專利名稱：抗癌融合蛋白的制作方法
抗癌融合蛋白本發(fā)明涉及治療性融合蛋白、特別是重組融合蛋白的領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及包含可溶性人TRAIL蛋白序列的片段和抗血管生成肽的序列的融合蛋白，包含它們的藥物組合物，它們在治療、特別是抗癌試劑中的用途，以及編碼所述融合蛋白的多核苷酸序列，包含所述多核苷酸序列的表達(dá)載體，以及包含這些表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。TRAIL蛋白屬于細(xì)胞因子家族(腫瘤壞死因子相關(guān)的細(xì)胞調(diào)亡誘導(dǎo)性配體)，也被稱作Apo2L(Apo2-配體)，是腫瘤細(xì)胞和被病毒感染的細(xì)胞中的細(xì)胞調(diào)亡的強(qiáng)有力的激活子。TRAIL是體內(nèi)天然產(chǎn)生的配體。TRAIL蛋白，其氨基酸序列，編碼DNA序列和蛋白表達(dá)系統(tǒng)首次公開于EP0835305A1。TRAIL蛋白通過與促細(xì)胞調(diào)亡TRAIL表面受體I和2 (TRAIL-R1/R2)結(jié)合并隨后激活這些受體來發(fā)揮其抗癌活性。這些受體，也被稱作DR4和DR5(死亡受體4和死亡受體5)，屬于TNF受體家族并且在不同類型的癌癥細(xì)胞上過表達(dá)。這些受體的激活能誘導(dǎo)阻抑基因P53非依賴性細(xì)胞調(diào)亡的外部信號傳導(dǎo)途徑，其通過激活的胱天蛋白酶-8引起執(zhí)行性胱天蛋白酶的激活，從而降解核酸。在TRAIL激活后釋放的胱天蛋白酶-8也可引起B(yǎng)id蛋白的釋放，從而間接激活線粒體途徑，Bid蛋白轉(zhuǎn)位至線粒體，在那里其刺激細(xì)胞色素c的釋放，因此間接擴(kuò)大來自死亡受體的細(xì)胞調(diào)亡信號。TRAIL選擇性作用于腫瘤細(xì)胞，基本上不誘導(dǎo)健康細(xì)胞的調(diào)亡，健康細(xì)胞對該蛋白是抗性的。因此，認(rèn)識到TRAIL作為抗癌試劑的巨大潛力，其作用于多種不同類型的腫瘤細(xì)胞，包括血液惡性腫瘤和實(shí)體腫瘤，同時(shí)極少影響正常細(xì)胞并顯示出潛在相對小的副作用。TRAIL蛋白是II型膜蛋白，其具有281個(gè)氨基酸的長度，在被蛋白酶切割后，它的包含氨基酸殘基114-281的細(xì)胞外區(qū)域形成大小為20kDa的可溶性sTRAIL分子，其也是具有生物活性的。TRAIL和sTRAIL這兩種形式都能通過與存在于靶細(xì)胞上的TRAIL受體相互作用而激發(fā)細(xì)胞調(diào)亡。使用細(xì)胞系測試證明了 TRAIL分子的可溶性部分的強(qiáng)烈的抗腫瘤活性和非常低的系統(tǒng)性毒性。 同樣，對于具有對應(yīng)于hTRAIL的氨基酸114-281的氨基酸序列的重組人可溶性TRAIL (rhTRAIL)(在INN下稱作dulanermin)的人類臨床研究顯示出其良好的耐受性并且沒有劑量限制性毒性。短于114-281的TRAIL片段也能結(jié)合膜死亡受體并通過這些受體誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡，如最近就122-281hTRAIL的重組循環(huán)序列改變的突變體所報(bào)道的，例如見EP1688498。到目前為止所報(bào)道的重組TRAIL蛋白對于肝細(xì)胞的毒性效應(yīng)似乎與修飾即多聚組氨酸標(biāo)簽的存在相關(guān)，而非標(biāo)簽化的TRAIL不顯示系統(tǒng)性毒性。然而，在進(jìn)一步研究和開發(fā)的過程中，很多癌癥細(xì)胞似乎顯示出對于TRAIL的原發(fā)性或獲得性抗性(見例如W02007/022214)。雖然對于TRAIL的抗性的機(jī)理尚未完全了解，但是相信其可在TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞調(diào)亡途徑的不同水平表現(xiàn)其自己，從細(xì)胞表面受體水平到信號傳導(dǎo)途徑內(nèi)的執(zhí)行性胱天蛋白酶。這種抗性限制了 TRAIL作為抗癌試劑的有用性。此外，在對患者進(jìn)行的臨床試驗(yàn)中證明，TRAIL作為單一治療的實(shí)際有效性是低下的。為了克服這種低的效率和腫瘤對TRAIL的抗性，設(shè)計(jì)了與放療和化療試劑的多種組合治療，其產(chǎn)生了協(xié)同性細(xì)胞調(diào)亡效應(yīng)(W02009/002947; A.Almasan andA.Ashkenazi, Cytokine Growth Factor Reviewsl4(2003)337-348;RK Srivastava, Neoplasis, Vol3，No6, 2001，535-546，Soria JC et al., J.Clin.0ncology, Vol28, No9 (2010), p.1527-1533)。在W02009/140469中描述了 rhTRAIL與所選擇的常規(guī)的化療試劑(紫杉醇、卡鉬)和單克隆抗-VEGF抗體組合用于癌癥治療的用途。然而，此類組合必然意味著公知的常規(guī)化療或放療的缺陷。此外，已經(jīng)證明與TRAIL治療法相關(guān)的問題是其低穩(wěn)定性以及在施用之后迅速從身體清除。癌癥治療的靶標(biāo)之一還在于抑制腫瘤血管生成。血管生成(血管新生)是病理性的、時(shí)間非限制性的產(chǎn)生新血管的過程，其為腫瘤提供氧和營養(yǎng)。血管生成對于腫瘤的生長和擴(kuò)增是必不可少的，并促進(jìn)其轉(zhuǎn)移。抑制腫瘤血管生成在癌癥治療中的有益效應(yīng)是已知的。嘗試了臨床使用抑制或調(diào)節(jié)血管生成過程的物質(zhì)，既作為癌癥治療又補(bǔ)充癌癥治療。血管生成抑制劑是已知的，有內(nèi)源性的天然存在于人體中的，也有多種外源性的抗血管生成物質(zhì)。其中有血管生成的蛋白質(zhì)抑制劑，包括內(nèi)源性蛋白質(zhì)的蛋白水解片段。舉例而言，血管生成的蛋白質(zhì)抑制劑例如血管抑素(angiostatin)(纖維蛋白原的片段)、內(nèi)皮抑素(endostatin)(膠原XVIII的C末端片段)、I丐網(wǎng)蛋白(calreticulin)、血管抑制素(vasostatin)-鈣網(wǎng)蛋白片段，催乳素片段，金屬蛋白酶2片段，或腫瘤抑素(tumstatin)-膠原 IV 的片段(Cao Y.Angiogenesis modulates adipogenesisand obesity.J Clin Invest.2007;117(9):2362 - 2368, Folkman J.Angiogenesis:anorganizing principle for drug discovery Nat Rev Drug Discov.2007;6:273 - 286)。例如，腫瘤抑素是大小為28kDa的肽，IV型膠原的片段，能夠結(jié)合整合素α νβ 3并通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖而阻止血 管生成。此外，腫瘤抑素獨(dú)立地抑制局部粘著斑激酶(Focal Adhesion Kinase, FAK)和磷脂酰肌醇3_激酶PI3和蛋白激酶PKB/Akt的激活。抗血管生成活性也可通過抑制促血管生成蛋白來實(shí)現(xiàn)，例如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，其通過位于血管內(nèi)皮上的受體來發(fā)揮作用，其是血管新生的主要刺激劑。在臨床處理包括癌癥治療中，某些針對VEGF的物質(zhì)已經(jīng)被用作抗血管生成因子，例如單克隆抗體貝伐單抗和雷珠單抗。也已知其它的刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的、獨(dú)立于位于內(nèi)皮上的受體的促血管生成因子，其包括例如，細(xì)胞因子例如血小板衍生的生長因子PDGF和表皮生長因子EGF、TNF和血管生成素(angiopoietin)。在血管生成的過程中，還涉及酶氨基肽酶N(APN/⑶13)，其為跨膜金屬蛋白酶。已知抑制該酶可導(dǎo)致對于腫瘤生成過程的抑制。多種氨基肽酶N的天然和合成抑制劑是已知的(Bavouis B., Dauzonne D., Aminopeptidase-N/CD13(EC3.4.11.2)inhibitors: chemistry, biological evaluations, and therapeutic prospects.MedicalResearch Review, 2006, 26, (I) ,88-130)。APN/⑶13的天然抑制劑主要包括由微生物產(chǎn)生的物質(zhì)。其中的代表為貝他定(bestatin)、姜黃素(curcumin)和療菜素(apigenin)。還發(fā)現(xiàn)含有CNGRC基序的短肽能夠有效結(jié)合 CD13(Arap et al.，Science, 279:377-380，1998)。很多抗血管生成物質(zhì)目前處于不同的研究階段，包括臨床試驗(yàn)。然而，旨在抑制血管生成的已知療法具有很多熟知的缺點(diǎn)。例如，治療性單克隆抗體貝伐單抗在治療乳腺癌中的益處最近遭到質(zhì)疑。很多抗血管生成藥物顯示出例如非常短的半衰期、低溶解性、差的生物可獲得性和毒性副作用?？寡苌伤幬锏陌踩允翘貏e重要的，因?yàn)槠溲娱L的使用和缺乏治療的選擇性。對于有效的治療劑的強(qiáng)烈需求和腫瘤疾病的性質(zhì)使得需要對于此類藥物的簡化的注冊程序，因此不可能知道所述藥物的所有副作用和缺點(diǎn)。雖然，與化療劑不同(化療劑是針對所有迅速增殖中的細(xì)胞)，抗血管生成藥物是針對不同階段的血管形成，其導(dǎo)致治療的毒性的減少。然而，仍然需要旨在抑制血管生成同時(shí)確保針對腫瘤細(xì)胞的選擇性的抗癌治療。因此，需要具有改善的毒性特性的新的抗血管生成性抗癌治療。包含通過金屬蛋白酶切割位點(diǎn)連接子連接的血管生成抑制劑血管抑制素(vasostatin)和TRAIL114-281的序列的構(gòu)建的融合蛋白被描述為在腫瘤細(xì)胞中顯示出誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡的效應(yīng)，見A.1.Guo et al, Chinese Journal of Biochemistry and MolecularBiology2008, vol.24(10)，925-930。包含血管生成抑制劑鈣網(wǎng)蛋白和TRAIL114-281的序列的構(gòu)建的融合蛋白被描述為在腫瘤細(xì)胞中顯示誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效應(yīng)，見CN1609124A。CN1256347C 公開了由激肽原(kininogen)D560-148 和 TRAIL114-281 組成的融合蛋白。包含通過編碼GGGSGGSG的連接子連接于TRAILl 14-281的N或C末端的血管生成抑制劑kininostatin、血管抑制素和canstatin的構(gòu)建體的融合蛋白描述于FengFeng-Yi “Phase and Clinical Trial of Rh_Apo2L and Apo2L_Related ExperimentalStudy”，Ph.D.degree thesis, Chinese Peking Union Medical, 2006-10-01;http://www.1w23.com/lunwen_957708432。包含血管生成抑 制劑腫瘤抑素(tumstatin)的Tumstatinl83_230和TRAIL114-281的序列的構(gòu)建的融合蛋白被描述為顯示出誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞的細(xì)胞調(diào)亡，見N.Ren et al, Academic Journal of Second Military Medical University2008, vol.28 (5)，676-478。US2005/244370和對應(yīng)的 W02004/035794公開了 TRAIL95-281 的構(gòu)建體，其作為效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域，通過肽連接子與作為細(xì)胞表面結(jié)合結(jié)構(gòu)域的TNF家族配體的另一成員CD40的細(xì)胞外部分連接。其指出該構(gòu)建體的激活是通過其CD40部分的結(jié)合。本發(fā)明提出了解決該問題的方案:提供了新的融合蛋白，其包含源自TRAIL的結(jié)構(gòu)域和具有抗血管生成活性并不包括TRAIL片段的短的效應(yīng)子肽結(jié)構(gòu)域，其中所述效應(yīng)子肽加強(qiáng)或補(bǔ)充TRAIL的作用。根據(jù)本發(fā)明的蛋白選擇性針對癌細(xì)胞，其中蛋白的各個(gè)元件發(fā)揮它們的效應(yīng)，特別地，效應(yīng)子肽抑制腫瘤血管生成。本發(fā)明的蛋白向腫瘤環(huán)境的遞送使得針對體內(nèi)的健康細(xì)胞的毒性以及副作用最小化，并且減小了施用頻率。此外，通過使用本發(fā)明的蛋白的靶向治療允許避免之前已知的由血管的低滲透性引起的非特異性抗血管生成治療法的低效率問題。此外，在很多情況下，本發(fā)明的融合蛋白比可溶性TRAIL及其變體、包括序列的片段更強(qiáng)。直至目前，用于本發(fā)明的融合蛋白中的已知的效應(yīng)子肽未被用于藥物，因?yàn)槔绮焕硐氲膭?dòng)力學(xué)、被非特異性蛋白酶迅速降解或由于缺乏正確的激活途徑次序(這對于使效應(yīng)子肽在靶位點(diǎn)的正確作用是必須的)而在體內(nèi)積累。效應(yīng)子肽向融合蛋白中的摻入允許使它們選擇性地遞送至需要它們發(fā)揮作用的位點(diǎn)。此外，效應(yīng)子肽的連接增大了蛋白質(zhì)量，這產(chǎn)生了延長的半衰期并增加了腫瘤中蛋白的保持以及其增強(qiáng)的效率。另外，在很多情況下，新的融合蛋白還克服了對于TRAIL的抗性。


