核心蛋白聚糖組合物及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及改進的核心蛋白聚糖組合物及其產(chǎn)生方法。在一個實施方案中，公開了通過下述來產(chǎn)生非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白的方法：提供表達非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白的宿主細胞；培養(yǎng)所述宿主細胞使得產(chǎn)生所述非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白；以及純化所述非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白。
【專利說明】核心蛋白聚糖組合物及其用途
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及改進的核心蛋白聚糖組合物及其產(chǎn)生方法。
[0002]發(fā)明背景
[0003]攜帶一條或多條糖胺聚糖(GAG)鏈的蛋白聚糖形成一個大的基因家族，該家族根據(jù)核心蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)可被分成五組。其中一組是小的富亮氨酸的蛋白聚糖家族，該家族由核心蛋白聚糖(DCN)、雙糖鏈蛋白聚糖、纖調(diào)蛋白聚糖和光蛋白聚糖組成。它們的特征在于40kDa的核心蛋白，該核心蛋白含有約12個氨基酸的富亮氨酸重復。DCN是該組的原型，并且也稱為PG-S2、PG40、硫酸蛋白皮膚素(proteodermatan sulphate)和DS-PGII。它含有一條共價連接到成熟核心蛋白的絲氨酸的皮膚素硫酸軟骨素GAG鏈，并被視為多功能的蛋白聚糖。
[0004]所提出的DCN功能包括但不限于調(diào)控膠原原纖維形成、通過與纖連蛋白和血小板反應(yīng)蛋白結(jié)合而維持組織完整性以及作為轉(zhuǎn)化生長因子β (TGF-β)的貯存器(reservoir)。DCN的后一功能通過其核心蛋白將細胞外環(huán)境中的生長因子與細胞表面上表達的受體相隔離而實現(xiàn)。
[0005]將核心蛋白聚糖輸注到實驗性嚙齒動物脊髓損傷處已表明可抑制疤痕形成并促進軸突生長。核心蛋白聚糖也已在實驗性鼠腫瘤模型中證實了具有抗腫瘤發(fā)生的特性并且能夠抑制多種腫瘤細胞系的生長。對于核心蛋白聚糖基因，存在多種已知的選擇性剪切轉(zhuǎn)錄變體。核心蛋白聚糖基因中的突變與先天性基質(zhì)層角膜營養(yǎng)不良相關(guān)。
[0006]本領(lǐng)域需要的是改進的產(chǎn)生核心蛋白聚糖的方法，尤其是針對治療性用途。
發(fā)明概要
[0007]本發(fā)明涉及改進的核心蛋白聚糖組合物及其產(chǎn)生方法。
[0008]因此，在一些實施方案中，本發(fā)明提供包含可操作地連接到編碼核心蛋白聚糖的序列的異源信號肽的融合蛋白。在一些實施方案中，信號序列為α -乳白蛋白信號序列。在一些實施方案中，α乳白蛋白序列為牛α-乳白蛋白信號序列。在一些實施方案中，編碼核心蛋白聚糖的序列編碼核心蛋白聚糖核心蛋白。在一些實施方案中，核心蛋白聚糖核心蛋白在成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白的第4位包含突變。在一些實施方案中，突變?yōu)榻z氨酸到丙氨酸突變。在一些實施方案中，核心蛋白聚糖核心蛋白在成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白的第4位不含糖胺聚糖分子的實質(zhì)性修飾。
[0009]在一些實施方案中,本發(fā)明提供編碼上述融合蛋白的載體。在一些實施方案中，載體包含編碼α-乳白蛋白信號序列的核酸序列，所述α-乳白蛋白信號序列可操作地連接到編碼核心蛋白聚糖核心蛋白的序列。
[0010]在一些實施方案中，本發(fā)明提供包含上述載體的宿主細胞。
[0011] 在一些實施方案中，本發(fā)明提供產(chǎn)生非糖胺聚糖化(non-gagylated)核心蛋白聚糖核心蛋白的方法，包括:提供表達非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白的宿主細胞；培養(yǎng)所述宿主細胞使得產(chǎn)生所述非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白；以及純化所述非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白。在一些實施方案中，非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白分泌到用于培養(yǎng)所述宿主細胞的培養(yǎng)基中。