huán)。所述方法可以重復(fù)多個(gè)循環(huán)直到合成了期望的寡核苷酸。類(lèi)似的方法在圖1B中示出，其使用了 H-膦酸酯單體代替亞磷酰胺。除了僅需要一個(gè)氧化步驟并且是在合成結(jié)束時(shí)進(jìn)行之外，大部分步驟是類(lèi)似的。在鏈延長(zhǎng)完成時(shí)，寡核苷酸仍附著在固體載體上并且完全被保護(hù)。為了提供功能性的寡核苷酸，需要除去保護(hù)基團(tuán)并且需要將寡核苷酸產(chǎn)物從固體載體上釋放。這些可以使用堿溶液(例如氫氧化銨或甲胺水溶液)以及可能的其它預(yù)處理步驟(例如2-氰乙基保護(hù)基團(tuán)的脫保護(hù))完成。上述合成步驟可用于DNA或RNA寡聚物的合成。然而，對(duì)于RNA的合成，2’-羥基需要用耐受反應(yīng)條件的基團(tuán)進(jìn)行保護(hù)。典型的2’-羥基的保護(hù)基團(tuán)包括叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)和三異丙基甲硅烷氧基甲基(TOM) ο通常，偶和步驟不會(huì)100%完成。未完成的反應(yīng)導(dǎo)致短鏈體(short-mer)的形成。如上提到的，短鏈體典型地使用試劑例如乙酸酐進(jìn)行封端，以防止它們?cè)诜磸?fù)的固相合成中生長(zhǎng)。這通常導(dǎo)致產(chǎn)生寡聚物池，所述寡聚物池由短鏈體(n-l、n-2、n-3等聚體)和期望的全長(zhǎng)產(chǎn)物組成。圖2的(A)和(B)分別顯示了 HPLC色譜和PAGE分析，以證明產(chǎn)物是含有一些失敗序列的混合物的事實(shí)。來(lái)自寡核苷酸合成的產(chǎn)物總是含有失敗序列(較短的寡核苷酸，大部分是η-1聚體)。傳統(tǒng)上使用HPLC或硅膠電泳例如PAGE純化這些粗產(chǎn)物。雖然這些方法對(duì)于純化短寡核苷酸是可以接受的，但是對(duì)于純化較長(zhǎng)的寡核苷酸(例如50-300聚體)卻是不能接受的。另外，這些方法可能是昂貴并且耗時(shí)的，可能消耗大量的溶劑并且可能僅限于熟練的的專(zhuān)業(yè)人員使用。為了促進(jìn)寡核苷酸的合成和純化，已經(jīng)發(fā)明了替代的方法，例如使用合成純化處理以繞過(guò)HPLC或PAGE的使用。這些替代方法的例子包括親氟萃取(Belier，C.；Bannwarth, ff., Noncovalent Attachment of Nucleotides by Fluorous-FluorousInteractions !Application to a simple Purification Principle for Synthetic DNAFragments, Helv.Chim.Acfa2005，88，第 171-179 頁(yè)；W02006/081035A2)，生物素-抗生物素蛋白實(shí)現(xiàn)的親和萃取(Fang, S.；Bergstrom, D.E., Reversible Biotinylation ofthe 5' -Terminus of Oligodeoxyribonucleotides and its Application in AffinityPurification, Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, John Wiley & Sons,Inc.2001 ；Fang, S.；Bergstrom, D.E., Reversible5' -endBiotinylation and AffinityPurification of Synthetic RNA, Tetrahedron Letters2004,45 (43), 7987-7990),以及通過(guò) Diels-Alder (W02003/062452A2)和聚合(美國(guó)專(zhuān)利公布 N0.2008/0081902AI)的基于反應(yīng)的萃取方法?；谟H和的方法(即，氟親和萃取和生物素-抗生物素蛋白方法)需要復(fù)雜的合成以產(chǎn)生帶標(biāo)記的寡核苷酸把手(handle)，這可能是昂貴的。在氟親和萃取的情況下，含氟磷酸化試劑偶聯(lián)得太慢而不用作長(zhǎng)鏈寡核苷酸合成的封端試劑。對(duì)于作為最后單體的用途來(lái)說(shuō)，5’-DMTr氟修飾的亞磷酰胺單體微溶于乙腈，偶聯(lián)得慢且低效。它們還需要最終的酸性處理，這可能會(huì)導(dǎo)致脫嘌呤化并且影響長(zhǎng)鏈寡核苷酸的完整性。這種方法還需要氟相親和柱，其增加了復(fù)雜性和成本，并且可能不適于高通量或大規(guī)模純化。生物素-抗生物素蛋白實(shí)現(xiàn)的親和萃取還沒(méi)有廣泛地使用，并且從未用作封端試劑來(lái)誘捕失敗序列。因?yàn)樯锼乇旧淼某杀?，制造生物素磷酸化試劑或?’修飾的亞磷酰胺單體是昂貴的。此外，生物素亞磷酰胺(磷酸化試劑和單體)不是特別溶于乙腈并且推薦的偶聯(lián)時(shí)間較慢(即約15分鐘)。因此，它們不適于作為封端試劑。