現(xiàn)在將通過閱讀附圖詳細(xì)描述本發(fā)明。圖1顯示了根據(jù)Ex.1、Ex.2、Ex.3、Ex.4、Ex.5和Ex.6的本發(fā)明的融合蛋白的示意性結(jié)構(gòu)。圖2顯示了根據(jù)Ex.7、Ex.8、Ex.9、Ex.10和Ex.11的本發(fā)明的融合蛋白的示意性結(jié)構(gòu)。圖3顯示了根據(jù)Ex.12、Ex.13、Ex.14和Ex.15的本發(fā)明的融合蛋白的示意性結(jié)構(gòu)。圖4 顯不了以比捕圓率(specific ellipticity)表不的 rhTRAIL95_281 和Ex.1, Ex.4, Ex.5, Ex.9和Ex.14的融合蛋白的圓二色性光譜。圖5顯示了，相對于以rhTRAILl 14-281處理，以Ex.1, Ex.4, Ex.5和Ex.9的本發(fā)明的融合蛋白處理的具有結(jié)腸癌HCTl 16的Crl:⑶1-Foxnlnu小鼠中的腫瘤體積變化(初始階段的百分率)。圖6顯示了，相對于以rhTRAILl 14-281處理，以Ex.1, Ex.4, Ex.5和Ex.9的本發(fā)明的融合蛋白處理的具有結(jié)腸 癌HCT116的Crl:⑶1-FoxnlnuI小鼠中的腫瘤生長抑制值(%TGI)。圖7顯示了，相對于以rhTRAIL114_281處理，以Ex.1的本發(fā)明的融合蛋白處理的具有肺癌A549的Crl:⑶1-Foxnlnu小鼠中的腫瘤體積變化(初始階段的百分率)。圖8顯示了，相對于以rhTRAIL114_281處理，以Ex.1的本發(fā)明的融合蛋白處理的具有肺癌A549的Crl = CDl-FoxnlnuI小鼠中的腫瘤生長抑制值(％TGI)。圖9顯示了 Ex.16, Ex.17, Ex.18和Ex.19的本發(fā)明的融合蛋白的示意結(jié)構(gòu)。圖10 顯示了，相對于以 rhTRAIL114-281 處理，以 Ex.5，Ex.4，Ex.9 和 Ex.1 的本發(fā)明的融合蛋白處理的具有結(jié)腸癌HCTl 16的Crl:⑶1-Foxnlnu小鼠中的腫瘤體積變化(初始階段的百分率)。圖11 顯示了，相對于以 rhTRAIL114_281 處理，以 Ex.5，Ex.4，Ex.9 和 Ex.1 的本發(fā)明的融合蛋白處理的具有結(jié)腸癌HCT116的Crl:⑶1-FoxnlnuI小鼠中的腫瘤生長抑制值(%TGI)。圖12顯示了，相對于以rhTRAILl 14-281處理，以Ex.6和Ex.11的本發(fā)明的融合蛋白處理的具有結(jié)腸癌HCTl 16的Crl = SHO-PrkdcseidHrhr小鼠中的腫瘤體積變化(初始階段的百分率)。圖13顯示了，相對于以rhTRAILl 14-281處理，以Ex.6和Ex.11的本發(fā)明的融合蛋白處理的具有結(jié)腸癌HCT116的Crl = SHO-PrkdcseidHrhr小鼠中的腫瘤生長抑制值(％TGI)。圖14顯示了，相對于以rhTRAILl 14-281處理，以Ex.6和Ex.19的本發(fā)明的融合蛋白處理的具有結(jié)腸癌Colo205的Crl = SHO-PrkdcseidHrhr小鼠中的腫瘤體積變化(初始階段的百分率)。圖15顯示了，相對于以rhTRAIL114-281處理，以Ex.6和Ex.19的本發(fā)明的融合蛋白處理的具有結(jié)腸癌Colo205的Crl = SHO-PrkdcseidHrhr小鼠中的腫瘤生長抑制值(％TGI)。圖16顯示了，相對于以rhTRAILl 14-281處理，以Ex.6和Ex.11的本發(fā)明的融合蛋白處理的具有結(jié)腸癌SW620的Crl = SHO-PrkdcseidHrto小鼠中的腫瘤體積變化(初始階段的百分率)。圖17顯示了，相對于以rhTRAILl 14-281處理，以Ex.6和Ex.11的本發(fā)明的融合蛋白處理的具有結(jié)腸癌SW620的Crl = SHO-PrkdcseidHrhr小鼠中的腫瘤生長抑制值(％TGI)。圖18顯示了，相對于以rhTRAIL114_281處理，以Ex.1的本發(fā)明的融合蛋白處理的具有肺癌A549的Cby.Cg-foxnl (nu)/J小鼠中的腫瘤體積變化(初始階段的百分率)。圖19顯示了，相對于以rhTRAIL114-281處理，以Ex.1的本發(fā)明的融合蛋白處理的具有肺癌A549的Cby.Cg-foxnl (nu)/J小鼠中的腫瘤生長抑制值(％TGI )。圖20顯示了，相對于以rhTRAIL114-281處理，以Ex.6的本發(fā)明的融合蛋白處理的具有肺癌NC1-H460的Crl = SHO-PrkdcseidHrto小鼠中的腫瘤體積變化(初始階段的百分率)。圖21顯示了，相對于以rhTRAIL114_281處理，以Ex.6的本發(fā)明的融合蛋白處理的具有肺癌NC1-H460的Crl = SHO-PrkdcseidHrhr小鼠中的腫瘤生長抑制值(％TGI)。圖22顯示了，相對于以rhTRAIL114-281處理，以Ex.5，Ex.6，Ex.11的本發(fā)明的融合蛋白處理的具有肺癌A549的Crl = SHO-PrkdcseidHrhr小鼠中的腫瘤體積變化(初始階段的 百分率)。圖23顯示了，相對于以rhTRAIL114-281處理，以Ex.5，Ex.6，Ex.11的本發(fā)明的融合蛋白處理的具有肺癌A549的Crl = SHO-PrkdcseidHrhr小鼠中的腫瘤生長抑制值(％TGI)。圖24顯示了，相對于以rhTRAIL114-281處理，以Ex.5的本發(fā)明的融合蛋白處理的具有肺癌NC1-H460-Luc2的Crl = SHO-PrkdcseidHrto小鼠中的腫瘤體積變化(初始階段的
百分率)。圖25顯示了，相對于以rhTRAIL114_281處理，以Ex.5的發(fā)明的融合蛋白處理的具有肺癌NC1-H460-Luc2的Crl = SHO-PrkdcseidHrhr小鼠中的腫瘤生長抑制值(％TGI)。圖26顯示了，相對于以rhTRAIL114_281處理，以Ex.5和Ex.1的本發(fā)明的融合蛋白處理的具有肺癌A549的Crl = SHO-PrkdcseidHrhlr小鼠中的腫瘤體積變化(初始階段的百分率)圖27顯示了，相對于以rhTRAIL114_281處理，以Ex.5和Ex.1的本發(fā)明的融合蛋白處理的具有肺癌A549的Crl = SHO-PrkdcseidHrhr小鼠中的腫瘤生長抑制值(％TGI)。圖28顯示了，相對于以rhTRAILl 14-281處理，以Ex.6和Ex.11的本發(fā)明的融合蛋白處理的具有肝癌PLC/PRF/5的Crl = SHO-PrkdcseidHrto小鼠中的腫瘤體積變化(初始階段的百分率)。圖29顯示了，相對于以rhTRAIL114-281處理，以Ex.6和Ex.11的本發(fā)明的融合蛋白處理的具有肝癌PLC/PRF/5的Crl = SHO-PrkdcseidHrhr小鼠中的腫瘤生長抑制值(％TGI)。圖30顯示了，相對于以rhTRAILl 14-281處理，以Ex.6和Ex.19的本發(fā)明的融合蛋白處理的具有HepG2肝癌的Crl: SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的腫瘤體積變化(初始階段的
百分率)。圖31顯示了，相對于以rhTRAILl 14-281處理，以Ex.6和Ex.19的本發(fā)明的融合蛋白處理的具有H印G2肝癌的Crl = SHO-PrkdcseidHrhr小鼠中的腫瘤生長抑制值(％TGI)。圖32顯示了，相對于以rhTRAIL114_281處理，以Ex.11的本發(fā)明的融合蛋白處理的具有PANC-1胰腺癌的Crl = SHO-PrkdcseidHrto小鼠中的腫瘤體積變化(初始階段的百分率)。圖33顯示了，相對于以rhTRAIL114_281處理，以Ex.11的本發(fā)明的融合蛋白處理的具有PANC-1胰腺癌的Crl: SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的腫瘤生長抑制值(％TGI )。圖34顯示了，相對于以rhTRAILl 14-281處理，以Ex.6和Ex.19的本發(fā)明的融合蛋白處理的具有多藥物抗性人子宮肉瘤MES-SA/Dx5的Crl = SHO-PrkdcseidHrhr小鼠中的腫瘤體積變化(初始階段的百分率)。圖35顯示了， 相對于以rhTRAILl 14-281處理，以Ex.6和Ex.19的本發(fā)明的融合蛋白處理的具有多藥物抗性人子宮肉瘤MES-SA/Dx5的Crl = SHO-PrkdcseidHrhr小鼠中的腫瘤生長抑制值(％TGI)。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及融合蛋白，其包含:-結(jié)構(gòu)域(a)，其為可溶性hTRAIL蛋白的序列的功能片段，該片段起始于不低于hTRAIL95的位置處的氨基酸；或具有至少70%序列同一性的所述功能片段的同源物；和-結(jié)構(gòu)域(b)，其為抗血管生成效應(yīng)子肽的序列，其中結(jié)構(gòu)域(b)的序列連接于結(jié)構(gòu)域(a)的C末端和/或N末端；條件是排除這樣的融合蛋白:其中效應(yīng)子肽選自I丐網(wǎng)蛋白(calreticulin)、腫瘤抑素(tumstatin) 183-230、激肽原(kininogen) D5、血管抑制素(vasostatin)、kininostatin 和 canstatin。術(shù)語“可溶性hTRAIL的序列的功能性可溶性片段”應(yīng)該被理解為指可溶性hTRAIL的任何能夠在結(jié)合于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面上的其受體之后在該細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡信號的片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員還將認(rèn)識到:TRAIL序列的至少70%的同源性的存在是本領(lǐng)域已知的。應(yīng)該理解，本發(fā)明的融合蛋白中的效應(yīng)子肽結(jié)構(gòu)域(b)不是hTRAIL蛋白，也不是hTRAIL蛋白的一部分或片段。根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語“肽”應(yīng)被理解為從通過肽鍵連接在一起的多個(gè)氨基酸的分子構(gòu)建物。因此，根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語“肽”包括寡肽、多肽和蛋白質(zhì)。在本發(fā)明中，肽的氨基酸序列將以本領(lǐng)域采納的常規(guī)方式表示，從肽的N末端(N-端)至其C末端(C-端)。因此，任何序列均為左側(cè)為N末端，右側(cè)為C末端。本發(fā)明的融合蛋白在結(jié)構(gòu)域(a)的C末端或N末端連接至少一個(gè)效應(yīng)子肽結(jié)構(gòu)域(b)。在具體的實(shí)施方式中，結(jié)構(gòu)域(a)是hTRAIL序列的片段，起始于hTRAIL95至hTRAIL121的氨基酸，含端點(diǎn)，結(jié)束于氨基酸hTRAIL281。
具體地，結(jié)構(gòu)域(a)可選自對應(yīng)于hTRAIL95-281, hTRAILl 19-281，hTRAIL120-281和 hTRAIL121-281 的序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，hTRAIL95_281, hTRAIL119_281, hTRAIL120-281 和 hTRAIL121-281 分別代表GenBank 中登記號 P50591 ^hTRAILCSEQ ID NO: 16)的已知序列中的起始于編號95，119，120和121的氨基酸的人TRAIL蛋白的片段。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，結(jié)構(gòu)域(a)是起始于不低于hTRAIL95的氨基酸位置并結(jié)束于氨基酸hTRAIL281的可溶性hTRAIL蛋白序列的功能片段的同源物，該序列與原始序列至少70%、優(yōu)選85%同一。在該實(shí)施方式的具體變體中，結(jié)構(gòu)域(a)是選自對應(yīng)于hTRAIL95_281，hTRAILl 14-281，hTRAILl 16-281, hTRAIL120-281, hTRAIL121_281 和 hTRAIL122_281 的序列的片段的同源物。應(yīng)該理解，hTRAIL片段的同源物是該片段的氨基酸序列的變體/修飾，其中至少一個(gè)氨基酸被改變，包括I個(gè)氨基酸、2個(gè)氨基酸、3個(gè)氨基酸、4個(gè)氨基酸、5個(gè)氨基酸、6個(gè)氨基酸，和不超過15%的氨基酸，并且其中修飾的序列的片段具有hTRAIL序列的保留的功能，即結(jié)合細(xì)胞表面死亡受體和在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。氨基酸序列的修飾可以包括例如，置換、缺失和/或添加氨基酸。優(yōu)選地，具有修飾的序列的hTRAIL片段的同源物顯示出相對于hTRAIL的天然片段而言，與死亡受體DR4 (TRAIL-Rl)或DR5 (TRAIL-R2)的改變的親和性。術(shù)語“改變的親和性”是指增加的親和性和/或具有改變的受體選擇性的親和性。優(yōu)選地，具有修飾的序列的hTRAIL片段的同源物顯示出相對于hTRAIL的天然片段而言對于死亡受體DR4和DR5的增加的親和性。特別優(yōu)選地，具有修飾的序 列的hTRAIL片段的同源物顯示出相對于死亡受體DR5比對于死亡受體DR4增加的親和性，即增加的選擇性DR5/DR4。同樣優(yōu)選地，具有修飾的序列的hTRAIL片段的同源物顯示出對于死亡受體DR4和/或DR5的比對于受體DRl (TRAIL-R3)和/或DR2 (TRAIL-R4)的與親和性相關(guān)的增加的選擇性。產(chǎn)生對于死亡受體DR4和DR5的增加的親和性和/或選擇性的hTRAIL的修飾是本領(lǐng)域已知的，例如見 Tur V, van der Sloot AM, Reis CR, Szegezdi E, CoolRH, Samali A, Serrano L,Quax WJ.DR4-selective tumor necrosis factor-relatedapoptosis-1nducing ligand (TRAIL)variants obtained by structure-based design.J.Biol.Chem.2008Jull8; 283 (29): 20560-8，其描述了 D218H 突變具有對于 DR4 的增加的選擇性；或 Gasparian ME, Chernyak BV, Dolgikh DA, Yagolovich AV, Popova EN, SychevaAM, Moshkovskii SA, Kirpichnikov MP.Generation of new TRAIL mutants DR5-A andDR5-B with improved selectivity to death receptor5, Apoptosis.2009Jun;14(6):778-87，其描述了 D269H突變對于DR4具有降低的親和性。產(chǎn)生對于選自DR4和DR5的一種受體的增加的親和性(相對于DRl和DR2受體)和對于受體DR5的增加的親和性(相對于DR4)的 hTRAIL 突變體也描述于 W02009077857 和 W02009066174。合適的突變是選自下列的天然hTRAIL位置中的一個(gè)或多個(gè)突變:131，149，159，I93，199，201，204，204，212，215，218和251，特別地，涉及以堿性氨基酸例如賴氨酸、組氨酸