在一些實施方案中，純化包括將所述培養(yǎng)基與離子交換介質(zhì)接觸。在一些實施方案中，純化包括將所述培養(yǎng)基與羥基磷灰石介質(zhì)接觸。在一些實施方案中，純化包括將所述培養(yǎng)基與至少一種離子交換介質(zhì)和至少一種羥基磷灰石介質(zhì)按任何順序接觸。在一些實施方案中，純化包括:將所述培養(yǎng)基與陽離子交換介質(zhì)接觸；洗滌所述陽離子交換介質(zhì)；從所述陽離子交換介質(zhì)中洗脫第一含核心蛋白聚糖的洗出液；將所述第一含核心蛋白聚糖的洗出液與羥基磷灰石介質(zhì)接觸；洗滌所述羥基磷灰石介質(zhì)；從所述羥基磷灰石介質(zhì)中洗脫第二含核心蛋白聚糖的洗出液。在一些實施方案中，陽離子交換介質(zhì)為SP-瓊脂糖FF。在一些實施方案中，羥基磷灰石介質(zhì)為陶瓷羥基磷灰石I型。在一些實施方案中，方法還包括用離子交換膜或柱進一步純化所述第二含核心蛋白聚糖的洗出液。在一些實施方案中，離子交換膜為Q離子交換膜。在一些實施方案中，方法還包括病毒滅活步驟。在一些實施方案中，病毒滅活步驟包括用表面活性劑處理。在一些實施方案中，表面活性劑為Triton X-1OO0在一些實施方案中，方法還包括病毒過濾步驟。在一些實施方案中，方法還包括濃縮所述核心蛋白聚糖。在一些實施方案中，非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白通過所述宿主細胞以約大于1、5或IOpg/細胞/天的速率產(chǎn)生。
[0012]在一些實施方案中，本發(fā)明提供從含核心蛋白聚糖的培養(yǎng)基中純化核心蛋白聚糖的方法，包括:將所述含核心蛋白聚糖的培養(yǎng)基與陽離子交換介質(zhì)接觸；洗滌所述陽離子交換介質(zhì)；從所述陽離子交換介質(zhì)中洗脫第一含核心蛋白聚糖的洗出液；將所述第一含核心蛋白聚糖的洗出液與羥基磷灰石介質(zhì)接觸；洗滌所述羥基磷灰石介質(zhì)；從所述羥基磷灰石介質(zhì)中洗脫第二含核心蛋白聚糖的洗出液；用離子交換膜過濾所述第二含核心蛋白聚糖的洗出液以提供含核心蛋白聚糖的濾液；處理所述濾液以除去病毒；以及從所述濾液中濃縮核心蛋白聚糖。
[0013]在一些實施方案中，本發(fā)明提供包含純化的核心蛋白聚糖核心蛋白的組合物，所述核心蛋白聚糖核心蛋白在成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白的第4位包含突變,使得所述核心蛋白聚糖蛋白基本上非糖胺聚糖化，所述組合物在所述組合物中包含少于約IOOng殘余宿主細胞蛋白/mg核心蛋白聚糖核心蛋白和少于約20pg殘余宿主細胞DNA/mg核心蛋白聚糖核心蛋白。在一些實施方案中，組合物在所述組合物中包含少于約5ng殘余宿主細胞蛋白/mg核心蛋白聚糖核心蛋白和少于約5pg殘余宿主細胞DNA/mg核心蛋白聚糖核心蛋白。在一些實施方案中，將核心蛋白聚糖配制成水溶液。在一些實施方案中，水溶液包含PH為約6.5至約7.5的磷酸鹽緩沖溶液。
[0014]附圖簡述
[0015]圖1:核心蛋白聚糖表達基因序列(SEQ ID NO:8)。
[0016]圖2:核心蛋白聚糖表達蛋白質(zhì)序列(SEQ ID NO:4)。
[0017]圖3:將活細胞濃度的積分相對于在整個15天的生物反應(yīng)器運行中的核心蛋白聚糖產(chǎn)生作圖。各運行的回歸曲線的斜率對應(yīng)于以皮克/細胞/天(p/c/d)表示的細胞產(chǎn)量。這兩次運行的平均值為24.4p/c/d。一次運行的最大產(chǎn)量達到了約1.8g/L，而另一次運行達到了 1.7g/L。
[0018]定義
[0019]為了有利于 理解本發(fā)明，下文將定義多個術(shù)語。[0020]如本文所用，術(shù)語“核心蛋白聚糖”是指具有與SEQ ID NO:4具有至少80%同一性的成熟蛋白質(zhì)序列的蛋白質(zhì)分子。
[0021 ] 如本文所用，術(shù)語“核心蛋白聚糖核心蛋白”是指在成熟核心蛋白聚糖的第4位具有突變并且在第4位氨基酸基本上不含糖胺聚糖(GAG;即非糖胺聚糖化)修飾的核心蛋白聚糖蛋白分子。
[0022]如本文所用，術(shù)語“宿主細胞”是指任何真核細胞(例如，哺乳動物細胞、禽類細胞、兩棲動物細胞、植物細胞、魚類細胞和昆蟲細胞)，而不論是位于體外還是體內(nèi)。
[0023]如本文所用，術(shù)語“細胞培養(yǎng)”是指細胞的任何體外培養(yǎng)。此術(shù)語包括傳代細胞系(例如，具有永生化表型)、原代細胞培養(yǎng)、有限細胞系(例如，非轉(zhuǎn)化細胞)以及任何其他體外維持的細胞群，包括卵母細胞和胚胎。
[0024]如本文所用，術(shù)語“載體”是指當與合適的控制元件相關(guān)時能夠復制并且可在細胞之間轉(zhuǎn)移基因序列的任何遺傳元件，諸如質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、粘粒、染色體、病毒、病毒粒子等。因此，該術(shù)語包括克隆和表達運載體以及病毒載體。