另外，這些方法還沒(méi)有顯示出適用于長(zhǎng)鏈寡核苷酸。同時(shí)，這些方法依賴(lài)于生物素對(duì)鏈霉親和素珠子的親和力，這在高通量或大規(guī)模平臺(tái)上是昂貴的。由于基于親和的方法的成本和其它問(wèn)題，人們已經(jīng)試驗(yàn)了代替的方法，例如基于反應(yīng)的方法。這些方法包括使用Diels-Alder和聚合的那些方法。在Diels-Alder方法中，使用二烯磷酸化試劑封端截短的序列，所述序列然后可能通過(guò)與含順丁烯二酰亞胺的固體載體的4+2環(huán)加成而被拉出產(chǎn)物混合物。在實(shí)踐中，這種方法僅限于純化短鏈寡核苷酸(小于20聚體)并且由于低效的反應(yīng)最終產(chǎn)率和純度 較低。試劑封端截?cái)嗟?失敗的)序列。在完成合成之后，引發(fā)自由基聚合以形成聚合物，其然后可以與全長(zhǎng)產(chǎn)物分離。丙烯酰胺亞磷酰胺單體也已經(jīng)被用作鏈中的最后的核苷酸，并且全長(zhǎng)產(chǎn)物可以通過(guò)自由基聚合而被誘捕，由此將它們與短鏈聚體分離，所述短鏈聚體中不含有丙烯酰胺部分。再一次地，這種方法對(duì)于(例如小于20聚體的)短鏈寡核苷酸是可行的，但是擔(dān)心自由基聚合可能由于側(cè)鏈反應(yīng)的原因改變期望的寡核苷酸的完整性。此外，對(duì)期望的全長(zhǎng)產(chǎn)物的總體純化和回收也低于最佳水平。因此，這種方法可能不適于高通量純化或大規(guī)模生產(chǎn)。雖然這些現(xiàn)有技術(shù)的方法適用于一些情況，但是仍然需要更好的用于合成和純化寡核苷酸的方法。發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)方面涉及用于寡核苷酸合成或純化的試劑，其中所述試劑具有如下結(jié)構(gòu):X-C-L-H (式 A)其中，X是能夠與核苷 、核苷酸、寡核苷酸等上的5’ -羥基反應(yīng)以形成穩(wěn)定鍵合的官能團(tuán)，所述鍵合能夠耐受寡核苷酸合成中反復(fù)的核苷酸偶聯(lián)循環(huán)、脫保護(hù)和裂解反應(yīng)；適宜的X官能團(tuán)可以包括亞磷酰胺、H-膦酸酯、縮醛、異氰酸酯等。C是直接的鍵(direct bond)或者可裂解的接頭，其中所述可裂解的接頭由-Ca-Cb-表示，其中Ca與X連接并且是直接的鍵、烴基、芳基、雜芳基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、核苷，其各自任選地被一至兩個(gè)取代基所取代，所述取代基選自鹵素、羥基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷基、氨基或烷氨基；Cb是直接的鍵、硅烷基、三苯基或鄰位(Vicinyl)醇基。優(yōu)選的Ca是直接的鍵、(C1-C12)烴基、(C6-C12)芳基、5至12元雜芳基、(C3-C12)環(huán)烷基、4至12元雜環(huán)基、核苷；L是烴基鏈，其可以任選地被一至四個(gè)取代基所取代，所述取代基獨(dú)立地選自由以下組成的組:5至9元雜芳基、4至9元雜環(huán)基、氨基、醚基、羧基、氨基甲酰基、(C6-C12)芳基、-0-R”、-0-C0-R”、-NR’-R”、-NR’-C0-R”、-C0-NR’-R”、_C0-R”、-CN、鹵素或它們的組合，其中R’和R”獨(dú)立地為H或(C1-C6)烴基；優(yōu)選地L為烴基例如(C1-C12)烷基、(C2-C12)烯基或(C2-C12)炔基，其各自可以任選地被一至兩個(gè)取代基所取代，所述取代基選自氨基、醚基、羧基、氨基甲酰基或鹵素?；蛘週可以為其中插入了其它原子的烴基鏈，如-(CHR’)a-Wb-(CffiTh-Vd-(CHIT)e-所不，其中W和V獨(dú)立地為-0-、_S-或-NR’ - ;R’為H或(C「C6)燒基；并且a、b、c、d和e獨(dú)立地為O至10的整數(shù)，優(yōu)選為O至6，或者優(yōu)選為O至3，并且a、b、C、d和e的和優(yōu)選為2至6的整數(shù)。并且H是“點(diǎn)擊把手(click handle) ”，其如上所定義并且可以包括端基炔或活化的環(huán)辛炔。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及活化的環(huán)辛炔化合物。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，活化的環(huán)辛炔化合物具有式(I)所示結(jié)構(gòu)。
權(quán)利要求