或精氨酸，或諸如谷氨酸或天冬氨酸的氨基酸置換某氨基酸的突變。特別地可提及選自下列的一個(gè)或多個(gè)突變:G131R, G131K, R149I, R149M, R149N, R149K, S159R, Q193H, Q193K, N199H, N199R, K201H, K201R, K204E, K204D, K204L, K204Y, K212R, S215E, S215H, S215K, S215D, D218Y, D218H, K251D, K251E 和 K251Q,描述于 W02009066174。合適的突變還有選自195、269和214的天然hTRAIL位置中的一個(gè)或多個(gè)突變，特別是涉及以堿性氨基酸例如賴氨酸、組氨酸或精氨酸置換某氨基酸的突變。具體地可提及選自D269H, E195R和T214R的一個(gè)或多個(gè)突變，描述于W02009077857。在具體的實(shí)施方式中，為hTRAIL的片段的同源物的結(jié)構(gòu)域(a)選自天然TRAIL序列的D218H突變體，如W02009066174所描述，或天然TRAIL序列的Y189N-R191K-Q193R-H264R-1266R-D269H 突變體，如 Gasparian ME, Chernyak BV, Dolgikh DA, YagolovichAV, Popova EN, Sycheva AM, Moshkovskii SA, Kirpichnikov MP.Generation of new TRAILmutants DR5—A and DR5-B with improved selectivity to death receptor5, Apoptosis 2009Jun; 14(6):778-87 中所描述。結(jié)構(gòu)域(b)可以特別地選自下組:-選自VEGF、PDGF和EGF的生長因子受體的抑制劑；-腫瘤抑素或除了片段183-230之外的其片段；和-氨基肽酶N(CD13)的抑制劑。在生長因子的受體的抑制劑組內(nèi)，結(jié)構(gòu)域(b)的效應(yīng)子肽可以是人血管內(nèi)皮生長因子VEGF的片段，其與天然配體競爭性結(jié)合VEGF受體，同時(shí)其本身缺乏血管生成活性。結(jié)果為，VEGF的血管生成活性被阻斷，沒有對于新血管形成的刺激，腫瘤生長被抑制。特別地，上述組的效應(yīng)子肽是抑制VEGF信號途徑的肽，具體為序列表中SEQ ID NO: 17所示的人VEGF的7個(gè)氨基酸的片段。據(jù)信包含VEGF 七肽序列的肽摻入到本發(fā)明的融合蛋白中將通過抑制血管生成過程而有效清除癌細(xì)胞。在生長因子的受體的抑制劑組內(nèi)，結(jié)構(gòu)域(b)的效應(yīng)子肽可以是血小板衍生的生長因子TOGF的片段，其與天然配體競爭性結(jié)合TOGF受體，同時(shí)其本身缺乏血管生成活性。結(jié)果為，PDGF的血管生成活性被阻斷，沒有對于新血管形成的刺激，腫瘤生長被抑制。特別地，所述效應(yīng)子肽是序列表中SEQ ID NO: 22所示的TOGF配體的片段一 19個(gè)氨基酸的肽。據(jù)信包含血小板衍生的生長因子TOGF蛋白片段的序列的肽摻入到本發(fā)明的融合蛋白中將通過抑制血管生成過程而有效清除癌細(xì)胞。在生長因子的受體的抑制劑組內(nèi)，結(jié)構(gòu)域(b)的抗血管生成效應(yīng)子肽可以是表皮生長因子EGF的肽片段，其與天然配體競爭性結(jié)合EGF受體，同時(shí)其本身缺乏血管生成活性。結(jié)果為，EGF的血管生成活性被阻斷，沒有對于新血管形成的刺激，腫瘤生長被抑制。能夠結(jié)合EGF受體而不激活細(xì)胞內(nèi)激酶并且能夠阻斷EGR活性的此種阻斷性肽Gly Leu ArgSer Leu Lys Glu 和 Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu 是已知的，例如見 EP0641358。特別地，此類效應(yīng)子肽為EGF配體的片段，如序列表中SEQ ID N0:23所示。據(jù)信包含表皮生長因子EGF的序列的肽摻入到本發(fā)明的融合蛋白中將通過抑制血管生成過程而有效清除癌細(xì)胞。在腫瘤抑素及其片段的組內(nèi)，結(jié)構(gòu)域(b)的效應(yīng)子肽可以是腫瘤抑素蛋白的25個(gè)氨基酸的片段(片段I)，如序列表中SEQ ID N0:18所示。上述組的效應(yīng)子肽也為腫瘤抑素蛋白的另一個(gè)18個(gè)氨基酸的片段(片段II)，如序列表中SEQ ID NO: 19所示。結(jié)構(gòu)域(b)的抗血管生成效應(yīng)子肽也可以是腫瘤抑素肽片段的組合，特別是片段I和片段II的組合，彼此以任意順序相鄰。在一個(gè)實(shí)施方式中，結(jié)構(gòu)域(b)是片段I/片段II的組合(SEQ IDN0:18/SEQ ID NO: 19)或片段 11/片段 I 的組合(SEQ ID N0:19/SEQ ID NO: 18)。據(jù)信包含腫瘤抑素蛋白片段I和/或片段II的序列的肽摻入到本發(fā)明的融合蛋白中將通過抑制血管生成過程而有效清除癌細(xì)胞。氨基肽酶N/⑶13的抑制劑(其結(jié)合酶氨基肽酶N/⑶13以抑制其活性)的組將包括包含基序NGR或RGD的短肽。包含基序NGR的有效結(jié)合氨基肽酶N的肽如例如Arap etal.，Science, 279:377-380, 1998所描述。在氨基肽酶N的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中，也存在顯示出對于RGD基序的親和性的片段。兩個(gè)基序(R⑶和NGR)都作為拮抗劑結(jié)合參與血管新生過程的因子。因此，類似于NGR基序的RGD基序可能與氨基肽酶N結(jié)合，從而作為其抑制劑發(fā)揮作用(Friedlander et al.Definition of two angiogenic pathways bydistinct a v integrins.Science(Washington DC), 270:1500-1502, 1995;Pasqualini etal Aminopeptidase N is a receptor for tumor-homing peptides and a target forinhibiting angiogenesis.Cancer Res.2000Febl;60(3):722-7)。在氨基肽酶N/⑶13的抑制劑的組內(nèi)，結(jié)構(gòu)域(b)的抗血管生成效應(yīng)子肽可以是序列表中SEQ ID NO: 20所示的結(jié)合⑶13的5個(gè)氨基酸的肽。該組的另一個(gè)效應(yīng)子肽是序列表中SEQ ID NO: 21所示的結(jié)合⑶13的9個(gè)氨基酸的肽。據(jù)信包含結(jié)合氨基肽酶N/CD13的蛋白片段的序列的肽摻入到本發(fā)明的融合蛋白中將通過抑制血管生成過程而有效清除癌細(xì)胞。

本發(fā)明的融合蛋白可包含不止一個(gè)效應(yīng)子肽結(jié)構(gòu)域(b)，特別是2個(gè)或3個(gè)結(jié)構(gòu)域(b)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的融合蛋白包含2個(gè)相似或不同的效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域(b)，選自SEQ.N0.17，SEQ.N0.18，SEQ.N0.19，SEQ.N0.20，SEQ.N0.21，SEQ.N0.22 和 SEQ.N0.23，其中效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域(b)彼此相鄰。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明的融合蛋白包含2個(gè)相似或不同的效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域(b)，選自 SEQ.N0.17，SEQ.N0.18，SEQ.N0.19，SEQ.N0.20，SEQ.N0.21，SEQ.N0.22和SEQ.N0.23，其中效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域(b)位于結(jié)構(gòu)域(a)的N末端和/或C末端。在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明的融合蛋白包含3個(gè)效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域。作為一個(gè)例子，融合蛋白包含位于結(jié)構(gòu)域(a)的N末端的源自VEGF的肽(SEQ IDNO: 17)和位于結(jié)構(gòu)域(a)的C末端的彼此相鄰的腫瘤抑素的片段I (SEQ ID NO: 18)和腫瘤抑素的片段II (SEQ ID NO: 19)。在本發(fā)明的融合蛋白的具體實(shí)施方式
中，效應(yīng)子肽是選自下列的具有抗血管生成活性的肽:SEQ ID NO: 17 (源自VEGF的七肽)，SEQ ID NO: 18 (腫瘤抑素蛋白的片段I (氨基酸74-98))，SEQ ID NO: 19 (腫瘤抑素蛋白的片段II (氨基酸197-214))，SEQ ID NO:20(結(jié)合 CD13 的肽)，SEQ ID N0:21 (結(jié)合 CD13 的肽)，SEQ ID NO:22 (PDGF 的片段)和 SEQ IDNO:23 (EGF 的片段)。在與存在于癌細(xì)胞表面上的TRAIL受體結(jié)合之后，融合蛋白將顯示出雙重效應(yīng)。結(jié)構(gòu)域(a)，其為TRAIL的功能片段或具有保留的功能的其同源物，將顯示出其已知的激動(dòng)劑活性，即結(jié)合細(xì)胞表面上的死亡受體并激活細(xì)胞凋亡的外部途徑。包含抗血管生成肽的融合蛋白內(nèi)化之后，結(jié)構(gòu)域(b)將能夠與TRAIL結(jié)構(gòu)域平行地潛在地細(xì)胞內(nèi)地發(fā)揮其作用。通過這種方式，TRAIL的抗癌活性可通過其它元件和機(jī)制的激活而被加強(qiáng)，例如天然VEGF、TOGF和EGF配體的結(jié)合位點(diǎn)的空間抑制、血管生成和血管新生的抑制、磷脂酰肌醇3-激酶、蛋白激酶B (PKB/Akt)的激活的抑制或激酶Akt和NFk途徑對TRAIL過表達(dá)的間接刺激。在另一實(shí)施方式中，結(jié)構(gòu)域(a)和結(jié)構(gòu)域(b)通過至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域(C)連接,結(jié)構(gòu)域(C)包含被存在于細(xì)胞環(huán)境、特別是腫瘤細(xì)胞環(huán)境中的蛋白酶識別的切割位點(diǎn)序列。結(jié)構(gòu)域(a)和結(jié)構(gòu)域(b)通過至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域(C)連接意思是在結(jié)構(gòu)域(a)和(b)之間可以存在不止一個(gè)結(jié)構(gòu)域(C)，特別是I個(gè)或2個(gè)結(jié)構(gòu)域(C)。