[0025]如本文所用，術(shù)語“互補的”或“互補性”用于指代通過堿基配對原則相關(guān)的多核苷酸(即，核苷酸的序列)。例如，序列"5' -A-G-T-3"'與序列"3' -T-C-A-5"'互補?；パa性可以是“部分的”，其中只有一些核酸的堿基根據(jù)堿基配對原則匹配?；蛘?，也可在核酸之間存在“完全”或“總”互補性。核酸鏈之間的互補性程度對于核酸鏈之間的雜交效率和強度具有顯著的影響。這在擴增反應(yīng)以及依賴核酸之間的結(jié)合的檢測方法中具有尤其重要的意義。 [0026]術(shù)語“同源性”和“百分比同一性”當相對于核酸使用時是指互補性程度?？梢源嬖诓糠滞葱?即，部分同一性)或完全同源性(即，完全同一性)。部分互補的序列是至少部分地抑制完全互補的序列與靶核酸序列雜交的序列，并指使用功能術(shù)語“基本上同源的”。完全互補序列與祀序列的雜交抑制可通過在低嚴格性條件下使用雜交測定(Southern或Northern印跡、液相雜交等)進行研究。基本上同源的序列或探針(即，能夠與另一所關(guān)注的寡核苷酸雜交的寡核苷酸)將在低嚴格性條件下競爭并抑制完全同源的序列與靶序列的結(jié)合(即，雜交)。這并非是說，低嚴格性條件使得允許非特異性結(jié)合；低嚴格性條件要求兩種序列彼此之間的結(jié)合為特異性(即，選擇性)的相互作用。非特異性結(jié)合的不存在可通過使用甚至沒有部分互補程度(例如，低于約30%的同一性)的第二靶標進行測試；在不存在非特異性結(jié)合的情況下，探針將不與第二非互補靶標雜交。
[0027]如本文所用的術(shù)語“可操作的組合”、“可操作的順序”和“可操作地連接”是指核酸序列的連接方式使得產(chǎn)生能夠指導給定基因的轉(zhuǎn)錄和/或所需蛋白質(zhì)分子的合成的核酸分子。該術(shù)語還指氨基酸序列的連接方式使得產(chǎn)生功能性蛋白。
[0028]如本文所用，術(shù)語“信號序列”是指當可操作地連接到重組DNA序列時編碼能夠?qū)е轮亟M多肽分泌的信號序列的任何DNA序列。一般來講，信號肽包含一系列約15至30個疏水性氨基酸殘基(參見例如，Zwizinski 等，J.Biol.Chem.255 (16) =7973-77 [1980]，Gray等，Gene39(2):247-54[1985]和 Martial 等，Science205:602-607 [1979])。此類分泌信號序列優(yōu)選地衍生自編碼以下多肽的基因:該多肽從靶向組織特異性表達的細胞類型分泌(例如，在乳腺分泌性細胞中表達和分泌的分泌乳蛋白)。然而，分泌性DNA序列不限于此類序列。也可以使用來自從許多細胞類型和生物分泌的蛋白質(zhì)的分泌性DNA序列(例如，t-PA、血清白蛋白、乳鐵蛋白和生長激素的分泌信號，以及編碼諸如得自酵母、絲狀真菌和細菌的分泌多肽的微生物基因中的分泌信號)。
[0029]如本文所用，術(shù)語“純化的”是指從其正常環(huán)境中移除、分離或分開的核酸或氨基酸序列分子。“分離的核酸序列”因而是純化的核酸序列?！盎旧霞兓摹狈肿又辽?0%不含、優(yōu)選地至少75%不含并且更優(yōu)選地至少90%不含與其通常相關(guān)的其他組分。
[0030]發(fā)明詳述
[0031]本發(fā)明涉及改進的核心蛋白聚糖組合物及其產(chǎn)生方法，以及涉及核心蛋白聚糖用于治療患者的用途。
[0032]核心蛋白聚糖
[0033]天然核心蛋白聚糖是具有附接的糖胺聚糖和90_140kD的平均分子量的糖蛋白。本發(fā)明設(shè)想產(chǎn)生重組的核心蛋白聚糖。在一些優(yōu)選的實施方案中，核心蛋白聚糖是核心蛋白聚糖核心蛋白，即，基本上非糖胺聚糖化的核心蛋白聚糖。在一些實施方案中，核心蛋白聚糖核心蛋白在成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白分子的第4位氨基酸(即，從N端起的第4位氨基酸)包含突變。在一些實施方案中，突變?yōu)榻z氨酸到丙氨酸突變。在一些實施方案中，核心蛋白聚糖核心蛋白與SEQ ID NO:1(成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白)具有至少90%、95%、99%或100%同一性，前提是核心蛋白聚糖核心蛋白在成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白分子的第4位氨基酸(即，從N端起的第4位氨基酸)包含突變。