1.用于寡核苷酸合成或純化的試劑，其中所述試劑具有如下結(jié)構(gòu):X-C-L-H (式 A) 其中， X是亞磷酰胺基、H-膦酸酯基、縮醛基、或異氰酸酯； C是直接的鍵或者可裂解的接頭，其中所述可裂解的接頭由-Ca-Cb-表示，其中Ca與X連接并且是直接的鍵、烴基、芳基、雜芳基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、核苷，其各自任選地被一至兩個(gè)取代基所取代，所述取代基選自鹵素、羥基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷基、氨基或烷氨基；cb是直接的鍵、硅烷基、三苯甲基或鄰位醇基； L是烴基鏈，其可以任選地被一至四個(gè)取代基所取代，所述取代基獨(dú)立地選自由5至9元雜芳基、4至9元雜環(huán)基、氨基、醚、羧基、氨基甲?；?C6-C12)芳基、-O-R”、-O-CO-R”、-NR，-R，，、-NR，-CO-R”、-CO-NR，-R，，、_C0-R”、-CN、鹵素或它們的組合所組成的組，其中R，和R”獨(dú)立地為H或(C1-C6)烴基；或者L是其中插入了其它原子的烴基鏈，如_(CHR’)a-Wb-(CHR’ )c-Vd-(CHR> )e-所示，其中W和V獨(dú)立地為-0-、-S-或-NR’ -;R’為H或(C1-C6)烷基；并且a、b、C、d和e獨(dú)立地為O至10的整數(shù)；并且 H為端基炔或活化的環(huán)辛炔。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑，其中H為活化的環(huán)辛炔基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑，其中C由-Ca-Cb-表示，其中Ca與X連接并且是直接的鍵、(C「C12)烴基、(C6-C12)芳基、5至12元雜芳基、(C3-C12)環(huán)烷基、4-12元雜環(huán)基、核苷，其各自任選地被一至兩個(gè)取代基所取代，所述取代基選自鹵素、羥基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷基、氨基或烷氨基；Cb是直接的鍵，硅烷基、三苯甲基或鄰位醇基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑，其中(I)L為烴基，選自(C1-C12)烷基、(C2-C12)烯基或(C2-C12)炔基，其各自可以任選地被取代基所取代，所述取代基選自氨基、醚、羧基、氨基甲?；螓u素；或(2) L由通式-(CH2) a-ffb- (CH2) C-Vd- (CH2)「表示，其中W和V獨(dú)立地為-0-、-S-或-NR，-，其中R，為氫或低級(jí)烷基(例如，(C1-C3)烷基或(C1-C6)烷基);并且a、b、C、d和e獨(dú)立地為O至10的整數(shù)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2至4任一項(xiàng)所述的試劑，其具有式(I)所示結(jié)構(gòu):
6.根據(jù)權(quán)利要求2至5任一項(xiàng)所述的試劑，其中 A)X是亞磷酰胺基團(tuán)并且所述試劑具有如下式(II)所表示的結(jié)構(gòu):
7.一種合成多核苷酸的方法，其包括: (a)對(duì)固體載體上的寡核苷酸的5’-羥基保護(hù)基團(tuán)脫保護(hù)以產(chǎn)生固體載體上的寡核苷酸的游離的5’ -羥基； (b)將含有5’-羥基保護(hù)基團(tuán)的核苷酸單體通過(guò)所述核苷酸單體上的3’-含磷基團(tuán)偶聯(lián)到固體載體上寡核苷酸的游離5’ -羥基上； (c)使用封端試劑封端固體載體上寡核苷酸的未反應(yīng)的5’-羥基，其中所述封端試劑為權(quán)利要求1-9所述的試劑；和 (d)將步驟(a)-(c)重復(fù)選定的次數(shù)以制備固體載體上的多核苷酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述封端試劑由式(I)表示。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中式⑴的X為由-P(OR13)(NR14R15)表示的亞磷酰胺基團(tuán)，其中R13為氰乙基，并且R14和R15各自獨(dú)立地為(C1-C6)烷基。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其還進(jìn)一步包括: (e)對(duì)多核苷酸脫保護(hù)并從固體載體上裂解以產(chǎn)生產(chǎn)物混合物； (f)使產(chǎn)物混合物的溶液與含疊氮化物的固體載體或含氮酮的固體載體反應(yīng)；和 (g)從固體載體上分離含多核苷酸的溶液。
全文摘要
用于寡核苷酸合成或純化的試劑，其中所述試劑具有結(jié)構(gòu)X-C-L-H(式A)其中X是亞磷酰胺基、H-膦酸酯基、縮醛基、或異氰酸酯；C-是直接的鍵或者由-Ca-Cb-表示的可裂解的接頭；L是烴基鏈；并且H為端基炔或活化的環(huán)辛炔。式(A)的試劑可以用于合成和純化寡核苷酸。
文檔編號(hào)C07H1/00GK103172681SQ20121059584
公開(kāi)日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2012年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月30日
發(fā)明者杰里米·拉基, 艾米麗·馬林·勒普魯 申請(qǐng)人:安捷倫科技有限公司