蛋白酶切割位點(diǎn)可以選自:-被金屬蛋白酶MMP識別的序列，特別是表示為SEQID N0:24的(Pro Leu GlyLeu Ala Gly Glu Pro/PLGLAGEP)或表示為 SEQ ID NO:55 的(Pro Leu Gly He Ala GlyGlu/PLGIAGE)或表示為 SEQ ID NO:56 的(Pro Leu Gly Leu Ala Gly GluPro/PLGLAGEP)；-被尿激酶uPA識別的序列，特別是表示為SEQID N0:25的Arg Val Val Arg(以單字符表示為RVVR)，或其片段，其與其所結(jié)合的序列的最后一個(gè)氨基酸形成SEQ IDNO:25 ；以及它們的組合。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，蛋白酶切割位點(diǎn)是被金屬蛋白酶MMP識別的序列與被尿激酶uPA識別的序列的組合，以任何順序彼此相鄰。在一個(gè)實(shí)施方式中，結(jié)構(gòu)域(c)是MMP/uPA SEQ.N0.24/SEQ.N0.25的組合，或uPA/MMP SEQ.No25/SEQ.N0.24 的組合。在一個(gè)實(shí)施方式中，結(jié)構(gòu)域(c)是MMP/uPA SEQ.N0.55/SEQ.N0.25的組合，或uPA/MMP SEQ.No25/SEQ.N0.55 的組合。在一個(gè)實(shí)施方式中，結(jié)構(gòu)域(c)是MMP/uPA SEQ.N0.56/SEQ.N0.25的組合，或uPA/MMP SEQ.No25/SEQ.N0.56 的組合。蛋白酶金屬蛋白酶MMP和尿激酶uPA在腫瘤環(huán)境中過表達(dá)。被蛋白酶識別的序列的存在能夠使結(jié)構(gòu)域(a)從結(jié)構(gòu)域(b)切割下來，即釋放功能性結(jié)構(gòu)域(b)并由此實(shí)現(xiàn)其激活。蛋白酶切割位點(diǎn)的存在允許迅速釋放效應(yīng)子肽，增加融合蛋白被存在于細(xì)胞中的蛋白酶隨機(jī)降解之前肽向其作用位點(diǎn)轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)會(huì)。除了融合蛋白的主要功能元件，切割位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域之外，本發(fā)明的融合蛋白可包含中性序列/柔性空間甘氨酸-半胱氨酸-丙氨酸連接子(間隔子)的序列。此類連接子/間隔子是本領(lǐng)域熟知的并且在文獻(xiàn)中有描述。將它們摻入融合蛋白的序列中是為了使得通過在宿主細(xì)胞中過表達(dá)而產(chǎn)生的蛋白的正確折疊。特別地，柔性空間連接子可以選自SEQ.N0.26和SEQ.N0.27，其為甘氨酸、半胱氨酸和丙氨酸殘基的組合。在另一實(shí)施方式中，柔性空間連接子可以選自SEQ.N0.28，SEQ.N0.29，SEQ.N0.30和SEQ.N0.54，其由甘氨酸和絲氨酸組成。另外，柔性空間連接子可以是SEQ.N0.28，SEQ.N0.29，SEQ.N0.30和SEQ.N0.54的任何片段，作為柔性空間連接子發(fā)揮作用，例如片段Gly Gly Gly/GGG或片段Gly Gly/GG。
在一個(gè)實(shí)施方式中，柔性空間連接子也可以選自單一的氨基酸殘基，例如谷氨酸殘基、半胱氨酸、絲氨酸、脯氨酸或甘氨酸殘基。在其它實(shí)施方式中，柔性空間連接子可以是SEQ.N0.26，SEQ.N0.27，SEQ.N0.28，SEQ.N0.29，SEQ.N0.30，SEQ.N0.54組成的連接子與谷氨酸殘基、半胱氨酸、絲氨酸、
脯氨酸或甘氨酸的單一氨基酸殘基的任意組合。本發(fā)明的融合蛋白的具體實(shí)施方式
為包含選自SEQ.N0.1, SEQ.N0.2，SEQ.N0.4，SEQ.N0.5，SEQ.N0.6，SEQ.N0.46，SEQ.N0.47 和 SEQ.N0.48 的抗血管生成肽和包含源自VEGF的七肽的效應(yīng)子肽的融合蛋白。本發(fā)明的融合蛋白的其它具體實(shí)施方式
是包含選自SEQ.N0.7和SEQ.N0.8的抗血管生成肽和包含結(jié)合⑶13的效應(yīng)子肽的融合蛋白。本發(fā)明的融合蛋白的其它具體實(shí)施方式
是包含選自SEQ.N0.9，SEQ.N0.10，SEQ.N0.11和SEQ.N0.49的抗血管生成肽和包含I3DGF的片段作為效應(yīng)子肽的融合蛋白。本發(fā)明的融合蛋白的其它具體實(shí)施方式
是包含選自SEQ.N0.12和SEQ.N0.13的抗血管生成肽和包含腫瘤抑素I和II片段作為效應(yīng)子肽的融合蛋白。本發(fā)明的融合蛋白的其它具體實(shí)施方式
是包含選自SEQ.N0.14和SEQ.N0.15的抗血管生成肽和包含EGF的片段作為效應(yīng)子肽的融合蛋白。本發(fā)明的融合蛋白的具體實(shí)施方式
是包含選自SEQ.N0.3的抗血管生成肽和包含源自VEGF的七肽、腫瘤抑素肽的片段I和腫瘤抑素肽的II片段作為效應(yīng)子肽的融合蛋白。上述代表性融合蛋白的詳細(xì)描述顯示于圖1-3和圖9，以及如下文的實(shí)施例所描述。 根據(jù)本發(fā)明，融合蛋白意思是包含2個(gè)或更多個(gè)蛋白或其片段的單一的蛋白分子，所述2個(gè)或更多個(gè)蛋白或其片段通過它們各自的肽鏈內(nèi)的肽鍵共價(jià)連接而無另外的化學(xué)連接子。融合的蛋白也可另外被描述為蛋白構(gòu)建體或嵌合蛋白。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“構(gòu)建體”或“嵌合蛋白”如果被使用的話，應(yīng)該被理解為是指上文定義的融合蛋白。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員，顯而易見的是由此定義的融合蛋白可通過肽和蛋白的已知的化學(xué)合成方法來合成。融合蛋白可通過化學(xué)肽合成的方法來合成，特別是使用合適的樹脂作為載體，使用固相肽合成技術(shù)進(jìn)行。此類技術(shù)是常規(guī)的和本領(lǐng)域已知的，特別描述于例如下列專論中:Bodanszky 和 Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis, 1984, Springer-Verlag,New York, Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition，1984，PierceChemical Company。融合蛋白可通過肽的化學(xué)合成方法作為連續(xù)蛋白來合成?；蛘撸梢詥为?dú)合成蛋白的各個(gè)片段(結(jié)構(gòu)域)，然后通過一個(gè)肽片段的氨基末端與另一個(gè)肽的羧基末端的縮合經(jīng)由肽鍵而組合在一起。此類技術(shù)是常規(guī)的和本領(lǐng)域已知的。為了驗(yàn)證得到的肽的結(jié)構(gòu)，可以使用肽的氨基酸組成的已知的分析方法，例如高分辨率質(zhì)譜技術(shù)，以確定肽的分子量。為了確認(rèn)肽的序列，也可以使用蛋白測序儀，其依次降解肽并鑒定氨基酸的序列。然而，優(yōu)選地，本發(fā)明的融合蛋白是重組蛋白，通過編碼融合蛋白的多核苷酸序列在宿主細(xì)胞中的基因表達(dá)的方法來產(chǎn)生。本發(fā)明的另一方面是編碼如上所述的融合蛋白的多核苷酸序列、特別是DNA序列。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的編碼如上所述的融合蛋白的多核苷酸序列、特別是DNA序列是針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的序列。本發(fā)明的另一個(gè)方面是包含多核苷酸序列、特別是如上所述的本發(fā)明的DNA序列的表達(dá)載體。本發(fā)明的另一個(gè)方面是包含上文所述的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。用于表達(dá)本發(fā)明的融合蛋白的優(yōu)選宿主細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。用于產(chǎn)生重組蛋白、包括融合蛋白的方法是熟知的。簡而言之，該技術(shù)為:產(chǎn)生編碼靶蛋白的氨基酸序列和在宿主中指導(dǎo)靶蛋白的表達(dá)的多核苷酸分子例如DNA分子。然后，將編碼靶蛋白的多核苷酸分子摻入合適的表達(dá)載體，其確保多肽的有效表達(dá)。然后將重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞以進(jìn)行轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)化，由此產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。然后培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞以過表達(dá)靶蛋白，純化所獲得的蛋白，任選地通過切割用于表達(dá)或純化蛋白的標(biāo)簽序列而切下來。用于表達(dá)和純化的合適的技術(shù)描述于例如下列專著:Goeddel, Gene ExpressionTechnology, Methods in Enzymologyl85, Academic Press,San Diego,CA(1990)和A.Staron et al., Advances Mikrobiol.，2008，47，2，1983-1995。作為用于導(dǎo)入和在宿主細(xì)胞中復(fù)制DNA序列的表達(dá)載體，可以使用粘粒、質(zhì)?；蛐揎椀牟《尽ＭǔＪ褂觅|(zhì)粒作為表達(dá)載體。合適的質(zhì)粒是熟知的和商業(yè)上可獲得。本發(fā)明的表達(dá)載體 包含編碼本發(fā)明的融合蛋白的多核苷酸分子和用于轉(zhuǎn)錄和翻譯摻入合適的宿主細(xì)胞的編碼序列的必要的調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列的選擇取決于宿主細(xì)胞的類型，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地進(jìn)行。此類調(diào)節(jié)序列的實(shí)例是包含轉(zhuǎn)錄起始信號的、插入編碼序列之前的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和增強(qiáng)子或RNA聚合酶結(jié)合序列，核糖體結(jié)合序列，和插入編碼序列之后的轉(zhuǎn)錄終止序列。此外，取決于所用的宿主細(xì)胞和載體，可以將其它序列導(dǎo)入表達(dá)載體，例如復(fù)制起始子，另外的DNA限制性位點(diǎn)，增強(qiáng)子和允許誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的序列。表達(dá)載體還包含標(biāo)記物基因序列，其賦予轉(zhuǎn)化的細(xì)胞確定的表型并使得能夠特異性選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。此外，載體還可以包含第二標(biāo)記物序列，其允許將以包含插入的編碼靶蛋白序列的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞與攝取了無插入物的質(zhì)粒的細(xì)胞區(qū)分開。通常，使用典型的抗生素抗性標(biāo)記物，然而，任何其它本領(lǐng)域已知的報(bào)告子基因均可使用，其在細(xì)胞(在體內(nèi))中的存在可使用放射自顯影技術(shù)、分光光度法或生物和化學(xué)發(fā)光法容易地確定。例如，取決于宿主細(xì)胞，可使用例如下列報(bào)告基因半乳糖苷酶、葡萄糖苷酸酶、螢光素酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶或綠色熒光蛋白。此外，表達(dá)載體可包含信號序列，將蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至合適的細(xì)胞腔室，例如周質(zhì)，在那里促進(jìn)折疊。另外，可以存在編碼標(biāo)記物/標(biāo)簽例如連接于N末端的HisTag或連接于C末端的GST的序列，其促進(jìn)后續(xù)使用親和法、通過鎳柱上的親和層析純化所產(chǎn)生的蛋白。也可以存在另外的序列，其保護(hù)蛋白免于宿主細(xì)胞中的蛋白水解降解，以及增強(qiáng)其溶解性的序列。連接于靶蛋白的序列的輔助元件可能阻斷其活性，或者由于別的原因而具有有害效應(yīng)，例如由于毒性。此類元件必須被除掉，這可通過酶促或化學(xué)切割來完成。特別地，為了允許通過親和層析而純化蛋白而連接的6個(gè)組氨酸的標(biāo)簽HisTag或這種類型的其它標(biāo)記物應(yīng)該被除去，因?yàn)槠浔幻枋鰧τ诳扇苄訲RAIL蛋白的肝毒性具有影響?？梢允褂没诙喾N熟知的宿主細(xì)胞的異源表達(dá)系統(tǒng)，包括原核細(xì)胞:細(xì)菌，例如大腸桿菌或枯草芽孢桿菌；酵母，例如釀酒酵母或巴斯德畢赤酵母；和真核細(xì)胞系(昆蟲、哺乳動(dòng)物、植物)。優(yōu)選地，由于培養(yǎng)和遺傳操作的容易性和大量的獲得的產(chǎn)物，使用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。因此，包含編碼本發(fā)明的融合蛋白的靶序列的多核苷酸序列將針對在大腸桿菌中的表達(dá)而進(jìn)行優(yōu)化，即，其將包含在大腸桿菌中表達(dá)優(yōu)化的編碼序列密碼子，選自本領(lǐng)域已知的可能的序列變體。此外，表達(dá)載體將包含適合大腸桿菌的連接于編碼序列的上述元件。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的包含編碼本發(fā)明的融合蛋白的序列的多核苷酸序列選自下組的多核苷酸序列:SEQ.N0.31; SEQ.N0.32 ; SEQ.N0.33，SEQ.N0.34 ; SEQ.N0.35 ; SEQ.N0.36 ; SEQ.N0.37 ; SEQ.N0.38 ; SEQ.N0.39 ; SEQ.N0.40 ; SEQ.N0.41, SEQ.N0.42 ; SEQ.N0.43SEQ.N0.44; SEQ.N0.45，SEQ.N0.50，SEQ.N0.51，SEQ.N0.52; SEQ.N0.53 ;其分別編碼具有對應(yīng)于選自下列的氨基酸序列的氨基酸序列的融合蛋白:SEQ.N0.1; SEQ.N0.2 ; SEQ.N0.3 ; SEQ.N0.4; SEQ.N0.5 ; SEQ.N0.6 ; SEQ.N0.7 ; SEQ.N0.8; SEQ.N0.9; SEQ.N0.10; SEQ.N0.11，SEQ.N0.12，SEQ.N0.13; SEQ.N0.14SEQ.N0.15，SEQ.N0.46; SEQ.N0.47; SEQ.N0.48;和 SEQ.N0.49。