[0034]核心蛋白聚糖通常表達為前蛋白。本發(fā)明提供核心蛋白聚糖融合分子，其包含與核心蛋白聚糖前肽和成熟的肽序列可操作相關(guān)的異源信號序列。在一些實施方案中，異源信號多肽為α-乳白蛋白信號多肽。在一些實施方案中，α-乳白蛋白信號多肽為牛α-乳白蛋白信號多肽。在一些實施方案中，異源信號多肽與SEQ ID NO:2具有至少80^^90%或100%同一性。在一些實施方案中，前肽序列與SEQ ID N0:3具有至少80%、90%或100%同一性。在一些實施方案中，融合多肽的核心蛋白聚糖核心蛋白部分與SEQ ID N0:1(成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白)具有至少90%、95%、99%或100%同一性，前提是核心蛋白聚糖核心蛋白在成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白分子的第4位氨基酸(即，從N端起的第4位氨基酸)包含突變。在一些實施方案中，融合蛋白與SEQ ID NO:4(信號前肽核心蛋白聚糖核心蛋白)具有至少80%、90%、95%、99%或100%同一性，前提是核心蛋白聚糖核心蛋白在成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白分子的第4位氨基酸(即，從N端起的第4位氨基酸)包含突變。
[0035]本發(fā)明還提供編碼融合蛋白的核酸序列，以及包含核酸序列的載體。在一些實施方案中，異源信號多肽與SEQ ID N0:5具有至少80%、90%或100%同一性。在一些實施方案中，前肽序列與SEQ ID N0:6具有至少80%、90%或100%同一性。在一些實施方案中，融合多肽的核心蛋白聚糖核心蛋白部分與SEQ ID NO:7(成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白)具有至少90%、95%、99%或100%同一性，前提是核心蛋白聚糖核心蛋白在成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白分子的第4位氨基酸(即，從N端起的第4位氨基酸)包含突變。在一些實施方案中，融合蛋白與SEQ ID NO:8(信號前肽核心蛋白聚糖核心蛋白)具有至少80%、90%、95%、99%或100%同一性，前提是核心蛋白聚糖核心蛋白在成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白分子的第4位氨基酸(即，從N端起的第4位氨基酸)包含突變。[0036]
【權(quán)利要求】
1.一種產(chǎn)生非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白的方法，包括: 提供表達非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白的宿主細胞； 培養(yǎng)所述宿主細胞使得產(chǎn)生所述非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白；以及 純化所述非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白分泌到用于培養(yǎng)所述宿主細胞的培養(yǎng)基中。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述純化包括將所述培養(yǎng)基與離子交換介質(zhì)接觸。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述純化包括將所述培養(yǎng)基與羥基磷灰石介質(zhì)接觸。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述純化包括將所述培養(yǎng)基與至少一種離子交換介質(zhì)和至少一種羥基磷灰石介質(zhì)按任何順序接觸。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述純化包括: 將所述培養(yǎng)基與陽離子交換介質(zhì)接觸； 洗滌所述陽離子交換介質(zhì)； 從所述陽離子交換介質(zhì)中洗脫第一含核心蛋白聚糖的洗出液； 將所述第一含核心蛋白聚糖的洗出液與羥基磷灰石介質(zhì)接觸； 洗滌所述羥基磷灰石介質(zhì)； 從所述羥基磷灰石介質(zhì)中洗脫第二含核心蛋白聚糖的洗出液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述陽離子交換介質(zhì)為SP-瓊脂糖FF。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述羥基磷灰石介質(zhì)為陶瓷羥基磷灰石I型。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，還包括用離子交換膜或柱進一步純化所述第二含核心蛋白聚糖的洗出液。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述離子交換膜為Q離子交換膜。