在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明還提供了適合于轉(zhuǎn)化大腸桿菌的表達(dá)載體,其包含上述選自SEQ.N0.31至SEQ.N0.45和SEQ.N0.50至SEQ.N0.53的多核苷酸序列，以及以此類表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞。轉(zhuǎn)化，即將DNA序列導(dǎo)入細(xì)菌宿主細(xì)胞特別是大腸桿菌，通常在準(zhǔn)備好攝取DNA的感受態(tài)細(xì)胞上進(jìn)行，例如通過以鈣離子在低溫(4° C)處理，然后進(jìn)行熱擊(37-42° C)或通過電穿孔進(jìn)行。此類技術(shù)是熟知的并`且通常由表達(dá)系統(tǒng)的生產(chǎn)商確定，或描述于文獻(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室工作手冊中，例如 Maniatis et al., Molecular Cloning.Cold Spring Harbor, N.Y.，1982)。在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中過表達(dá)本發(fā)明的融合蛋白的程序?qū)⒃谙挛脑斒?。本發(fā)明還提供了包含如上文所述的本發(fā)明的融合蛋白作為活性成分以及合適的藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑和常規(guī)輔助性成分的藥物組合物。藥物組合物將包含有效量的本發(fā)明的融合蛋白和藥學(xué)上可接受的溶解或分散于載體或稀釋劑中的輔助性成分，優(yōu)選是配制為單元?jiǎng)┬突虬鄤┑闹苿┑乃幬镏苿┑男问?。藥物形式和其配制方法以及其它成分、載體和稀釋劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且在文獻(xiàn)中有描述。例如，描
T*^lJ ^iRemington's Pharmaceutical Sciences, ed.20, 2000, Mack PublishingCompany, Easton, USA。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑和輔助性成分”包含本領(lǐng)域已知的任何溶劑、分散介質(zhì)、表面活性劑、抗氧化劑、穩(wěn)定劑、防腐劑(例如抗細(xì)菌劑、抗真菌劑)等滲劑。本發(fā)明的藥學(xué)上可接受的載體可包含多種類型的載體、稀釋劑和賦形劑，這取決于所選的施用途徑和需要的劑型，例如液體、固體和氣霧劑形式，用于口服、胃腸外、吸入、表面，以及所選的形式對于施用途徑(例如注射)是否必須是無菌的。本發(fā)明的藥物組合物的優(yōu)選施用途徑是胃腸外，包括注射途徑，例如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、腫瘤內(nèi)或通過單次或連續(xù)靜脈內(nèi)輸注。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的藥物組合物可以通過直接注射至腫瘤來施用。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的藥物組合物可通過靜脈內(nèi)施用。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的藥物組合物可皮下或腹膜內(nèi)施用。用于胃腸外施用的藥物組合物可以是藥學(xué)上可接受的水性或非水性介質(zhì)中的溶液或分散體，所述介質(zhì)緩沖至合適的PH和與體液等滲(如果必要)，并且還可以包含抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和可溶性物質(zhì)，其使得組合物與受體的組織或血液相容?？砂诮M合物中的其它成分是例如水、醇例如乙醇、多元醇例如甘油、丙二醇，液體乙二醇，脂質(zhì)例如甘油三酯，植物油，脂質(zhì)體。合適的流動(dòng)性和物質(zhì)粒度可通過涂覆性物質(zhì)例如卵磷脂和表面活性劑例如羥丙基纖維素、聚山梨酸酯等來提供。用于液體胃腸外組合物的合適的等滲劑是例如糖，例如葡萄糖，和氯化鈉，及其組合。或者，用于通過注射或輸注施用的藥物組合物可以是粉末形式，例如凍干的粉末，用于在臨使用前以合適的載體例如無菌無熱源水進(jìn)行重構(gòu)。用于胃腸外施用的本發(fā)明的藥物組合物也可具有經(jīng)鼻施用的形式，包括溶液、噴霧劑或氣霧劑。優(yōu)選地，用于經(jīng)鼻施用的形式可以是水溶液，并且是等滲的或緩沖至保持從大約5.5至大約6.5的pH，以維持類似于鼻分泌物的性質(zhì)。此外，其將包含防腐劑或穩(wěn)定劑，例如熟知的鼻內(nèi)制劑中包含的那些。組合物可包含多種抗氧化劑，其延遲一種或多種成分的氧化。此外，為了防止微生物的作用，組合物可包含多種抗細(xì)菌和抗真菌試劑，包括例如，但不限于，尼鉬金酯類，氯丁醇，硫柳汞，山梨酸和這種類型的類似的已知物質(zhì)。一般地，本發(fā)明的藥物組合物可以包含例如至少大約0.01wt%的活性成分。更具體地,組合物可包含1%至75%重量的活性成分，或例如25%至60%重量，但不限于這些數(shù)值。施用于患者包括人類的根據(jù)本發(fā)明的組合物的實(shí)際劑量將由物理和生理因素決定，例如體重、病況的嚴(yán)重性、被治療的疾病的類型，之前或同時(shí)的治療性干預(yù)，患者和施用途徑。合適的單元?jiǎng)┝?，總劑量和組合物中的活性成分的濃度將由主治醫(yī)生決定 。組合物可例如以下列劑量施用:大約I μ g/kg體重至大約1000mg/kg患者體重，例如5mg/kg體重至100mg/kg體重,或5mg/kg體重至500mg/kg體重。融合蛋白和包含它的組合物顯示出抗癌或抗腫瘤活性，可用于治療癌癥疾病。本發(fā)明還提供了如上所述的本發(fā)明的融合蛋白用于治療哺乳動(dòng)物包括人類中的癌癥疾病的用途。本發(fā)明還提供了治療哺乳動(dòng)物包括人類中的癌癥的方法，包括向有此需要的受試者施用抗癌有效量的如上所述的本發(fā)明的融合蛋白，任選為合適的藥物組合物的形式。本發(fā)明的融合蛋白可用于治療血液惡性腫瘤，例如白血病，肉芽腫病，骨髓瘤和其它血液惡性腫瘤。融合蛋白也可用于治療實(shí)體瘤，例如乳腺癌、肺癌包括非小細(xì)胞肺癌，結(jié)腸癌，胰腺癌，卵巢癌，膀胱癌，前列腺癌，腎癌，腦癌等。用于治療癌癥的融合蛋白的合適的施用途徑特別為胃腸外途徑:以注射或輸注的形式、在組合物中和以適合于該施用途徑的形式施用本發(fā)明的融合蛋白。本發(fā)明將以下列一般性程序和具體融合蛋白的實(shí)例進(jìn)行更詳細(xì)的描述。用于過表達(dá)融合蛋白的一般性程序質(zhì)粒的制備
靶融合蛋白的氨基酸序列用作模板以產(chǎn)生編碼它的DNA序列，包含針對在大腸桿菌中的表達(dá)優(yōu)化了的密碼子。此程序允許增大在大腸桿菌中進(jìn)行靶蛋白合成的后續(xù)步驟的效率。然后自動(dòng)化合成得到的核苷酸序列。另外，將限制性酶Ndel (在引導(dǎo)鏈的5’末端)和Xhol (在引導(dǎo)鏈的3’末端)的切割位點(diǎn)添加到得到的編碼靶蛋白的基因中。它們用于將基因克隆進(jìn)入載體pET28a (Novagen)。它們也可用于將編碼蛋白的基因克隆進(jìn)入其它載體。從該構(gòu)建體表達(dá)而來的靶蛋白在N末端可以任選地具有多聚組氨酸標(biāo)簽(6個(gè)組氨酸)，其之前是凝血酶識別的位點(diǎn)，該位點(diǎn)用于后續(xù)通過親和層析進(jìn)行純化。一些靶在不使用任何標(biāo)簽的情況下表達(dá)，特別是不使用組氨酸標(biāo)簽，隨后在SP瓊脂糖上純化。首先通過使用酶Ndel和Xhol對分離的質(zhì)粒進(jìn)行限制性分析、然后通過靶蛋白的整個(gè)閱讀框的自動(dòng)化測序來確認(rèn)得到的構(gòu)建體的正確性。用于測序的引物互補(bǔ)于存在于載體中的T7啟動(dòng)子的序列(5，-TAATACGACTCACTATAGG-3’)和 T7 終止子的序列(5，-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’)。得到的質(zhì)粒用于在商業(yè)化大腸桿菌菌株中過表達(dá)靶融合蛋白，其根據(jù)生產(chǎn)商的推薦進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在選擇性培養(yǎng)基(LB瓊脂，卡那霉素50 μ g/ml, 1%葡萄糖)上獲得的菌落用于制備LB液體培養(yǎng)基(補(bǔ)充了 50 μ g/ml的卡那霉素和1%葡萄糖)中的過夜培養(yǎng)物。在搖動(dòng)的溫育箱中生長大約15小時(shí)之后，培養(yǎng)物用于接種合適的培養(yǎng)物。融合蛋白的過表達(dá)和純化一一般程序A以過夜培養(yǎng)物接 種含有卡那霉素(30 μ g/ml)和100 μ M硫酸鋅的LB培養(yǎng)基。將培養(yǎng)物在37°C溫育直至600nm下的光密度(OD)達(dá)到0.60-0.80。然后加入IPTG至終濃度為0.25-lmM。在25°C搖動(dòng)溫育后(3.5_20h)，將培養(yǎng)物在6，OOOg離心25分鐘。將細(xì)菌沉淀物重懸于含有50mM KH2PO4, 0.5M NaCl，IOmM咪唑，pH7.4的緩沖液中。將懸浮液在冰上超聲8分鐘(40%振幅，15秒脈沖，10秒間隔)。通過在20000g、4°C離心40分鐘而使得到的提取物澄清。以用于制備細(xì)菌細(xì)胞提取物的緩沖液平衡來預(yù)處理N1-Sepharose樹脂(GE Healthcare)。然后使用離心提取物后獲得的上清液將樹脂在4°C過夜溫育。然后將其載入色譜柱并以15-50倍體積的緩沖液50mM KH2PO4, 0.5M NaCl, 20mM咪唑，pH7.4洗滌。使用含有0.5M NaCl pH7.4的50mM KH2PO4緩沖液中的咪唑梯度從柱洗脫獲得的蛋白。通過SDS-PAGE分析獲得的級份。將合適的級份組合并針對50mM Tris緩沖液，pH7.2，150mMNaCl, 500mM L-精氨酸，0.1mM ZnSO4, 0.01%Tween20在4°C過夜透析，同時(shí)，以凝血酶(1:50)切割Histag(如果存在的話)。切割之后，通過使用Benzamidine Sepharose 樹脂純化而從與Histag —起表達(dá)的祀融合蛋白分離凝血酶。在SP瓊脂糖上進(jìn)行不與Histag —起表達(dá)的祀融合蛋白的純化。通過SDS-PAGE電泳分析產(chǎn)物的純度(Maniatis et al, MolecularCloning.Cold Spring Harbor, NY, 1982)。融合蛋白的過表達(dá)和純化一一般程序B以過夜培養(yǎng)物接種含有卡那霉素(30 μ g/ml)和100 μ M硫酸鋅的LB培養(yǎng)基。將培養(yǎng)物在37°C溫育直至600nm下的光密度(OD)達(dá)到0.60-0.80。然后加入IPTG至終濃度為0.5-lmM。在25°C搖動(dòng)溫育20h后，將培養(yǎng)物在6000g離心25分鐘。將過表達(dá)后的細(xì)菌細(xì)胞在弗氏細(xì)胞壓碎器中在含有50mM KH2PO4, 0.5M NaCl, IOmM咪唑，5mMβ -巰基乙醇，0.5mMPMSF(苯基甲基磺酰氟)，pH7.8的緩沖液中破碎。通過在8000g離心50分鐘使得到的提取物澄清。使用獲得的上清液過夜溫育N1-Sepharose樹脂。然后將結(jié)合了蛋白的樹脂載入色譜柱。為了洗掉含有非結(jié)合性蛋白的級份，以15-50倍體積的緩沖液50mM KH2PO4, 0.5MNaCl，IOmM咪唑，5mM β -巰基乙醇，0.5mM PMSF (苯基甲基磺酰氟)，pH7.8洗滌柱。然后，為了洗掉大部分的特異性與床結(jié)合的蛋白，以含有50mM KH2PO4, 0.5M NaCl, 500mM咪唑，10%甘油，0.5mM PMSF, pH7.5的緩沖液洗滌柱。通過SDS-PAGE分析獲得的級份(Maniatis etal, Molecular Cloning.Cold Spring Harbor, NY, 1982)。將含有革巴蛋白的級份組合(如果蛋白是與組氨酸標(biāo)簽一起表達(dá))，以凝血酶切割(lU/4mg蛋白，16°C，8小時(shí))以除掉多聚組氨酸標(biāo)簽。然后將級份針對配制緩沖液(500mM L-精氨酸，50mM Tris, 2.5mM ZnSO4, pH7.4)透析。實(shí)施例1:SEQ ID NO:1的融合蛋白SEQ ID NO:1的蛋白是具有173個(gè)氨基酸的長度和19.8kDa的質(zhì)量的融合蛋白，其中源自VEGF的七肽(SEQ ID NO: 17)連接于序列TRAIL121-281的N末端作為效應(yīng)子肽。在效應(yīng)子肽和TRAIL序列之間插入了柔性甘氨酸空間連接子(SEQ ID N0:28)。該融合蛋白的結(jié)構(gòu)顯示于圖1，其氨基酸序列和包含針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的DNA編碼序列分別顯示于序列表中的SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:31。上述結(jié)構(gòu)的氨基酸序列SEQ ID NO:1用作模板以產(chǎn)生其編碼DNA序列SEQ IDNO: 31。產(chǎn)生了兩種形式的包含DNA編碼序列的質(zhì)粒，一種允許表達(dá)His標(biāo)簽和被凝血酶識別的位點(diǎn)，另一種不含任何標(biāo)簽，根據(jù)上述一般性程序進(jìn)行融合蛋白的過表達(dá)。根據(jù)一般程序A進(jìn)行過表達(dá),使用大腸桿菌BL21 (DE3)和Tuner (DE3) pLysS菌株,二者均來自Novagen。根據(jù)上述一般程序通過電泳分離蛋白。實(shí)施例2:SEQ ID NO:2的融合蛋白SEQ ID NO: 2的蛋白是具有199個(gè)氨基酸的長度和22.8kDa的質(zhì)量的融合蛋白，其中源自VEGF的七肽(SEQ ID NO: 17)連接于序列TRAIL95-281的N末端作為效應(yīng)子肽。在效應(yīng)子肽和TRAIL序列之間插入了柔性甘氨酸空間連接子(SEQ ID N0:28)。該融合蛋白的結(jié) 構(gòu)顯示于圖1，其氨基酸序列和包含針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的DNA編碼序列分別顯示于序列表中的SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:32。上述結(jié)構(gòu)的氨基酸序列SEQ ID N0:2用作模板以產(chǎn)生其編碼DNA序列SEQ IDNO: 32。產(chǎn)生了包含DNA編碼序列的質(zhì)粒，含有允許表達(dá)His標(biāo)簽和被凝血酶識別的位點(diǎn)的序列。根據(jù)上述一般性程序進(jìn)行融合蛋白的過表達(dá)。根據(jù)一般程序A進(jìn)行過表達(dá)，使用大腸桿菌BL21(DE3)菌株,其來自Novagen。根據(jù)上述一般程序通過電泳分離蛋白。實(shí)施例3:SEQ ID NO:3的融合蛋白SEQ ID NO: 3的蛋白是具有230個(gè)氨基酸的長度和26.3kDa的質(zhì)量的融合蛋白，其中源自VEGF的七肽(SEQ ID NO: 17)連接于序列TRAIL121-281的N末端、腫瘤抑素的片段I和II (分別為SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO: 19)連接于序列TRAIL121-281的C末端作為效應(yīng)子肽。在連接于序列TRAIL的N末端的效應(yīng)子肽和TRAIL序列之間插入了柔性甘氨酸空間連接子(SEQ ID N0:28)。在連接于序列TRAIL的C末端的效應(yīng)子肽和TRAIL序列之間插入了由3個(gè)甘氨酸殘基Gly Gly Gly組成的空間連接子,和被金屬蛋白酶MMP識別的切割位點(diǎn)序列(SEQ ID N0:24)和被尿激酶uPA識別的切割位點(diǎn)序列(SEQ ID N0:25)，因此效應(yīng)子肽在腫瘤環(huán)境中將進(jìn)行切割。該融合蛋白的結(jié)構(gòu)顯示于圖1，其氨基酸序列和包含針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的DNA編碼序列分別顯示于序列表中的SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:33。
上述結(jié)構(gòu)的氨基酸序列SEQ ID N0:3用作模板以產(chǎn)生其編碼DNA序列SEQ IDNO: 33。產(chǎn)生了包含DNA編碼序列的質(zhì)粒，含有允許表達(dá)His標(biāo)簽和被凝血酶識別的位點(diǎn)的序列。根據(jù)上述一般性程序進(jìn)行融合蛋白的過表達(dá)。根據(jù)一般程序B進(jìn)行過表達(dá)，使用大腸桿菌BL21(DE3)菌株,其來自Novagen。根據(jù)上述一般程序通過電泳分離蛋白。實(shí)施例4:SEQ ID NO:4的融合蛋白SEQ ID N0:4的蛋白是具有187個(gè)氨基酸的長度和21.4kDa的質(zhì)量的融合蛋白，其中源自VEGF的七肽(SEQ ID NO: 17)的2個(gè)序列連接于序列TRAIL121-281的N末端作為效應(yīng)子肽。在效應(yīng)子肽的2個(gè)序列之間插入了被金屬蛋白酶MMP識別的切割位點(diǎn)的序列(SEQ ID NO:24)，因此效應(yīng)子肽在腫瘤環(huán)境中將進(jìn)行切割。在MMP切割位點(diǎn)的序列與效應(yīng)子蛋白的序列之間插入了單一的谷氨酸殘基E。在效應(yīng)子肽(SEQ ID NO: 17)與TRAIL序列之間插入了柔性空間甘氨酸連接子(SEQ ID NO:28)。該融合蛋白的結(jié)構(gòu)顯示于圖1，其氨基酸序列和包含針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的DNA編碼序列分別顯示于序列表中的SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:34。上述結(jié)構(gòu)的氨基酸序列SEQ ID N0:4用作模板以產(chǎn)生其編碼DNA序列SEQ IDNO: 34。產(chǎn)生了兩種形式的包含DNA編碼序列的質(zhì)粒，一種允許表達(dá)His標(biāo)簽和被凝血酶識別的位點(diǎn)，另一種不含任何標(biāo)簽，根據(jù)上述一般性程序進(jìn)行融合蛋白的過表達(dá)。根據(jù)一般程序B進(jìn)行過表達(dá),使用來自Stratagene的大腸桿菌BL21DE3pLysSRIL菌株和來自Novagen的TUner(DE3)菌株。根據(jù)上述一般程序通過電泳分離蛋白。實(shí)施例5:SEQ ID NO:5的融合蛋白SEQ ID NO: 5的蛋白是具有187個(gè)氨基酸的長度和21.8kDa的質(zhì)量的融合蛋白，其中源自VEGF的七肽(SEQ ID NO: 17)的2個(gè)序列連接于序列TRAIL121-281的N末端作為效應(yīng)子肽。在效應(yīng)子肽的2個(gè)序列之間插入了被尿激酶uPA識別的切割位點(diǎn)序列(SEQ IDN0:25)和被金屬蛋白酶MMP識別的切割位點(diǎn)的序列(SEQ ID N0:24),因此效應(yīng)子肽在腫瘤環(huán)境中將進(jìn)行切割。在MMP切割位點(diǎn)的序列與效應(yīng)子蛋白的序列之間插入了單一的谷氨酸殘基E。另外在TRAIL的N末端連接了 2個(gè)甘氨酸殘基。該融合蛋白的結(jié)構(gòu)顯示于圖1，其氨基酸序列和包含針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的DNA編碼序列分別顯示于序列表中的SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:35。上述結(jié)構(gòu)的氨基酸序列SEQ ID N0:5用作模板以產(chǎn)生其編碼DNA序列SEQ IDNO: 35。產(chǎn)生了兩種形式的包含DNA編碼序列的質(zhì)粒，一種允許表達(dá)His標(biāo)簽和被凝血酶識別的位點(diǎn)，另一種不含任何標(biāo)簽，根據(jù)上述一般性程序進(jìn)行融合蛋白的過表達(dá)。根據(jù)一般程序A進(jìn)行過表達(dá),使用來自Novagen的大腸桿菌Tuner (DE3)菌株。根據(jù)上述一般程序通過電泳分離蛋白。實(shí)施例6:SEQ ID NO:6的融合蛋白SEQ ID NO:6的蛋白是具有222個(gè)氨基酸的長度和25.3kDa的質(zhì)量的融合蛋白，其中源自VEGF的七肽(SEQ ID NO: 17)的2個(gè)序列連接于序列TRAIL95-281的N末端作為效應(yīng)子肽。在效應(yīng)子肽的2個(gè)序列之間，蛋白包含被uPA識別的切割位點(diǎn)序列(SEQ ID NO: 25 )和被MMP識別的切割位點(diǎn)的序列(SEQ ID N0:55),因此效應(yīng)子肽在腫瘤環(huán)境中將進(jìn)行切割。在效應(yīng)子肽(SEQ ID N O: 17)和TRAIL序列之間插入了半胱氨酸柔性空間連接子(SEQ IDN0:26)。
該融合蛋白的結(jié)構(gòu)顯示于圖1，其氨基酸序列和包含針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的DNA編碼序列分別顯示于序列表中的SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:36。上述結(jié)構(gòu)的氨基酸序列SEQ ID N0:6用作模板以產(chǎn)生其編碼DNA序列SEQ IDNO: 36。產(chǎn)生了包含DNA編碼序列的質(zhì)粒，不含允許表達(dá)Hi s標(biāo)簽和被凝血酶識別的位點(diǎn)的序列。根據(jù)上述一般性程序進(jìn)行融合蛋白的過表達(dá)。根據(jù)一般程序A進(jìn)行過表達(dá)，使用來自Novagen的大腸桿菌Tuner (DE3)菌株。根據(jù)上述一般程序通過電泳分離蛋白。實(shí)施例7:SEQ ID NO:7的融合蛋白SEQ ID NO: 7的蛋白是具有168個(gè)氨基酸的長度和19.4kDa的質(zhì)量的融合蛋白，其中CD13的配體序列(SEQ ID NO: 20)連接于序列TRAIL119-281的N末端作為效應(yīng)子肽。該融合蛋白的結(jié)構(gòu)顯示于圖2，其氨基酸序列和包含針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的DNA編碼序列分別顯示于序列表中的SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:37。上述結(jié)構(gòu)的氨基酸序列SEQ ID N0:7用作模板以產(chǎn)生其編碼DNA序列SEQ IDNO: 37。產(chǎn)生了兩種形式的包含DNA編碼序列的質(zhì)粒，一種允許表達(dá)His標(biāo)簽和被凝血酶識別的位點(diǎn)的序列，另一種不含任何標(biāo)簽。根據(jù)上述一般性程序進(jìn)行融合蛋白的過表達(dá)。根據(jù)一般程序A進(jìn)行過表達(dá),使用來自Novagen的大腸桿菌Tuner (DE3)菌株。根據(jù)上述一般程序通過電泳分離蛋白。實(shí)施例8:SEQ ID NO:8的融合蛋白SEQ ID NO:8的蛋白是具有201個(gè)氨基酸的長度和23.2kDa的質(zhì)量的融合蛋白，其中CD13的配體序列(SEQ ID NO: 21)連接于序列TRAIL95-的N末端作為效應(yīng)子肽。在TRAIL序列和效應(yīng)子肽序列之間，蛋白包含柔性甘氨酸-絲氨酸連接子序列(SEQ ID N0:30)。該融合蛋白的結(jié)構(gòu) 顯示于圖2，其氨基酸序列和包含針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的DNA編碼序列分別顯示于序列表中的SEQ ID N0:8和SEQ ID N0:38。上述結(jié)構(gòu)的氨基酸序列SEQ ID N0:8用作模板以產(chǎn)生其編碼DNA序列SEQ IDNO: 38。產(chǎn)生了包含DNA編碼序列的質(zhì)粒，具有允許表達(dá)His標(biāo)簽和被凝血酶識別的位點(diǎn)的序列，根據(jù)上述一般性程序進(jìn)行融合蛋白的過表達(dá)。根據(jù)一般程序A進(jìn)行過表達(dá)，使用來自Novagen的大腸桿菌Tuner (DE3)菌株。根據(jù)上述一般程序通過電泳分離蛋白。實(shí)施例9:SEQ ID NO:9的融合蛋白SEQ ID N0:9的蛋白是具有192個(gè)氨基酸的長度和22.1kDa的質(zhì)量的融合蛋白，其中TOGF片段的序列(SEQ ID N0:22)連接于序列TRAIL119-281的N末端作為效應(yīng)子肽。在效應(yīng)子肽與TRAIL序列之間，蛋白包含被尿激酶uPA識別的切割位點(diǎn)序列(SEQ ID N0:25)和被金屬蛋白酶MMP識別的切割位點(diǎn)的序列(SEQ ID N0:24),因此效應(yīng)子肽在腫瘤環(huán)境中將進(jìn)行切割。該融合蛋白的結(jié)構(gòu)顯示于圖2，其氨基酸序列和包含針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的DNA編碼序列分別顯示于序列表中的SEQ ID N0:9和SEQ ID N0:39。上述結(jié)構(gòu)的氨基酸序列SEQ ID N0:9用作模板以產(chǎn)生其編碼DNA序列SEQ IDNO: 39。產(chǎn)生了兩種形式的包含DNA編碼序列的質(zhì)粒，一種允許表達(dá)His標(biāo)簽和被凝血酶識別的位點(diǎn)，另一種不含任何標(biāo)簽，根據(jù)上述一般性程序進(jìn)行融合蛋白的過表達(dá)。根據(jù)一般程序A進(jìn)行過表達(dá),使用來自Novagen的大腸桿菌Rosetta (DE3)菌株。根據(jù)上述一般程序通過電泳分離蛋白。