11.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，還包括病毒滅活步驟。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述病毒滅活步驟包括用表面活性劑處理。
13.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述表面活性劑為TritonX-100。
14.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，還包括病毒過濾步驟。
15.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，還包括濃縮所述核心蛋白聚糖。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白通過所述宿主細胞以約大于1、5或IOpg/細胞/天的速率產(chǎn)生。
17.一種從含核心蛋白聚糖的培養(yǎng)基中純化核心蛋白聚糖的方法，包括: 將所述含核心蛋白聚糖的培養(yǎng)基與陽離子交換介質(zhì)接觸； 洗滌所述陽離子交換介質(zhì)； 從所述陽離子交換介質(zhì)中洗脫第一含核心蛋白聚糖的洗出液； 將所述第一含核心蛋白聚糖的洗出液與羥基磷灰石介質(zhì)接觸； 洗滌所述羥基磷灰石介質(zhì)； 從所述羥基磷灰石介質(zhì)中洗脫第二含核心蛋白聚糖的洗出液；用離子交換膜過濾所述第二含核心蛋白聚糖的洗出液以提供含核心蛋白聚糖的濾液； 處理所述濾液以除去病毒； 從所述濾液中濃縮核心蛋白聚糖。
18.—種包含純化的核心蛋白聚糖核心蛋白的組合物，所述核心蛋白聚糖核心蛋白在成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白的第4位包含突變，使得所述核心蛋白聚糖蛋白基本上非糖胺聚糖化，所述組合物在所述組合物中包含少于約IOOng殘余宿主細胞蛋白/mg核心蛋白聚糖核心蛋白和少于約20pg殘余宿主細胞DNA/mg核心蛋白聚糖核心蛋白。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的組合物，所述組合物在所述組合物中包含少于約5ng殘余宿主細胞蛋白/mg核心蛋白聚糖核心蛋白和少于約5pg殘余宿主細胞DNA/mg核心蛋白聚糖核心蛋白。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的組合物，其中將所述核心蛋白聚糖配制成水溶液。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的組合物，其中所述水溶液包含pH為約6.5至約7.5的磷酸鹽緩沖溶液。
22.一種融合蛋白，其包含可操作地連接到編碼核心蛋白聚糖的序列的異源信號肽。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的融合蛋白，其中所述信號序列為α-乳白蛋白信號序列。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的融合蛋白，其中所述α乳白蛋白序列為牛α-乳白蛋白信號序列。
25.根據(jù)權(quán)利要求22所述的融合蛋白，其中所述編碼核心蛋白聚糖的序列編碼核心蛋白聚糖核心蛋白。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的融合蛋白，其中所述核心蛋白聚糖核心蛋白在成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白的第4位包含突變。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的融合蛋白，其中所述突變?yōu)榻z氨酸到丙氨酸突變。
28.根據(jù)權(quán)利要求25所述的融合蛋白，其中所述核心蛋白聚糖核心蛋白在成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白的第4位不含糖胺聚糖分子的實質(zhì)性修飾。
29.—種編碼根據(jù)權(quán)利要求22所述的融合蛋白的載體。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的載體，其中所述載體包含編碼α-乳白蛋白信號序列的核酸序列，所述α -乳白蛋白信號序列可操作地連接到編碼核心蛋白聚糖核心蛋白的序列。
31.一種包含根據(jù)權(quán)利要求29所述的載體的宿主細胞。
【文檔編號】C07K14/47GK103917655SQ201280013702
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2012年3月13日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月14日
【發(fā)明者】G·T·布萊克, I·J·科林斯, M·J·弗賴 申請人:康泰倫特藥物解決方案有限責任公司