實(shí)施例10:SEQ ID NO: 10的融合蛋白SEQ ID NO: 10的蛋白是具有216個(gè)氨基酸的長度和24.9kDa的質(zhì)量的融合蛋白，其中TOGF片段的序列(SEQ ID NO: 22)連接于序列TRAIL95-281的N末端作為效應(yīng)子肽。在效應(yīng)子肽與TRAIL序列之間，蛋白包含被uPA識別的切割位點(diǎn)序列(SEQ ID N0:25)和被MMP識別的切割位點(diǎn)的序列(SEQ ID N0:24),因此效應(yīng)子肽在腫瘤環(huán)境中將進(jìn)行切割。該融合蛋白的結(jié)構(gòu)顯示于圖2，其氨基酸序列和包含針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的DNA編碼序列分別顯示于序列表中的SEQ ID NO: 10和SEQ ID N0:40。上述結(jié)構(gòu)的氨基酸序列SEQ ID NO: 10用作模板以產(chǎn)生其編碼DNA序列SEQ IDNO: 40。產(chǎn)生了包含DNA編碼序列的質(zhì)粒，具有允許表達(dá)His標(biāo)簽和被凝血酶識別的位點(diǎn)的序列，根據(jù)上述一般性程序進(jìn)行融合蛋白的過表達(dá)。根據(jù)一般程序A進(jìn)行過表達(dá)，使用來自Novagen的大腸桿菌BL21 (DE3)和Tuner (DE3) pLysS菌株。根據(jù)上述一般程序通過電泳分離蛋白。實(shí)施例11:SEQ ID NO: 11的融合蛋白SEQ ID NO: 11的蛋白是具有226個(gè)氨基酸的長度和25.7kDa的質(zhì)量的融合蛋白，其中TOGF片段的序列(SEQ ID NO: 22)連接于序列TRAIL95-281的N末端作為效應(yīng)子肽。在效應(yīng)子肽與TRAIL序列之間，蛋白包含被尿激酶uPA識別的切割位點(diǎn)序列(SEQ ID N0:25)和被金屬蛋白酶MMP識別的切割位點(diǎn)的序列(SEQ ID N0:24),因此效應(yīng)子肽在腫瘤環(huán)境中將進(jìn)行切割。在TRAIL序列和被金屬蛋白酶MMP識別的切割位點(diǎn)序列之間，蛋白還包含柔性甘氨酸-半胱氨酸-丙氨酸連接子(SEQ ID NO:27)。該融合蛋白的結(jié)構(gòu)顯示于圖2，其氨基酸序列和包含針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的DNA編碼序列分別顯示于序列表中的SEQ ID NO: 11和SEQ ID N0:41。上述結(jié)構(gòu)的氨基酸 序列SEQ ID NO: 11用作模板以產(chǎn)生其編碼DNA序列SEQ IDN0:41。產(chǎn)生了包含DNA編碼序列的質(zhì)粒，不具有允許表達(dá)His標(biāo)簽和被凝血酶識別的位點(diǎn)的序列，根據(jù)上述一般性程序進(jìn)行融合蛋白的過表達(dá)。根據(jù)一般程序A進(jìn)行過表達(dá)，使用來自Novagen的大腸桿菌BL21 (DE3)和Tuner (DE3) pLysS菌株。根據(jù)上述一般程序通過電泳分離蛋白。實(shí)施例12:SEQ ID NO: 12的融合蛋白SEQ ID NO: 12的蛋白是具有217個(gè)氨基酸的長度和25kDa的質(zhì)量的融合蛋白，其中腫瘤抑素的片段I和II (分別為SEQ ID NO: 18和19)連接于序列TRAIL121-281的N末端作為效應(yīng)子肽。在效應(yīng)子肽與TRAIL序列之間，蛋白包含被尿激酶uPA識別的切割位點(diǎn)序列(SEQ ID N0:25)和被金屬蛋白酶MMP識別的切割位點(diǎn)的序列(SEQ ID N0:24)，因此效應(yīng)子肽在腫瘤環(huán)境中將進(jìn)行切割。在TRAIL序列和被金屬蛋白酶MMP識別的切割位點(diǎn)序列之間，蛋白還包含由3個(gè)甘氨酸殘基Gly Gly Gly組成的柔性連接子。該融合蛋白的結(jié)構(gòu)顯示于圖3，其氨基酸序列和包含針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的DNA編碼序列分別顯示于序列表中的SEQ ID NO: 12和SEQ ID N0:42。上述結(jié)構(gòu)的氨基酸序列SEQ ID NO: 12用作模板以產(chǎn)生其編碼DNA序列SEQ IDNO: 42。產(chǎn)生了包含DNA編碼序列的質(zhì)粒，具有允許表達(dá)His標(biāo)簽和被凝血酶識別的位點(diǎn)的序列，根據(jù)上述一般性程序進(jìn)行融合蛋白的過表達(dá)。根據(jù)一般程序A進(jìn)行過表達(dá)，使用來自Novagen的大腸桿菌BL21 (DE3)和Tuner (DE3) pLysS菌株。根據(jù)上述一般程序通過電泳分離蛋白。實(shí)施例13:SEQ ID NO: 13的融合蛋白SEQ ID NO: 13的蛋白是具有220個(gè)氨基酸的長度和25.1kDa的質(zhì)量的融合蛋白，其中腫瘤抑素的片段II (SEQ ID N0:19)連接于序列TRAIL121-281的N末端、腫瘤抑素的片段I (SEQ ID勵(lì):18)連接于序列了狀11^121-281的(:末端作為效應(yīng)子肽。在效應(yīng)子肽與TRAIL序列之間，蛋白包含被尿激酶uPA識別的切割位點(diǎn)序列(SEQ ID N0:25)和被金屬蛋白酶MMP識別的切割位點(diǎn)的序列(SEQ ID N0:24),因此效應(yīng)子肽在腫瘤環(huán)境中將進(jìn)行切割。在TRAIL序列和被金屬蛋白酶MMP識別的切割位點(diǎn)序列之間，蛋白包含3個(gè)甘氨酸殘基GlyGly Gly，在TRAIL序列的C末端與腫瘤抑素的片段II之間包含由3個(gè)甘氨酸殘基Gly GlyGly組成的柔性連接子。該融合蛋白的結(jié)構(gòu)顯示于圖3，其氨基酸序列和包含針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的DNA編碼序列分別顯示于序列表中的SEQ ID NO: 13和SEQ ID N0:43。上述結(jié)構(gòu)的氨基酸序列SEQ ID NO: 13用作模板以產(chǎn)生其編碼DNA序列SEQ IDNO: 43。產(chǎn)生了包含DNA編碼序列的質(zhì)粒，具有允許表達(dá)His標(biāo)簽和被凝血酶識別的位點(diǎn)的序列，根據(jù)上述一般性程序進(jìn)行融合蛋白的過表達(dá)。根據(jù)一般程序B進(jìn)行過表達(dá)，使用來自Novagen的大腸桿菌B.21 (DE3)菌株和來自Stratagene的BL21DE3pLysSRIL菌株。根據(jù)上述一般程序通過電泳分離蛋白。實(shí)施例14:SEQ ID NO: 14的融合蛋白SEQ ID NO: 14的蛋白是具有181個(gè)氨基酸的長度和21kDa的質(zhì)量的融合蛋白，其中EGF的片段(SEQ ID NO: 23)連接于序列TRAIL120-281的N末端作為效應(yīng)子肽。在效應(yīng)子肽與TRAIL結(jié)構(gòu)域的N末端之間，蛋白包含被尿激酶uPA識別的切割位點(diǎn)序列(SEQ IDN0:25)和被金屬蛋白 酶MMP識別的切割位點(diǎn)的序列(SEQ ID N0:56),因此效應(yīng)子肽在腫瘤環(huán)境中將進(jìn)行切割。該融合蛋白的結(jié)構(gòu)顯示于圖3，其氨基酸序列和包含針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的DNA編碼序列分別顯示于序列表中的SEQ ID NO: 14和SEQ ID N0:44。上述結(jié)構(gòu)的氨基酸序列SEQ ID NO: 14用作模板以產(chǎn)生其編碼DNA序列SEQ IDNO: 44。產(chǎn)生了包含DNA編碼序列的質(zhì)粒，具有允許表達(dá)His標(biāo)簽和被凝血酶識別的位點(diǎn)的序列，根據(jù)上述一般性程序進(jìn)行融合蛋白的過表達(dá)。根據(jù)一般程序B進(jìn)行過表達(dá)，使用來自Novagen的大腸桿菌BL21 (DE3)菌株和來自Stratagene的BL21DE3pLysSRIL菌株。根據(jù)上述一般程序通過電泳分離蛋白。實(shí)施例15:SEQ ID NO: 15的融合蛋白SEQ ID NO: 15的蛋白是具有217個(gè)氨基酸的長度和24.4kDa的質(zhì)量的融合蛋白，其中EGF的片段(SEQ ID NO: 23)連接于序列TRAIL95-281的N末端作為效應(yīng)子肽。在效應(yīng)子肽與TRAIL結(jié)構(gòu)域的N末端之間，蛋白包含被尿激酶uPA識別的切割位點(diǎn)序列(SEQ IDN0:25)和被金屬蛋白酶MMP識別的切割位點(diǎn)的序列(SEQ ID N0:24),因此效應(yīng)子肽在腫瘤環(huán)境中將進(jìn)行切割。在被金屬蛋白酶MMP識別的切割位點(diǎn)序列和TRAIL序列之間，蛋白包含單一脯氨酸殘基，后跟柔性甘氨酸-半胱氨酸-丙氨酸連接子(SEQ ID N0:26)。該融合蛋白的結(jié)構(gòu)顯示于圖3，其氨基酸序列和包含針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的DNA編碼序列分別顯示于序列表中的SEQ ID NO: 15和SEQ ID N0:45。
上述結(jié)構(gòu)的氨基酸序列SEQ ID NO: 15用作模板以產(chǎn)生其編碼DNA序列SEQ IDNO: 45。產(chǎn)生了包含DNA編碼序列的質(zhì)粒，具有允許表達(dá)His標(biāo)簽和被凝血酶識別的位點(diǎn)的序列，根據(jù)上述一般性程序進(jìn)行融合蛋白的過表達(dá)。根據(jù)一般程序B進(jìn)行過表達(dá)，使用來自Novagen的大腸桿菌BL21 (DE3)菌株。根據(jù)上述一般程序通過電泳分離蛋白。實(shí)施例16:SEQ ID NO:46的融合蛋白SEQ ID NO:46的蛋白是具有211個(gè)氨基酸的長度和24.4kDa的質(zhì)量的融合蛋白，其中彼此連接的源自VEGF的2個(gè)七肽(SEQ ID NO: 17)連接于序列TRAIL95-281的N末端作為效應(yīng)子肽。在效應(yīng)子肽之間，蛋白包含被尿激酶uPA識別的切割位點(diǎn)序列(SEQ IDN0:25)和被金屬蛋白酶MMP識別的切割位點(diǎn)的序列(SEQ ID N0:55),因此效應(yīng)子肽在腫瘤環(huán)境中將進(jìn)行切割。

該融合蛋白的結(jié)構(gòu)顯示于圖9，其氨基酸序列和包含針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的DNA編碼序列分別顯示于序列表中的SEQ ID N0:46和SEQ ID N0:50。上述結(jié)構(gòu)的氨基酸序列SEQ ID N0:46用作模板以產(chǎn)生其編碼DNA序列SEQ IDNO: 50。產(chǎn)生了包含DNA編碼序列的質(zhì)粒，具有允許表達(dá)His標(biāo)簽和被凝血酶識別的位點(diǎn)的序列，根據(jù)上述一般性程序進(jìn)行融合蛋白的過表達(dá)。根據(jù)一般程序B進(jìn)行過表達(dá)，使用來自Novagen的大腸桿菌BL21 (DE3)菌株。根據(jù)上述一般程序通過電泳分離蛋白。實(shí)施例17:SEQ ID NO:47的融合蛋白SEQ ID NO:47的蛋白是具有200個(gè)氨基酸的長度和22.7kDa的質(zhì)量的融合蛋白，其中彼此連接的源自VEGF的2個(gè)七肽(SEQ ID NO: 17)連接于序列TRAIL120-281的N末端作為效應(yīng)子肽。在效應(yīng)子肽之間，蛋白包含被尿激酶uPA識別的切割位點(diǎn)序列(SEQ IDN0:25)和被金屬蛋白酶MMP識別的切割位點(diǎn)的序列(SEQ ID N0:55),因此效應(yīng)子肽在腫瘤環(huán)境中將進(jìn)行切割。在效應(yīng)子蛋白和TRAIL結(jié)構(gòu)域之間，蛋白包含促進(jìn)三聚體形成的柔性連接子(SEQ ID NO:26)和柔性甘氨酸-絲氨酸連接子(SEQ ID NO:54)。該融合蛋白的結(jié)構(gòu)顯示于圖9，其氨基酸序列和包含針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的DNA編碼序列分別顯示于序列表中的SEQ ID N0:47和SEQ ID N0:51。上述結(jié)構(gòu)的氨基酸序列SEQ ID N0:47用作模板以產(chǎn)生其編碼DNA序列SEQ IDNO: 51。產(chǎn)生了包含DNA編碼序列的質(zhì)粒，具有允許表達(dá)Hi s標(biāo)簽和被凝血酶識別的位點(diǎn)的序列，根據(jù)上述一般性程序進(jìn)行融合蛋白的過表達(dá)。根據(jù)一般程序B進(jìn)行過表達(dá)，使用來自Novagen的大腸桿菌BL21 (DE3)菌株。根據(jù)上述一般程序通過電泳分離蛋白。實(shí)施例18:SEQ ID NO:48的融合蛋白SEQ ID NO:48的蛋白是具有192個(gè)氨基酸的長度和21.9kDa的質(zhì)量的融合蛋白，其中彼此連接的源自VEGF的2個(gè)七肽(SEQ ID NO: 17)連接于序列TRAIL120-281的N末端作為效應(yīng)子肽。在效應(yīng)子肽之間，蛋白包含被尿激酶uPA識別的切割位點(diǎn)序列(SEQ IDNO: 25)，因此效應(yīng)子肽在腫瘤環(huán)境中將進(jìn)行切割。在效應(yīng)子蛋白和TRAIL結(jié)構(gòu)域之間，蛋白包含促進(jìn)三聚體形成的柔性連接子(SEQ ID NO:26)和柔性甘氨酸-絲氨酸連接子(SEQ IDN0:54)。該融合蛋白的結(jié)構(gòu)顯示于圖9，其氨基酸序列和包含針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的DNA編碼序列分別顯示于序列表中的SEQ ID N0:48和SEQ ID N0:52。上述結(jié)構(gòu)的氨基酸序列SEQ ID N0:48用作模板以產(chǎn)生其編碼DNA序列SEQ IDNO: 52。產(chǎn)生了包含DNA編碼序列的質(zhì)粒，具有允許表達(dá)His標(biāo)簽和被凝血酶識別的位點(diǎn)的序列，根據(jù)上述一般性程序進(jìn)行融合蛋白的過表達(dá)。根據(jù)一般程序B進(jìn)行過表達(dá)，使用來自Novagen的大腸桿菌BL21 (DE3)菌株。根據(jù)上述一般程序通過電泳分離蛋白。實(shí)施例19:SEQ ID NO:49的融合蛋白SEQ ID NO:49的蛋白是具有206個(gè)氨基酸的長度和23.3kDa的質(zhì)量的融合蛋白，其中TOGF片段(SEQ ID N0:22)連接于序列TRAIL120-281的N末端作為效應(yīng)子肽。在效應(yīng)子肽和TRAIL序列之間，蛋白包含被尿激酶uPA識別的切割位點(diǎn)序列(SEQ ID N0:25)和被金屬蛋白酶MMP識別的切割位點(diǎn)的序列(SEQ ID N0:55),因此效應(yīng)子肽在腫瘤環(huán)境中將進(jìn)行切割。在TRAIL序列和被金屬蛋白酶MMP識別的切割位點(diǎn)序列之間，蛋白還包含促進(jìn)三聚體形成的柔性甘氨酸-半胱氨酸-丙氨酸連接子(SEQ ID NO:26)和柔性甘氨酸-絲氨酸連接子(SEQ ID NO: 54)。該融合蛋白的結(jié)構(gòu)顯示于圖9，其氨基酸序列和包含針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的DNA編碼序列分別顯示于序列表中的SEQ ID N0:49和SEQ ID N0:53。上述結(jié)構(gòu)的氨基酸序列SEQ ID N0:49用作模板以產(chǎn)生其編碼DNA序列SEQ IDNO: 53。產(chǎn)生了包含DNA編碼序列的質(zhì)粒，不具有允許表達(dá)His標(biāo)簽和被凝血酶識別的位點(diǎn)的序列，根據(jù)上述一般性程序進(jìn)行融合蛋白的過表達(dá)。根據(jù)一般程序A進(jìn)行過表達(dá)，使用來自Novagen的大腸桿菌BL21 (DE3)和Tuner (DE3) pLysS菌株。根據(jù)上述一般程序通過電泳分離蛋白。實(shí)施例20:融合蛋白的抗腫瘤活性的測定在體外在腫瘤細(xì)胞系中在細(xì)胞毒性測定中以及在體內(nèi)在小鼠中進(jìn)行了融合蛋白的抗腫瘤活性的測定。為了比較目的，使用了 rhTRAILl 14-281蛋白和安慰劑。1.圓二色性(circular dichr`oism)測定-獲得的蛋白的二級結(jié)構(gòu)含量的測定通過Ex.1，Ex.4，Ex.5，Ex.9和Ex.14的圓二色性(CD)測定融合蛋白的制備物的質(zhì)量(就它們的結(jié)構(gòu)而言)。圓二色性用于測定蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和構(gòu)象。CD方法使用蛋白結(jié)構(gòu)的光學(xué)活性，表現(xiàn)為使光偏振平面旋轉(zhuǎn)和橢圓偏振的出現(xiàn)。遠(yuǎn)紫外(UV)中的蛋白的CD光譜提供了關(guān)于主要多肽鏈的構(gòu)象的精確數(shù)據(jù)。透近待分析的蛋白的樣品配制于由50mM Tris-HCl pH8, O, IOOmM NaCl, 10%甘油，0.1mM ZnCl2, 80mM蔗糖，5mM DTT, pH7.4組成的緩沖液(或者，對于上文所述過表達(dá)的但不含His標(biāo)簽并在SP瓊脂糖上純化的蛋白而言，是5mM NaH2PO4, 95mM Na2HPO4, 200mMNaCl, 5mM谷胱甘肽，O, ImM ZnCl2, 10%甘油，80mM蔗糖，pH8.0,所述蛋白在表5的結(jié)果中以星號*標(biāo)示)中之后，在具有12kD截留值的透析袋(Sigma-Aldrich)中透析。針對相對于蛋白制劑100倍過量(v/v)的緩沖液進(jìn)行透析，同時(shí)攪拌，在4°C持續(xù)數(shù)個(gè)小時(shí)。透析完成之后，將每個(gè)制劑離心(25000rpm, IOmin, 4°C )，收集適當(dāng)?shù)纳锨逡?。通過Bradford法測定由此獲得的樣品中的蛋白濃度(一式三份的平均值)。使用Bradford方法測定蛋白質(zhì)濃度通過將17.5mg Coomassie G-250 溶解于乙醇(4.8%v/v)憐酸(V) (5.95%v/v)和水的混合物中來制備蛋白濃度測定試劑。為了測定蛋白濃度，將1-1Oml樣品加入至800mlBradford試劑中。測定參考樣品，其中含有Bradford試劑和適當(dāng)體積的其中溶解了蛋白的緩沖液。在室溫溫育樣品至少5分鐘之后，在595nm的波長在分光光度計(jì)Cary300上讀取吸光度。根據(jù)就1-10 μ g/ml范圍內(nèi)10個(gè)濃度的BSA制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算蛋白質(zhì)濃度?？紤]了樣品測定制備過程中的稀釋度之后，估計(jì)起始蛋白質(zhì)的濃度。圓二色件測定在Jasco J-710分光偏振計(jì)中，在具有0.2mm或Imm光程的石英杯中進(jìn)行濃度范圍為0.1-2.7mg/ml的蛋白的圓二色性測定。在71/min的氮?dú)饬飨逻M(jìn)行該測定，這允許在195至250nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行測定。測量參數(shù):光譜分辨率-1nm ;光束的半寬Inm;靈敏性20mdeg, 一個(gè)波長的平均時(shí)間-8s，掃描速度10nm/min，取三次測量的平均值。結(jié)果顯示為3次測量的平均值。rhTRAILl 14-281和Ex.1，Ex.4，Ex.5，Ex.9和Ex.14的蛋白的圓二色性光譜顯示于圖4。二級結(jié)構(gòu)含暈的測定使用CDPro軟件在193_250nm范圍內(nèi)對獲得的光譜進(jìn)行數(shù)值分析。忽略掉光電倍增管中的電壓超過700V的點(diǎn)，因?yàn)樵摬ㄩL范圍內(nèi)的信噪比太低。獲得的數(shù)據(jù)用于計(jì)算所分析的蛋白中的特定二級結(jié)構(gòu)含量，使用CDPio軟件(表I)。表1:所分析的蛋白中的二級結(jié)構(gòu)的含量
權(quán)利要求
1.融合蛋白，其包含: -結(jié)構(gòu)域(a)，其包含:可溶性hTRAIL蛋白序列的功能片段，該片段起始于不低于hTRAIL95的位置處的氨基酸；或具有至少70%序列同一性的所述功能片段的同源物；和 -結(jié)構(gòu)域(b)，其構(gòu)成抗血管生成效應(yīng)子肽的序列， 其中結(jié)構(gòu)域(b)的序列連接于結(jié)構(gòu)域(a)的C末端和/或N末端；并且其中所述效應(yīng)子肽不選自I丐網(wǎng)蛋白、腫瘤抑素183-230、激肽原D5、血管抑制素、kininostatin和Canstatin0
2.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中結(jié)構(gòu)域(a)包含可溶性hTRAIL(SEQ ID N0:16)蛋白序列的片段，起始于hTRAIL95至hTRAIL121的氨基酸，含端點(diǎn)，結(jié)束于氨基酸hTRAIL281。
3.權(quán)利要求1或2的融合蛋白，其中結(jié)構(gòu)域(a)選自hTRAIL95-281,hTRAILl 19-281, hTRAIL120-281和 hTRAIL121_281。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的融合蛋白，其中結(jié)構(gòu)域(b)選自 -選自VEGF、PDGF和EGF的生長因子受體的抑制劑； -腫瘤抑素的片段；和 -氨基肽酶N (⑶13)的抑制劑。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的融合蛋白，其中由生長因子的抑制劑組組成的結(jié)構(gòu)域(b)選自 VEGF、PDGF 和 EGF，分別是 SEQ ID NO: 17, SEQ ID N0:22 和 SEQ ID N0:23。
6.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的融合蛋白，其中由腫瘤抑素或其片段組成的結(jié)構(gòu)域(b)是SEQID NO: 18和SEQ ID NO: 19，分別代表腫瘤抑素片段I和腫瘤抑素片段II。
7.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的融合蛋白，其中由氨基肽酶N(CD13)的抑制劑組成的結(jié)構(gòu)域(b)是 SEQ ID NO:20 和 SEQ ID NO:21。
8.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的融合蛋白，其中在結(jié)構(gòu)域(a)與結(jié)構(gòu)域(b)之間，融合蛋白包含結(jié)構(gòu)域(c )，結(jié)構(gòu)域(c )包含蛋白酶切割位點(diǎn)，其選自被金屬蛋白酶MMP識別的序列、被尿激酶uPA識別的序列，及其組合。
9.權(quán)利要求8的融合蛋白，其中被金屬蛋白酶MMP識別的序列是SEQID NO:24, SEQID N0:55或SEQ ID NO:56，被尿激酶uPA識別的序列是SEQ ID N0:25。
10.權(quán)利要求8或9的融合蛋白，其中結(jié)構(gòu)域(c)是彼此相鄰的被金屬蛋白酶MMP識別的序列和被尿激酶uPA識別的序列的組合。
11.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的融合蛋白，其中在結(jié)構(gòu)域(a)、(b)、(c)和/或(d)之間，蛋白包含另外的甘氨酸，甘氨酸-絲氨酸或半胱氨酸柔性空間連接子或其組合。
12.權(quán)利要求11的融合蛋白，其中柔性空間連接子選自GG，E，GGGCAAACAAC(SEQ.N0.26)，GGCAAACAAC (SEQ.N0.27)，GGGGG (SEQ.N0.28)，GGGG (SEQ.N0.29)，GGG (SEQ.N0.30)和 GSG (SEQ.N0.54)。
13.權(quán)利要求1的融合蛋白，由對應(yīng)于選自SEQ.N0.1; SEQ.N0.2; SEQ.N0.3; SEQ.N0.4 ; SEQ.N0.5 ; SEQ.N0.6 ; SEQ.N0.7 ; SEQ.N0.8 ; SEQ.N0.9 ; SEQ.N0.10; SEQ.N0.11; SEQ.N0.12; SEQ.N0.13; SEQ.N0.14; SEQ.N0.15; SEQ.N0.46; SEQ.N0.47; SEQ.N0.48 和 SEQ.N0.49的序列的氨基酸序列組成。
14.權(quán)利要求1的融合蛋白，由對應(yīng)于選自SEQ.N0.1; SEQ.N0.2; SEQ.N0.3; SEQ.N0.4; SEQ.N0.5 ; SEQ.N0.6; SEQ.N0.9 ; SEQ.N0.10; SEQ.N0.11; SEQ.N0.14; SEQ.N0.15; SEQ.N0.46; N0.47; SEQ.N0.48和SEQ.N0.49的序列的氨基酸序列組成。
15.權(quán)利要求1的融合蛋白，由對應(yīng)于選自SEQ.N0.7和SEQ.N0.8的序列的氨基酸序列組成。
16.權(quán)利要求1的融合蛋白，由對應(yīng)于選自SEQ.N0.12和SEQ.N0.13的序列的氨基酸序列組成。
17.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的融合蛋白，其為重組蛋白。
18.編碼權(quán)利要求1-16任一項(xiàng)中定義的融合蛋白的多核苷酸序列。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的序列，其針對在大腸桿菌中的遺傳表達(dá)進(jìn)行了優(yōu)化。
20.權(quán)利要求19 的序列，其選自 SEQ.N0.31; SEQ.N0.32; SEQ.N0.33; SEQ.N0.34; SEQ.N0.35 ; SEQ.N0.36 ; SEQ.N0.37 ; SEQ.N0.38 ; SEQ.N0.39 ; SEQ.N0.40 ; SEQ.N0.41; SEQ.N0.42 ; SEQ.N0.43 ; SEQ.N0.44 ; SEQ.N0.45 ; SEQ.N0.50 ; SEQ.N0.51; SEQ.N0.52 和 SEQ.N0.53。
21.根據(jù)權(quán)利要求19 的序列，其選自 SEQ.N0.31; SEQ.N0.32; SEQ.N0.33; SEQ.N0.34 ; SEQ.N0.35 ; SEQ.N0.36 ; SEQ.N0.39 ; SEQ.N0.40 ; SEQ.N0.41; SEQ.N0.44 ; SEQ.N0.45; SEQ.N0.50; SEQ.N0.51; SEQ.N0.52 和 SEQ.N0.53。
22.根據(jù)權(quán)利要求19的序列，其選自N0.37和SEQ.N0.38。
23.根據(jù)權(quán)利要求19的序列，其選自SEQ.N0.42和SEQ.N0.43。
24.包含根據(jù)權(quán)利要求18-23任一項(xiàng)的多核苷酸序列的表達(dá)載體。
25.包含權(quán)利要求24中定義的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
26.權(quán)利要求25的宿主細(xì)胞，其為大腸桿菌細(xì)胞。
27.藥物組合物，其包含與任何藥學(xué)上可接受的載體組合的作為活性成分的權(quán)利要求1-17任一項(xiàng)中定義的融合蛋白。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的藥物組合物，其為用于胃腸外施用的形式。
29.權(quán)利要求1-17任一項(xiàng)中定義的融合蛋白用于治療哺乳動(dòng)物、包括人中的腫瘤疾病的用途。
30.用于治療有此需要哺乳動(dòng)物、包括人中的癌癥疾病的方法，包括向受試者施用抗腫瘤有效量的權(quán)利要求27或28定義的融合蛋白。
全文摘要
融合蛋白，其包含結(jié)構(gòu)域(a)，其為hTRAIL蛋白的序列的功能片段，該片段起始于不低于hTRAIL95的位置處的氨基酸；或具有至少70%序列同一性的所述功能片段的同源物；和結(jié)構(gòu)域(b)，其為抗血管生成效應(yīng)子肽的序列，其中結(jié)構(gòu)域(b)的序列連接于結(jié)構(gòu)域(a)的C末端或N末端。所述融合蛋白可用于治療癌癥疾病。
文檔編號C07K14/705GK103228788SQ201280003863
公開日2013年7月31日 申請日期2012年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月5日
發(fā)明者J·S·皮耶奇克蘭, S·D·帕夫拉克, B·M·澤雷克, P·K·魯茲加 申請人:阿達(dá)梅德公司